Бессывороточная питательная среда для культуры ткани

 

Использование: биохимия, культура ткани . Сущность изобретения: для реализации изобретения в не содержащую сыворотки среду культуры ткани вводится Аргинил-А- 0-инсулин. побочный продукт биотехнологического синтеза человеческого инсулина из человеческого проинсулина для стимуляции роста клеток млекопитающих животных , которые положительно реагируют на инсулин в культуре ткани. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з С 12 N 5/00

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

K ПАТЕНТУ

00 (А)

О О

00 ,Ю ! (21} 4743208/13 (22) 26,02.90 (31) 315887 (32) 27.02.89 (33) US (46) 23.07.93. Бюл. М 27 (71) Эли Лилли Энд Компани (US) (72) Вальтер Фрэнсис Проути (US) (56) Waymouth. Нав, Chapple, edd.Cambridge University 1981, Barnes, Sirbasku, Sata, edd,AR.LissËnñ., 1986.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к области культуры ткани.

Настоящее изобретение охватывает способ выращивания клеток млекопитающих животных в не содержащей сыворотки среде культуры ткани, в котором клетки способны к росту в культуре ткани и имеют положительную реакцию на присутствие инсулина в среде культуры тканй, где среда культуры ткани содержит примерно от 0.1 до

10000 нанограммов аргинил-А-О-инсулина на миллилитр.

Настоящее изобретение охватывает также не содержащую сыворотки среду для разведения пригодную для роста клеток млекопитающих в культуре ткани, которая содержит примерно от 0.1 до 10000 нанограммов аргинил-А-0-инсулина на миллилитр, Отличительной особенностью данного изобретения является использование аргинил-А-О-инсулина (ААО-инсулина) как агента улучшения роста клеток млекопитающих

„„,« Ц „„1830080 А3 (54) БЕССЫВОРОТОЧНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ

СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТУРЫ ТКАНИ (57) Использование: биохимия, культура ткани. Сущность изобретения; для реализации изобретения в не содержащую сыворотки среду культуры ткани вводится Аргинил-АО-инсулин, побочный продукт биотехнологического синтеза человеческого инсулина иэ человеческого проинсулина для стимуляции роста клеток млекопитающих животных, которые положительно реагируют на инсулин в культуре ткани. 1 табл, в среде культуры ткани. ААО-инсулин является побочным продуктом процесса получения человеческого инсулина (Hl) из человеческого проинсулина. Данный процесс опубликован в имеющейся литературе более подробно, и в качестве исходного продукта используется человеческий проинсулин, ковалентно связанный с расщепляемой главной последовательностью, которая синтезируется посредством микроорганизмов, генетически модифицированных для данной цели. Проинсулин расщепляется трипсином и . «врбоксипептидазой В. предпочтительно в присутствии металлических ионов.

Как уже сейчас хорошо известно, человеческий инсулин состоит из ЗО-аминокислотной цепи S, связанной с (Д

21-аминокислотиой цепью А посредством дисульфидных мостиков, которые связывают цистеины в положении А-7 и В-7. и цистеины в положении А-20 и В-19.

Человеческий проинсулин является белком, содержащим 86 аминокислот, в котором

1830080 глицин в положении А-1 человеческого инсулина(Н1) связан стреонином B положении

В-30 посредством внутреннего связывающего пептида, 35-аминокислотной цепи.

Этот связывающий пептид удаляется путем расщепления в процессе, в ходе которого человеческий проинсулин превращается в

Н!.

Этот процесс расщепления безусловно не является идеально эффективным, и в результате неполного расщепления образуются некоторые побочные продукты. Одним таким побочным продуктом является аргинил-А-О-инсулин, который отличается от Hl тем, что имеет одну нижнюю аргинильную группу, присоединенную в положении А-1 к концевой аминогруппе, человеческого инсулина, Этот побочный продукт может быть отделен от Hl путем катинообменной хроматографии, как показано ниже s Приготовлении препарата 1, Интересен тот факт, что

ААО-инсулин является менее эффективным, чем HI в отношении эффектов снижения глюкозы в крови B условиях "ин виво" у кроликов, При проведении испытания на кроликах опредеЛено, что ААО-инсулин проявляется 75 эффективности, моль на моль. от самого Hl. Однако, ААО-инсулин имеет, по меньшей мере, такую же эффективность, как и инсулин в стимулировании роста клеток в культуре ткани, При первых работах биологов и биохимиков по выращиванию клеток млекопитающих в культуре ткани было принято выращивать их в среде культуры ткани, содержащей кислотную сыворотку в пределах концентрации от 5 до

10 . Сыворотка служила в качестве ценного питательного сырья для клеток, и многие очень важные эксперименты проводились в таких культурах. Однако желание в более точных экспериментах привело к выращиванию клеток культуры ткани в специфической среде. в которой все составляющие компоненты очищены и имеют точные характерные для них химические названия. Одним из таких веществ, которое может или должно вводиться в специфическую среду для желаемого роста многих клеток, является инсулин.

Так например, в литературе описаны следующие типы клеток, как положительно реагирующих на ввод инсулина в среду культуры ткани. ф

Карцинома гипофиза крысы

Человеческая цервикальная карцинома

Карцинома собачьей почки

Крысиная нейробластома

Мышиная меланома

Крысиная глиома

Карцинома человеческой молочной железы

Яичник крысы

Эмбриональная мышиная карцинома

Мышиные семенники

Карцинома человеческой толстой кишки

Мышиные эмбрионы Balb/c

Крысиный миобласт

Эпидермоидная карцинома

"0 человеческого легкого

Почка хомяка

Человеческий фибробласт

Человеческая эпидермоидная карцинома

Крысиная щитовидная железа

Мышиный эмбрион

Мышиная лимфома

Овечий адиноцит

Инсулин является общим необходимым или желательным фактором в среде для выращивания клеток млекопитающих, Использование настоящего изобретения желательно в культурах всех клеток млекопитающих. которые стимулируются инсулином в среде разведения культуры, Так, природа или источник клеток, которые должны использоваться, не является ограничивающим фактором при осуществлении данного изобретения. Среда культуры ткани также не является ограничивающим фактором. Ранее уже была тщательно изучена не содержащая сыворотки среда культуры ткани, и в литературе были опубликованы данные работы на 30 лет или более. Для информации можно привести нижеследующие источники, которые приводятся здесь как ссылочный материал, Обычно не содержащая сыворотки питательная среда выращивания клеток млекопитающих приготавливается из многочисленных ингредиентов, включающих основные аминокислоты, такие как ар- . гинин, цистеин, гистидин, метионин и другие; неосновные аминокислоты, такие

45 как аланин, аспарагин, глицин, и другие; и аминокислотные производные. такие как глютатион, оксипролин. путросцин и другие. Обычно они содержат такие витамины, такие как фолиевая кислота, биотин. никоти50 намид, пантотеновая кислота, пиридоксин, рибофлавин и витамин В12, Часто используются углеводы, такие как глюкоза и пируват, а также производные нуклеиновой кислоты, такие как аденин, гипоксантин и тимидин.

55 Такая питательная среда выращивания содержит источник липидов, например холин и и-инозитол, и неорганические ионы, включая ионы кальция, магния, натрия, фосфата и другие. Часто она включает неорганические элементы в следовых количествах, на1830080

20

55 пример кобальт, железо, селен, цинк. Часто питательная среда выращивания приготав.ливается в форме буферного раствора для поддержания желаемого значения рН, часто с использованием бикарбонатного иона или газообразной двуокиси углерода. Как разъяснялось выше, ААО-инсулин является побочным продуктом процесса получения

Hl иэ человеческого проинсулина, и согласно этому он легко получается для использования в настоящем изобретении путем простого извлечения из продукта загрязненного Н1.

Нижеследующий раздел "Приготовление препарата 1" иллюстрирует процедуру хроматографического разделения, используемую для этого извлечения, и этап кристаллизации с целью очистки

ААО-инсулина.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТА 1

ХРОМАТОГРАФИЯ

Смесь, содержащая ААО-инсулин и Н), растворяется в 32 мл буферного раствора, с концентрацией 7 моль мочевины. 0,05 моль ацетата натрия и 0,1 моль хлорида натрия, величина рН 3,8. Хроматографическая колонка размерами 1х15 см наполняется сульфопропиловой ТРИЗАКРИЛ смолой, изготавливаемой фирмой "Reactib IBF", отделением Rhone-Poulenc с размером частиц

40-80 мкм. Раствор ААО-инсулина вводится в колонку и элюируется градиентным буфером (в количестве, составляющим 9-кратный объем колонки) того же состава. что описан выше, с той разницей, что концентрация хлорида натрия в нем увеличена до 0,2 моль.

Скорость прохождения в колонке составляет 1 мл/мин, Поток продукта, выходящего из колонки, контролируется по спектру поглощения при 280 нм. Инсулин выходит из колонки первым, он практически весь элюируется в первых 70 мл после начала градиентного элюирования. Затем выходит

ААО-инсулин, который собирается в выходящей фракции 72 — 105 мл для получения фракции, обогащенной ААО-инсулином с очень небольшой примесью Hl.

КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ

Величину рН раствора ААО-инсулинового продукта в количестве 840 мл (с содержанием 2,32 r ААО-инсулина) доводят до 8,0 посредством 10 -ного гидрата окиси натрия. Раствор концентрируется до объема

260 мл при 4 С с использованием отсасывающей мембраны молекулярной массой

3000. Концентрированный раствор затем диафильтруется с использованием 280 мл деиониэированной воды. Раствор раэбавляется до концентрации 2 r белка на 1 л. 8 него добавляют 16,2 мл ледяной уксусной кислоты и 850 мл деионизированной воды, так чтобы концентрация уксусной кислоты данного раствора составляет 0,25 моль. Затем он нагревается до 23 С, в него вводится

0,93 мл 20=,ь-ного водного раствора хлорида цинка. Величина рН доводится до 6,0 посредством концентрированного раствора гидрата окиси аммония. Смесь перемешивается в течение 4 ч при 23 С. Затем она охлаждается до 4 С, а смесь инкубируется при указанной температуре в течение 16 ч без перемешивания. Затем поверхностный слой декантируется, а оставшийся густой кристаллический шлам центрифугируется.

Кристаллы промываются двукратно очищенной водой, затем двукратно абсолютным этанолам, используемым в количестве

23 мл на каждую промывку. Кристаллы высушиваются в вакууме при комнатной температуре, и в результате получается 2,11 г практически чистого ААО-инсулина, Пример. Используется ААО-инсулин для роста клеток яичника Китайского хомяка в не содержащей сыворотки среде, которая.

КаК было показано, эффективна для роста таких клеток. Эта среда состоит из трех частей модифицированной Dulbecco среди

Eagle (ДМЕ) и одной части (по obbeMv) соеды

Г12, с введенными в нее селеном (10 моль) этаноламином (50 мкмоль), оксиэтилпиперазинзтансульфокислотой (20 ммоль) и человеческим трансферрином (1 мкг/мл).

Количества ААО-инсулина, которые указаны внижеследующей таблице,,вводятся в различных пропорциях от количества среды.

Кле ки выращиваются в 12-ячеистых чашках

Конинга, которые предварительно обрабатываются ламинином. белком, который способствует прилипанию клеток и распределению их в ячейках разведения культуры. Эксперимент для каждого условия осуществляется двукратно. Каждая ячейка с питательной средой разведения инокулируется 25000 клетками на 0-й день эксперимента, и подсчет осуществляется на

6-ой день с помощью счетчика Колтера. В данных экспериментах используются четыре различных партии ААО-инсулина. Концентрации ААО-инсулина, вводимого в питательную среду разведения в виде раствора в 0,1 н. соляной кислоте, выражаются в нанограммах на миллилитр во всех случаях, В контрольных экспериментах без ввода инсулина или ААО-инсулина в среду разведения, число клеток составляет от 10000 до

200000 на ячейку. Те же кле ки в той же среде, содержащей Hl или коровий инсулин вместо ААО-инсулина, растут так же, как и в описанных здесь экспериментах.

1830080

Составитель И, Тарасова

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Г, Кос

Редактор

Заказ 2490 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент". г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Приведенные выше экспериментальные данные показывают эффективность

ААО-инсулина в стимулировании роста клеток, которые реагируют на инсулин в культуре ткани, Среднее число клеток на ячейку в 5 этих испытаниях увеличивается от 240000 до 610000 в зависимости от.концентрации

ААО-инсулина:

Формула изобретения

Бессывороточная питательная среда для культуры ткани, содержащая основную среду и стимулятор роста клеток, о т л и ч аю щ а я с я тем. что в качестве стимулятора роста она содержит аргинил А-О инсулин в концентрации 0,25 — 100 нг на 1 мл.