Способ выявления вируса человеческого иммунодефицита у животного и человека

 

Использование: вирусология. Сущнос-ть изобретения: описаны направляемые HIV ингибиторы природной 2 -5 А противовирусной защитной системы, диагностические методики и вспомогательные средства для лечения вирусных нарушений. Выделены и идентифицированы индуцируемые HIV ингибиторы РНазы L больных с синдромом заболевания лимфатических узлов, родственным СПИДу комплексом и синдромом приобретенного иммунодефицита . У таких пациентов функциональные 2-5А не способны активировать РНазу L в моноядерных клетках периферийной крови, эндогенная дзРНК, эндогенная дзРНК, в особенности неспаренная дзРНК, активирует 2-5А-синтетазу, что приводит к увеличению концентрации эндогенных 2-5А.4 ил. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОС ДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГО ПАТЕНТ СССР)

О ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АТЕНТУ (51)5 А 61 К 39/12 и н и (21),4356721/13 (6214355467/13 (22) 26.10,88 (23 03.03,88 (46) 23.08.93, Бюл. ¹ 31 (31) 136978 (32) 27.12.87 (33) US (71) Хем Рисерч Инк, (US) (72) Вилльям А.Картер (US) (56) Опыты испытания антител к HTLV — III, сов еменные данные по отбору, лабораторно у и эпидемическому коррелированию, 198; Budnavsky, Nature, v. 316, р.96, 1985. (54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСАЧЕЛОВЕ ЕСКОГО ИММУНОДЕФИЦИТА У ЖИВО НОГО И ЧЕЛОВЕКА (57 Использование: вирусология. Сущность изобретения; описаны направляе1 СПИД (синдром приобретенного иммунодея1ицита) представляет побои одну ив основных угроз здоровью людей в двадцатом столетии. Вследствие его изменчивой биологической природы, коварных способов распростран ения от индивидума к индивидуму, иск ытого" периода развития болезни, что дела затруднительным само ее обнаружение, СП Д, несомненно, состоит в ряду эпидемиолог ческих проблем, требующих беспрецедентн ix усилий. В самом деле, даже при зн чительных затратах, вложенных на увеличе ие надежности диагностики СПИДа, созд нные к настоящему времени методики все еще в недостаточной степени отвечает необходимым требованиям четкого контроля этой проблемы для любой группы населения.. Ж,», 1836101 А3 мые HIV ингибиторы природной 2 — 5 А противовирусной защитной системы, диагностические методики и вспомогательные средства для лечения вирусных нарушений.

Выделены и идентифицированы индуцируемые HIV ингибиторы РНазы L больных с синдромом заболевания лимфатических узлов, родственным СПИДУ комплексом и синдромом приобретенного иммунодефицита. У таких пациентов функциональные 2 — 5А не способны активировать РНазу L в моноядерных клетках периферийной крови, эндогенная дзРНК, эндогенная дзРНК, в особенности неспаренная дзРНК, активирует 2 — 5А-синтетазу, что приводит к увеличению концентрации эндогенных

2 — 5А, 4 ил. 1 табл, Существуют различные обозначения вируса иммунодефицита человека (HIV), вирус IQQ

СПИДа, выделенный в Пастеровском Инс- () титуте (Париж, Франция) обозначают как О

LAV в то время как вирус, выделенный в

Национальном Институте здоровья (Бефезда шт,Мэриленд, США), обозначают как

HTLV III. В настоящем тексте вирус НИ частот будет называться в его общем значении или же будет обозначаться как HTLV — III, LAV или HIV, но без намерения провести различия между ними, Более того, термин

"HIV" в настоящем описании включает всякие любые другие вирусы, которые могут быть связаны со СПИДом, вне зависимости от того выделены ли они или еще нет, Имеется в виду, что HIV в единственном числе

1836101 включает любой тип НИ, независимо от его геномного содержания. Аналогично, характерные для СПИДа симптомы в общем виде будут называться, как включающие симптомы, вызываемые НИ (согласно вышеприведенному определению), симптомы РСК (родственный СПИДУ комплекс), симптомы синдрома заболевания лимфатических узлов (СЗЛ) и симптомы, вызываемые другими вирусами, с по существу аналогичной клинической картиной.

СПИД следует за прогрессирующими нарушениями иммунной системы, вызванные инфекцией вирусом иммунодефицита человека (НИ). На ранних стадиях болезни ответственные за иммунность клетки становятся дефектными вследствие потери Т-клеток (происходящих из тимуса клеток), экспрессирующих так называемой Т4-антиген, т,е. той части Т-клеток, которая в основном состоит из фага-помощника и индуктора, Дефицит Т4 в клетках может привести к определенным видам дефицита в передающейся с помощью клеток иммунности, втом числе; дефицита ЕУ(естественных клеток-убийц) АЛУ (активирован ных лимфокином клеток-убийц) и цитолитичных Т-клеток.

СПИД, видимо, является прогрессирующей болезнью, хотя время перехода из одной фазы в другую может меняться, Для фаз развития СПИДа существует классификация, Существуют асимптоматические индивидумы, зараженные HIV (сероположительные), о чем судят по циркуляции антител к вирусу. Если у них отсутствуют другие маркеры, их относят к больным на BPI-стадии согласно классификации Вальтера Рида Их также называют предРСК/РСК вЂ” родственный СПИДУ комплекс, хотя некоторые такие больные могут так никогда и не показать характерных для

РСК симптомов. У некоторых таких больных может развиться болезнь лимфатических узлов (ВР2) и появиться дефицит Т4-клеток (ВРЗ). Затем происходит снижение способности лимфоцитов претерпевать стимулируемую антигеном п ролиферацию и стимулируемой антигеном способности образовывать гамма-интерферон, и пациенты на такой ВР4-стадии начинают терять замедленную кожную гиперчувствительность.

Больные на ВР5-стадии обычно становятся вялыми. Они подвержены заражению опоясывающим лишаем, афтозному стоматиту (молочнице) или имеют симптомы РСК, которые включают; продолжительные ознобы, потение по ночам, слабость, понос и/или потерю веса, Этот период РСК обычно также характеризуется прогрессирующим сни5

55 жением иммунности, Наконец, больные на

ВР6-стадии подвержены любым инфекциям, т.е, речь идет о СПИДе в "полном расцвете", когда 50 больных умирает в течение 12 месяцев.

Описан направляемый НИ ингибитор(ы) естественного 2 — 5 А противовирусного защитного процесса. Сделанные открытия относятся к новым диагностическим и/или лечебным способам, направленным на разнообразные вирусные нарушения (напр.: лишаи, инфекции ретровирусами и т.д.) и/или потенциально также на раковые заболевания, Индуцируемая интерфероном система

2 — 5А(2 — 5 -алигоадениляты) синтетаза-РНаза L является частью защитного механизма организма против вирусных инфекций. Отдельные элементы такой системы включают: (1) зависимую от дзРНК 2 — 5А-синтетазу, (II) эндогенные 2 — 5А и (III) зависимую от 2 — 5А эндорибонуклеазу (РНазу L). Дефект в любом из перечисленных элементов системы

2 — 5А-синтетаза-РНаза L неизбежно приведет к полному или частичному упразднению противовирусного действия системы.

В сыворотке или моноядерных клетках периферийной крови (МКПК) людей с некоторыми вирусными инфекциями или подвергавшихся лечению интерфероном обнаружена повышенния концентрация 2—

5А-синтетазы. Индуцирование 2 — 5А-синтетазы в МКПК, таким образом, видимо, может иметь потенциальное, хотя и ограниченное значение для диагностики. Более того, повышенная концентрация 2 — 5А-синтетазы в

МКПК указывает на запущенное состояние болезни при некоторых вирусных нарушениях, но и напротив является признаком эффективного лечения интерфероном других вирусных инфекций. Интерферон был найден в сыворотке больных СПИДом, и тем не менее, устойчивое повышение уровня 2—

5А-синтетазы показано для больных на стадии перехода от РСК к СПИДУ, Такие громадные лабораторно-клинические несоответствия могут быть объяснены, если считать нефункцинальными другие элементы системы 2 — 5А-синтетаза-РНаза L. Для того, чтобы исследовать такую возможность, необходима характеристика синтетазы 2 — 5А In

vivo и действия РНазы L, о чем подробно говорится ниже, Фиг.1 представляет собой фотографию результатов электрофореза на пластинке с полиакриламидным гелем, показывающими активацию РНазы L по действиям 2 — 5А, экстрагированных МКПК людей, страдающих

СЗЛ, РСК и СПИДом, что, установлено в

1836101 ! испытании на расщепление рибосомной В экстрактах моноядерных клеток периферийной крови (МКПК) людей с синдромом

Фиг,2 представляет собой фотографию заболевания, лимфатических узлов (СЗЛ), результатов электрофореза на пластинке с родственным СПИДУ комплексом (РСК) и р д ем, показывающих 5 синдромом приобретенного иммунодефиполиакриламидным гелем и активацию уровня РНазы L в экстрактах цита (СПИД) замерены компоненты систеКПК, что установлено в испытании по рас- мы 2 — 5А-синтетаза-РНаза L. Как показано, еплению рибосомной РНК. уровень 2 — 5А-синтетазы в высшей степени

Фиг.3 представляет собой фотографию завышен у больных СПИДом и находится на езультатов электрофореза на пластинке с 10 базальном уровне у больных РСКом или олиакриламидным гелем, показывающих СЗЛом, Однако вне зависимости от колебаосстановление активности по расщепле- ний колнцентра ий 2 — 5А- инт (2 — 5А) высокие эндогенные концентрации 2 — 5А(до

Фиг.4 является диаграммой, иллюстри- 35 нм) обнаружены у больных СЗЛом, ующей систему 2 — 5 -олигаденилят — РНа- 15 РСКом и СПИДом, Экстракты 2 — 5А на деле

a L. оказались функциональными, о чем свидеОткрыто ингиби ю е ру ще вещество, вы- тельствуют испытания на связывание, раселяющееся или понуждаемое к выделе- щепление рибосомной РНК и испытание с ию, клетками, инфицированными ядро-целлюлозой. Несмотря на повышенирусами иммунодефицита человека. Этот 20 ные концентрации эндогенной функционгибитор, видимо,физическисвязансфер- нальной 2 — 5А, ни для одного из больных ентом РНазой L — конечным продуктом в СЗЛом, РСКом или СПИДом не могла быть системе — 5 -олигоаденилят-РНазы L и показана активированная РНаза L, Однако риводит к выходу из строя всей иммунной увсехздоровыхлюдей РНаза вМКПКбыла с стемы, что позволяет вирусам бесконт- 25 активирована, даже несмотря на то, что конр льно мультиплицироваться. Описаны ме- центрации эндогенной 2 — 5А составляли мет дики идентификации таких ингибиторов нее 5 нМ. Опыты со смешиванием л о непосредственно, либо косвенно по свидетельствуют о присутствии ингибитора о сутствию РНазы или неактивности РНа- РНазы L у пяти больных СЗЛом, РСКом и з, ли о по присутствию промежуточных 30 СПИДом, Такой ингибитор может переноситься и может препятствовать индуцируеP аза L, при этом ингибитор(ы) служитмар- мому 2 — 5А специфичному для РНазы к ром для обнаружения присутствия HIV разрушению рРНКвэкстрактах клеток1929. и и родственных вирусов, дающих по суще- Один из таких ингибиторов РНазы L осажс ву аналогичную клиническую картину. 35 дается трихлоруксусной кислотой (ТХК) и

Также обсуждается прогнозирующее этанолом. Ингибирование действия РНазы р звития СПИДа в полном а з ачение такого маркера с точки зрения снимается об аботкой РН А

Да в полном расцвете у боль- теазой. Мои исследования предполагают, н х, в частности, больных, имеющих анти- что в МКПК больных СЗЛом, РСКом или те а к НИ в периферийной крови и тканях, 40 СПИДом эндогенная дзРНК активирует 2— в ом числе, крови, фракциях крови, клетках 5А-синтетазу, что приводит к увеличению трансплантированных органов и клеточных концентрации эндогенных 2 — 5А. Способноэк трактах, Описаны способы активации сти функциональных 2 — 5А активировать азы L или дезактивации ингибирующего РНазу L препятствует индуцируемой HIV

P азу L вещества. Частью настоящего изо- 45 ингибитор РНазы L в МКПК больных СЗЛом, бретения являются лечебные методы борь- РСКом и СПИДом. б со СПИДом и о ственнь

Д рд (ми вирусами и Хочу отметить здесь, что определение ти а ииРН ко троля развития таких вирусов путем ак- концентрации 2 — 5А ф ти ации азы Lè/èëèóäàëåíèÿилидезак- РНазы L в экстрактах МКПК использованити ации ингиби ю его PH ги ирующего. азу L вещества 50 ем специфических и чувствительных опре(веществ), или направленного на ингибито- делений показывает т, ч ры вируса. настоящее изобретение вклю- противовирусной системы 2 — 5А-синтетазаче ы способы получения антител к РНаза L в МКПК больных СЗЛом, РСКом и ук занным вирусам как in viva так и in vitro СПИДом заключается в присутствии ингис и пользованием в качестве антигена спе- 55 битора РНазы L но

ы но не в синтезе нефункциоци ичного ингибитора РНазы L или направ- нальны 2 — 5А, П х —, риводимые здесь данные ля мых ви сом инги ру нгибиторов подчеркивают, что кажущиеся парадоксальби химических промежуточных веществ в ными взаимодействия происходя ие в инящие в инфицированной вирусом клетке могут быть

1836101

55 теперь объяснены рациональными согласованными биохимическими понятиями, Связанную с акриловыми шариками (1 мг) РНазу А или связанную с карбоксиметилцеллюлозой (1 мг) (Sigma Chemical Со, вымачивают в NP40 лизисном буфере (16) (10 мкл) 2 ч при 30 С, после чего смешивают с экстрактом МКПК (100 мкг на испытание) до окончательного объема 15 мкл и дополнительно инкубируют 2 ч при 30 С, Во время повторного инкубирования содержимое пробирок осторожно несколько раз перемешивают. Контрольные образцы инкубируют без всякого добавления фермента, Иммобилизованные ферменты таблетируют центрифугированием (10000 х 0,5 мин, комнатная температура). Пять микролитров центрифугированных фракций добавляют к экстрактам клеток L929 (150 мкг белка на испытание) и проводят испытания по расщеплению рРНК для определения специфичной для РНазы L активности.

Выделенные из экстрактов МКПК эндогенные 2 — 5А далее характеризуют проведением испытаний по расщеплению рРНК, Образованные при расщеплении РНазой L продукты с выделенными из МКПК2 — 5Азначительно отличаются s экстрактах клеток

1929 от продуктов, полученных с аутентичными 2 — 5А (фиг,1, сравнить полосы 3, 5, 7 и

9 с полосой 10). Например, эндогенные 2—

5А, выделенные из МКПК, активирует РНазу

L из клеток L929 с расщеплением 2BS и 18S рРНК и образованием трех специфических продуктов расщепления (фиг,1, полоса 10).

Объяснение наблюдаемых различий в продуктах расщепления может заключаться в том, что эндогенные 2 — 5А, синтезируемые в

МКПК, отличаются от аутентичных 2 — 5А.

Для выявления уровня свободной (не—

2 — 5А-активированной) РНазы L, являющейся, как в настоящее время установлено, целевым ферментом для 2 — 5А, использовано испытание с радисвязыванием,Могут быть также использованы и другие целевые ферменты, которые равно уместны в моем открытии. В экстрактах МКПК больных

СЗЛом, РСКом и СПИДом уровень свободной РН азы L в 5 — 7 раз выше, чем у здоровых людей (табл.1, столбец 4). Однако испытание на радиосвязывание имеет ограниченное значение для образцов, в которых эндогенные 2 — 5А контактируют с (РзА4/ P/ðÑð за связывание с РНазой L. зг

Соответственно, результаты испытаний по радиосвязыванию точно не отражают уровень РНазы L, Таким образом, существенно определение уровня 2 — А — активированной

РНазы L, Для достижения этого мною использован новый чувствительный метод, описанный ниже, позволяющий определять активированную РНазу L в экстрактах

МКПК, выделенных всего лишь из одного миллилитра периферийной крови, и этот метод основан на специфичности расщепления 2 — 5А-активированной РНазы íà рРНК.

Вследствиетого, что рРНК присутствует в МКПК ниже уровня детектирования, экстракты клеток HL929 (субклон штамма клеток L929 с дефицитом РНазы L) используют в качестве источника рРНК, Клетки HL929 депозитированы в Американской Коллекции типовых культур (Роквиль, шт, Мэриленд, США) под регистрационным номером согласно Будапештскому Соглашению. Использованием этого испытания мне удалось показать, что РНаза L неактивна в экстрактах МКПК больных СЗЛом, РСКом и

СПИДом (фиг.2, полосы 2 — 6), где имеет место высокое внутриклеточное аккумулирование функциональных 2 — 5А. Экстракты

МКПК от всех здоровых людей, подвергшихся испытанию, показали присутствие активной РНазы L дающей специфичные продукты расщепления (фиг.2, полоса 7), несмотря на то, что 2 — 5А присутствует в концентрации <5 нМ (таблица, столбец 2), Мои наблюдения того, что в экстрактах

МКПК, инфицированных СЗЛом, РСКом и

СПИДом больных, присутствуют биологически активные 2 — 5А, подняли вопрос — почему же неактивна РНаза L, Для определения того, что является ли отсутствие активности

РНазы L(mo очевидно из фи .2, полосы 2 — 6) следствием нефункциональности РНазы L или следствием присутствия ингибитора активности РНазы L проведены следующие опыты со смешиванием. Экстракты клеток

L929, содержащие фукциональную РНазу, смешивают и совместно инкубируют с экстрактами МКПК больных СЗЛом, РСКом и

СПИДом. Специфичных продуктов расщепления для РНазы L не обнаруживается (фиг.1, полосы 3, 5 и 7), Важно подчеркнуть, что эндогенные 2—

5А, ответственные за активацию РНазы L (фиг.1, полосы 3, 5 и 7), дают по меньшей мере четырехкратное разбавление относительно клеточных экстрактов, из которых эти образцы происходят (фиг,1, полосы 2, 4 и 6). Эти данные указывают на присутствие нерастворимого в ТХК ингибитора (ингибиторов) РНазы 1 в МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом, Такой ингибитор не обнаружен у здоровых людей, поскольку их экстракты МКПК генерируют специфичные для РНазы L продукты расщепления после совместного инкубирования с экстрактами клеток L929 (фиг.1, полоса 9). Присутствие функциональных 2 — 5А и тот факт, что пред1836101

10 прлагаемый ингибитор РНазы L осаждается

ТСК и этанолом, наводит на мысль о том, что и гибитор РНазы L не является аналогом

2 5А, как недавно идентифицировалось в к еточных культурах, инфицированных 5

SV — I и ретровирусом.

Мои опыты с использованием разрушащих ферментов, иммобилизованных на т ердых носителях, дают совершенно новое и едставлениео природе ингибитора(инги- 10 б торов) РНазы L, найденных в экстрактах

КПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом.

Е ли экстракты МКПК больных СПИДом и едварительно инкубируют с иммобилизов нной протеазой или РНазой А и затем 15 с вместно инкубируют с экстрактами клет к L929, активность РНазы L восстанавлив ется, о чем свидетельствует появление с ецифичных продуктов расщепления (фиг,3, сравнить полосы 1 и 2 с полосой 3). 20

Мои настоящие исследования показыв ют, что дефект в противовирусной систем 2 — 5А-синтетаза-РНаза Le МКПКбольных

С Лом, РСКом и СПИДом может быть отнес н за счет ингибитора РНазы L, а не за счет 25 о сутствия функциональных 2 — 5А. Ингибит р РНазы L присутствует в экстрактах

М ПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом, чт указывает на возможность существован я ингибитора на всех стадиях развития 30 ти ичных ретровирусных заболеваний и что эт т ингибитор также имеет отношение к различным субострым (хроническим вирусн м) патогенным инфекциям. С учетом моего предыдущего сообщения о том, что во 35 вс х случаях МКПК больных СЗЛом, РСКом ил СПИДом, подвергшихся испытанию, соде жит PHK Н Ч(определено молекулярной ги ридизацией) и центры инфицирования

Hl ) определено совместным культивирова- 40 ни м лимфоцитов), вполне вероятно, что инги итор РНазы L индуцируется вирусом.

Открытия, о которых сообщается здесь, предполагает, что репликация вируса модифицирует систему 2 — 5А-синтетаза-РНаза L 45

i таким образом, что естественное противовиру ное состояние не может быть в полной ме эе экспрессировано или отрегулировано.

Впрлне вероятно, что белок-(и) и PHK-(ы), закодированный HIV или другим сосущест- 50 ву щим с ним ретровирусом, может ингибиро ать активацию PНазы L.

Пример. Моноядерные клетки перифе ийной крови(МКПК) выделяют на FicollHyitague, клетки L929 и HL929 (субклон 1929 55 с ефицитом РНазы L) получают в культуре с монослоем, цитоплазматические экстракты леток L929 и HL929 получают в глицерино ом буфере, экстракты МКПК получают в

NPP0 лизионом буфере, все это согласно известным методикам. Концентрация белка в экстрактах в интервале 1 — 15 мкг/мкл.

Активность 2 — 5А-синтетазы определяют в выделенных экстрактах МКПК (50 мкг на испытание) использованием поли (1) -поли(С) — агарозы. 2 — 5А выделяют из растворимых в ТХК фракций экстрактов МКПК после нейтрализации фреоном — три — н — октиламином. Экстрагированные ТХК 2 — 5А затем лиофилизуют и вновь растворяют в воде таким образом, что все образцы стандартизованы в обьеме воды до эквивалента в 5 мкг белка на мкл. Концентрации 2 — 5А, присутствующих в экстрактах МКПК, измеряют в испытании на радиосвязывание с экстрактами клеток L929 s качестве источника РНазы L.

Из 18900 dpm рзА4/ р/рСр (удельная активность 3000 Ci/ììoëü), Amersham добавленных на одно испытание, 9400 dpm связываются с РНазой в отсутствие 2 — 5А.

Примерно 9 — 14% рзА4/ р/рСр замещается в испытаниях, в которых добавляют 5 мкл выделенных образцов 2 — 5А. Концентрацию

2 — 5А в МКПК определяют сравнением с калибровочной кривой для аутентичных 2 — 5А. и это определение основано на подсчете концентрации цитоплазмического белка в

25 мкг/мл. Концентрацию 2 — 5А, выделенных из МКПК, также измеряют в испытании с ядро-целлюлозой с клетками L929 в качестве источника РНазы L. Активация РНазы

L в таком испытании основано на превращении поли /V/ р/рСр в растворимые в кисзг лоте фрагменты. Поимерно 5 — 20% всего количества поли /V/ р/рСр (1500d pm) расщепляется в присутствии 2,5 мкл выделенных образцов 2 — 5А, Концентрации определяют по калибровочным кривым для аутентичных 2 — 5А (см. выше). Уровень свободной РНазы L измеряют испытании на радиосвязывание после добавления 20000

dpm РзА4/ р/рСр к экстрактам МКПК (50 мкг белка на испытание). Полученные результаты приведены в таблице.

Активность индуцированного интерфероном фермента (2 — 5А — синтетазы) в экстрактах МКПК. получеíKûх от больных

СЗЛом, РСКом, и СПИДом, измеряют in и го и сравнивают с активностью экстрактов от здоровых людей, как показано в вышеприведенной таблице. Концентрация

2 — 5А-синтетазы у больных СПИДом (3 и 5) были в 16 и 20 раз выше чем у нормальных пациентов (таблица, столбец 1). И напротив, концентрация 2 — 5А-синтетазы у больных

СЗЛом (1), РСКом (2) и СПИДом с саркомой

Капози (СК) (4) выше всего лишь в 1.3-5 раз, что подтверждает сделанные другими основные наблюдения, 1836101

Для определения того, являются ли такие измерения in vitro 2 — 5А-синтетазы указанием на функциональность фермента in ино из МКПК экстрагируют 2 — 5А. Биологическую активность 2 — 5А из растворимых в

ТХК фракций экстрактов МКПКусиленно характеризуют в испытаниях на радиосвязывание и испытаниях с ядроцеллюлозой.

Концентрации 2 — 5А аналогичны при испытании двумя методами (таблица, столбцы 2 и 3). Сходимость результатов, полученных методами А и B (таблица, столбцы 2 и 3), указывает на то, что 2 — 5А, выделенные иэ экстрактов МКПК человека, могут связываться и активировать РНазу L из клеток

L929 в той же степени, что и аутентичные

2 — 5А.

Видимое отсутствие количественной корреляции между уровнями 2 — 5А — синтетазы и эндогенными 2 — 5А при СЗЛ, PCK u

СПИД (таблица, сравнить столбец 1 со столбцами 2 и 3) может быть впервые объяснено следующим образом. Определение 2 — 5А— синтетазы в испытаниях ln vltãо основано на частичной очистке через поли (rl) -поли (rC)агарозу, соответственно, в таком испытании измеряют только свободную 2 — 5А-синтетазу, а не 2 — 5А-синтетазу, активированную in

vivo с помощью дзРНК. Однако, непосредственно измеряют эндогенную 2 — 5А — синтетазу плюс деградируемые 2 — 5А — ферменты (напр.2 — фосфодиэстераза и фосфатазы).

Таким образом, аккумулирование 2 — 5А в

МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом указывает на низкую активность деградируемых 2 — 5А — ферментов. Присутствие 2 — 5А в

МКПКтакже указывает нато, что существует эндогенная дзРНК, до сего времени не обнаруживаемая как у здоровых людей, так и у больных СПИДом.

Неспаренная двунитевая РНК является известной формой макромолекулярной

РНК, в которой дестабилизация двойной спирали препятствует спариванию оснований. Неспаренная дзРНК хорошо известна за ее способность индуцировать интерферон, что указывает на механизм, несвязанный сам по себе с индуцированием интерферона.

Типичное лечебное воплощение неспаренной двунитевой PHK является синтетическая дзРНК, образованная комплексом полирибоинизиновой и полирибоцитидиловой) урациловой кислоты, такой как rln г(Сх, V или G)n где х принимает значения от 4 до

29, напр., rln (Сд V/n далее называемая

АМПЛИГЕН ) Исследованы многие полимернblå неспаренные дзРНК, ведущие себя аналогично Амплигену, Ключевое лечебное преимущество неспаренной

55 дзРНК перед другими формами природных и/или синтетических дзРНК заключается в их пониженной токсичности по отношению к человеку и животным. Например, Lampson и др. описывают первичные комплексы дзРНК, способные запускать в действие различные, связанные с интерфероном эффекты, однако токсичность подобных соединений исключает их использование для лечения рака или родственных нарушений.

Неспаренная дзРНК, как теперь известно, обладает лечебной активностью против определенных опухолей человека, в частности, против рака почки. Хотя в настоящее время существует представление о дзРНК как о чисто "индукторе интерферона", тем не менее дзРНК активны по отношению к определенным опухолям человека, которые вполне устойчивы к интерферону., что в полной мере отражено в заявке на Европейский патент ¹ 83305426,5, автором которой является создатель настоящего изобретения.

Вдругой заявке на патент, которая подана 26 августа 1986 под заглавием "Модуляции связанных с вирусом случаев с помощью двунитевых дзРНК" изобретатель описывает ингибирование вируса СПИДа в культуре клеток человека использованием

Амплигена в качестве протипной дзРНК.

Под "неспаренными дзРНК" имеются в виду такие дзРНК, в которых водородные связи (укладка оснований) между противостоящими нитями остаются сравнительно интактными, т,е. прерываются менее, чем одной парой оснований на каждые 29 последовательных остатков оснований. Термин

"неспаренная дзРНК" следует понимать соответственно.

ДзРНК может представлять собой комплекс полиинозината и полицитидилата с определенным отношением урациловых оснований или гуанидиновых оснований, напр., от 1 в 5 до 1 в 30 таких оснований (поли l, поли(СА — 29 х >V или G).

ДзРНК могут отвечать общей формуле

rln./Ñ1 V/n, Другие приемлемые примеры дзРН К обсуждаются ниже.

Неспаренные дзРНК, рекомендуемые для использования в настоящем изобретении, основаны на сополинуклеотидах, выбранных среди поля (Cn,V) и поли(Сп, G), где и означает цифровой показатель со значением от 4 до 29, и являющиеся неспаренными аналогами комплексов полирибоинозиновой и полирибоцитидиловой кислот, образованных модифицированием rl n, rCn с введением неспаренных оснований (урацила или гуанидина) вдоль нити полирибоцидилата (гСп).

Или же дзРНК может происходить из по13

1836101

14 ктивность 2 — 5А — синтетазы, концентрация эндогенных 2 — 5A, уровень свободной РНазы L присутствие ингибитора РНазы L в экстрактах МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом и(!). поли(С) дзРНК модифицированием риозильного скелета полирибоинозиновой ислоты (rln), напр., включением 2 — 0 — мелрибозильных остатков, Такие неспареные аналоги rln.rCn, из которых редпочтительны те, которые отвечают обей формуле г!и. (С!2, V), описаны Carter u

s 0 в патентах США bk 4130641 и 4024222, писания которых даются здесь в качестве ссылок. Описанные в указанных патентах д!зРНК, как правило, приемлемыдля использования согласно настоящему изобрете! нию.

Сцепифичные примеры неспаренных зРНК для применения в изобретении в лючают: поли(!), поли(С4,V) поли(!). Поли(С7,V) пОли(!), поли(С)з,V) поли(1). поли(С22,V) поли(1), поли(С20,G)

ПОли(!), ПОли(С29,6) и поли(!). поли(Ср/23 G > р.

Фармацевтические композиции в соотв тствии с настоящим изобретением включ ют композиции, предназначенные для и рентерального введения в приемлемом ф рмацевтическом носителе. Так могут б ть приготовлены парентеральные раствор, суспензии и дисперсии так, как это т ебуется согласно известным фармаколог ческим методам в стерильной или несод ржащей пирогенов воде в качестве р створителя/раэбавителя, возможно такж с физиологически приемлемыми солями.

Количество вводимой неспаренной дзРНК предпочтительно достаточно для достижения пиковой концентрации в крови от

0,01 микрограмма на миллилитр концентра5 ции дзРНК во всей жидкости организма до

1000 микрограмм На миллилитр в систематической системе кровообращения сразу же после введения в точке, удаленной от места вливания, 10 Или же эффективное количество может быть добавлено к кровяному продукту непосредственно перед инъекцией реципиенту. В таких случаях врач может просто сослаться на стандартную таблицу для объ15 емов жидкости в организме, в которой приводятся соотношения между весом реципиента и его или ее объемом жидкости, в сумме должно быть объем жидкости организма пациента плюс объем жидкости, при20 водимой в равновесие с необходимым количеством дзРНК. Пациент весом шестьдесят-семдесят килограмм имеет в организме жидкость объемом примерно пять-шесть литров, 25

Формула изобретения

Способ выявления вируса человеческого иммунодефицита у животного и человека, включающий отбор крови с последующей ее

30 обработкой, анализом и вынесением суждения, отличающийся тем, что обработку крови проводят на наличие 2 — 5Асинтетазы и при ее обнаружении судят о наличии вируса человеческого иммунодефи35 цита, Продолжение таблицы стандартное отклонение <9% б определено в испытании по радиосвязывании /дублировано/ определено в испытании с ядро-целлюлозой /дублировано/, стандартное отклонение <1% определено в испытании по радиосвязыванию /дублировано/, стандартное отклонение <1% д определено в испытании по расщеплению рРНК,см, также фиг.1 в среднем для 7 контрольных образцов /дублировано/

ЖНΠ— не определялось

78С7836701

1836101 щи ия 8

man s C

Свайя А

Инвюферон Слижупял

Рэимели®

PHasa L

Фиг.4

Составитель И, Тареева

Техред М.Моргентал Корректор О, Кравцова

Редактор

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

Заказ 2992 Тираж Подписное

BНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5