Способ обнаружения антител к вич-2

 

Использование: вирусология. Сущность изобретения: получают антигенный пептид формулы X-Asp-Gln-Ala-Arg-Leu-Asn-Ser- Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Arg- Gln-Val-Cys-Hls- Thr-Thr-Va.l-Pro-Trp-Val-Asn-Y-Z, соответствующий области глюкопротеида gp41, кодированной геном оболочки ВИЧ-2. Пептид является иммунологически реакционноспособным со специфическими антителами ВИЧ-2 и используется для обнаружения заражения ВИЧ-2 или его воздействия и в композициях для стимулирования получения антител против ВИЧ-2 у животных и человека. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4355880/13 (22) 10.06.88 (46) 30.06.93. Бюл. N. 24 (71) С.А,Вироваль (СН) (72) Андерс Вальне. Бо Свеннерхолм. Ларс

Римо. Стиг Жанссон и Петер Хораль (SE) (56) Cabradilla et al., Biotechnoiogy, 1986. N.

4, р.128 — 133.

Kieny et al,. Blotechnology, 1986, 4. р.

790-795. (54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИТЕЛ К

В ИЧ-2 (57) Использование; вирусология. Сущность изобретения: пЬлучают антигенный пептид

Изобретение относится к синтетическому пептидному- антигену, последовательность которого соответствует фрагменту иммунологически важного протеина вируса

ВИЧ-2, Этот пептид полезен как диагностик для определения присутствия антител к вирусу ВИЧ-2. Этот пептид может быть также полезен как иммуноген в композициях. служащих для определения выработки антител против ВИЧ-2 у животных, включая человека. Синдром приобретенного иммунодефицита /СПИД/ является самой важной проблемой всемирного эдравоохранения.

Этиологический агент СПИДа назвали ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), название, которое относится к группе очень близких вирусов, которые раньше называли

HTLV — III, LAV u ARC (теперь общее название ВИЧ-1).

„„. Ы„„1825424 А3 (5I)5 Ci 01 N 33/53, А 61 К 39/12 формулы Х-Asp-Gln-Ala-Arg-Leu-Asn-SerTrp-Gly-Cys-А!а-Phe-Arg- Gln-Val-Cys-HlsThr-ТМ-Val-P ro-Trp-Va I-As n- Y-2, соответствующий области глюкопротеида

gp41, кодированной геном оболочки ВИЧ-2.

Пептид является иммунологически реакционноспособным со специфическими антителами ВИЧ-2 и используется для обнаружения заражения ВИЧ-2 или его воздействия и в композициях для стимулирования получения антител против ВИЧ-2 у животных и человека. 1 табл.

Относящиеся к СПИДУ комплексы из

Северной Америки, Западной Европы и

Центральной Африки обычно имеют одинаковые биологические свойства и антигенно перекрестно-реагирующие протеины. Однако генетические исследования показали различия в нуклеотидной последовательности геномов изолятов североамериканского и африканского ВИЧ. Кроме того, описаны небольшие различия в нуклеотидных последовательностях в изолятах различных ВИЧ из Америки.

Недавно выделены несколько вирусов, генетически и структурно относящихся к

ВИЧ. Эти вирусы, которые генетически и иммунологически напоминают ВИЧ. выделили иэ макак резус /Масаса mucatta/. которые болели СПИДом. подобным заболеванию здоровых диких африканских зеленых мартышек /Cercoplthecus sp./. Ви1825424 русы, которые раньше назвали как STVVIllAGH изолят африканских зеленых мартышек и STVV-IIIMAC /изолят макаки/, теперь известны как ВИО /вирус иммунодефицита обезьяны/, Новый вирус человека. названный

HTLV-IV, выделили у кажущихся здоровыми людей в Западной Африке. Этот вирус, который вырабатывает в инфицированных клетках частицы типа ретровируса, имеет характеристики роста, основные вирусные протеины, аналогичные этим параметрам у

HTLV-ill/LA V u STLV. Серологические данные показывают, что HTLV-И имеет больше сходства с STLV-IIIACM, чем с прототипом

HTLV-Ill/LAV, выделенным из больных в Европе и США.

Африканские больные.

Несмотря на то, что у пациентов наблюдаются классические симптомы СПИДа, в их сыворотке нельзя обнаружить заметные титры антител к известным антигенам ВИЧ.

Однако ретровирус, первоначально назвж ный LAV-2 и структурно и биологически от носящийся к ВИЧ, выделили у пациентов в

Западной Африке, Западноафриканский вирус, который в настоящее время выделен у ряда больных СПИДом, АРС и не имеющих симптомов какого-либо заболевания, теперь известен как ВИЧ-2 для того, чтобы отличить его от ВИЧ /теперь ВИЧ-1/, ранее индентифицированного как этиологический агент СПИДа в Европе, Северной Америке и Центральной Америке.

Также как HTLV-IV ВИЧ-2 ближе к ВИО, чем к ВИЧ- 1. Однако ВИЧ-2 и HTLV-IV не являются одним и тем же вирусом. поскольку ВИЧ-2 уб,вает Т-хелперы человека, зараженные in vitro, à HTLV- IV — нет.

Полная нуклеотидная последовательйость ВИЧ-2, которая была недавно опубликована, показывает гîMологию генетической последовательности с ВИЧ-1 только 42 Д. Значительные различия имеются в большинстве вирусных белков, но наиболее выражены в глюкопротеидах, кодированных генами оболочки ВИЧ-1 и

ВИЧ-2, Фактически, по-видимому, глюкопротеиды оболочки В ИЧ-2 более тесно связаны с глюкопротеидами ВИО, чем с ВИЧ-1.

Исследование отсутствия серологической перекрестной реактивности между

ВИЧ-1 и ВИЧ-2 имеет очень большое значение при разработке диагностических тестов на заражение ВИЧ-2 и вакцин против ВИЧ2. Исследования показали, что больные, зараженные ВИЧ-2, не выявляются с помощь геполпгических тестов, определя5

55 ющих ВИЧ-1. Любые перекрестные реакции, которые наблюдали между этими двумя вирусами, обычно осуществляются эа счет антител, которые вступают в реакцию с общими эпитопами на основных протеинах ядра, Р25 и Р26, кодированных геном gag этих двух вирусов, Антитела к глюкопротеидам вирусной оболочки Р120 и Р41 и их предшественнику Р160 не вступают в перекрестную реакцию с глюкопротеидами оболочки ВИЧ2, Имеющиеся в настоящее время тесты для обнаружения ВИЧ-1, которые, в основном, основаны на обнаружении антител к глюкопротеидам ВИЧ-1, например др1б0.

gp120 и gp41 и их частям, нельзя использовать для обнаружения антител к ВИЧ-2 в пробах для целей диагноза и скрининга, Таким образом, специфичные антигены ВИЧ-2 должны включаться с антигенами ВИЧ-1 в реагенты для эффективного диагностического и терапевтического применения, Разработанные для обнаружения заражения ВИЧ-2 способы в общем случае измеряют воздействие на вирус обнаружением и количественной оценкой антител к антигенам ВИЧ-2 s крови, сыворотке и полученных иэ крови продуктах, Такие тесты можно использовать для диагностики СПИДа и АРС

/СПИД-связанный комплекс/ и для скрининга крови и препаратов крови для предыдущего воздействия вируса ВИЧ-2.

Существующие попытки диагностировать заражение ВИЧ-2 и фильтровать кровь для воздействия ВИЧ-2 включают методы иммунной пробы, связанной с ферментом

/ЕLISA/, предназначенные для определения присутствия антител к иммуногенным компонентам ВИЧ-2 в контрольной пробе.

Другие способы могут использовать методы с фильтровальной бумагой Вестерна, предназначенные для определения специфических антител ВИЧ-2 в контрольных пробах.

В общем случае, можно применить почти все известные иммунопробы, такие как радиоиммунопробы, используя специальные реагенты для обнаружения ВИЧ-2 и антител к нему.

Источники антигенов для этих испытаний могут включать Inter alia протеины ВИЧ1, полученные из линии Т-клеток, зараженных ВИЧ-2, и антигены, полученные методом рекомбинантной ДНК. Однако использование антигенов, полученных иэ этих источников, имеет значительные недостатки.

Получение самого ВИЧ-2 в непрерывных линиях клеток должно осуществляться

1825424 в лабораториях повышенного риска /загрязнение РЗ/ иэ-эа опасности для иссле дователей, которые могут подвергнуться воздействию этого вируса; кроме того. поскольку сообщается о ложных положительных и отрицательных результатах при тестах ELISA при использовании антигенов

BÈ×-1 целого вируса, полученных иэ линий клеток, вероятно, такие недостоверные результаты будут получаться с полученными с клетки ВИЧ-2 антигенами. Анализ пятен Вестерна для обнаружения ВИЧ-2 с применением электрофильтруемых целых вирусных антигенов, может обеспечить большую специфичность, но является более трудоемким и длительным,чем тесты ELISA. Более того, поскольку вырабатывающие ВИЧ-2 клетки имеют человеческое происхождение, препарат вирусного антигена, полученного из этих линий клеток. если не подвергается очень тщательной очистке. может загрязняться обычными клеточными антигенами. такими как антигены HLA, что может вызвать ложные положительные реакции в тесте ELISA.

Исчерпывающая очистка вирусных ан- тигенов из линий клеток может также разрушить иммуногенность иммунологически важных протеинов или иначе неактивных 10 антигенов, вырабатывая тем самым реагенты, которые приводят к ложным отрицательным реакциям. Кроме того, ложные отрицательные реакции, использующие антигены, полученные из живого вируса, могут 35 иметь место из-за стерического препятствия, в результате которого антитела не могут реагировать с их специфическими антигенами, так как реакция блокируется наличием других антигенов и антител в ре- 40 акционной смеси.

Тесты ELISA для обнаружения ВИЧ-2 могут также испольэовать иммунологически важные вирусные протеины, полученные клонированием частей генома ВИЧ-2 в бак- 45 терии. В настоящее время известна полная нуклеотидная последовательность ВИЧ-2 с кодированием генов для различных ВИЧ-2 протеинов, определяемым сравнением с гомологичными ВИЧ-1 генами, Глюкопротеиды вирусной оболочки и протеины ядра соответственно, кодированные епч- и gagгенами ВИЧ-2, по-видимому являются антигенами. распознаваемыми антителами в сыворотке больных, зараженных ВИЧ-2.

Иммунологически важные антигены

ВИЧ-2, такие как gp160 и его продукты расщепления gp120 и gp41, которые присутствуют в вирусной оболочке, можно получить

Э клонированием частей генома ВИЧ-2 в различных системах экспрессии, таких как бактерия, дрожжи или вирусы вакцины. Такие рекомбинантные антигены можно использовать для диагноза и как потенциальные вакцинные композиции. как было сделано для протеинов ВИЧ-1 /1,2/, Однако антигены ВИЧ-2, полученные методами рекомбинантной ДНК, все еще требуют опустошающей очистки во избежание ложных положительных реакций в ELISA из-за реактивности любого антитела к антигенам в системе экспрессии, которые могут загрязнять препарат антигена ВИЧ-2..Также, денатурация антигенов ВИЧ-2 во время очистки может разрушать важную антигенную активность.

Хотя антигены ВИЧ-2, полученные рекомбинантными методами. могут быть улучшением по сравнению с антигенами, полученными иэ зараженных вирусом клеточных культур;рекомбинантные протеины могут все еще обеспечивать реагенты. которые позволяют как можно более точно определять диагноз. Из-эа характера болезни и необходимости точных результатов необходимо разработать другие реагенты для достижения 100 точности при диагнозе

ВИЧ-2.

Протеиновые антигены содержат ряд эпитопов или антигенных детерминант, которые являются областями протеинов. которые включают сайты связи для специфических антител. В общем случае, протеиновые антигены содержат 5-10 эпитоп, каждая иэ которых содержит последовател ьн ость 6-8 ами но кислот. Эпитоп ы могут быть непрерывными, в которых 6-8 аминокислот присутствуют в линейной последовательности, или прерывистыми, в которых аминокислоты, которые образуют эпитоп. сведены вместе трехмерной укладкой протеина. Даже когда эпитоп сос1оит только из относительно небольшого числа аминокислот, его реактивность с антителом подвергается воздействию аминокислот в протеине, который окружает эпитоп.

Исследованиям, целью которых было вычерчивание антигенных сайтов или эпитопов протеинов, помогло применение синтетических пептидов, соответствующих различным областям представляющих интерес протеинов.

В дополнение к их полезности в исследованиях вычерченных эпитопов, синтетические пептиды. если включают большинство антигенных детерминант протеина, имеют потенциал как иммуногенные

1825424 композиции, включая вакцины, и диагностические реагенты. Антигены синтетического пептида имеют несколько достоинств по отношению к получению спецйфического антитела и реактивности. Точную последовательность синтезированного пептида можно выбрать из последовательности аминокислот, фактически определенной иэ аминокислотной последовательности протеина или предсказанной иэ кодирования

ДНК-последовательности для протеина. Использование специфических синтетических пептидов исключает необходимость применения протеина полной длины в получении специфических антител или в их испытаниях. Далее, методы синтеза твердофазного пептида Меррифельда и его сотрудников позволя ют химически получить, по существу неограниченные количества представляющего интерес синтетического пептида. Дополнительные преимущества такого способа заключаются в доступности автоматических синтезаторов пептида.

Синтетические пептидные антигены, соответствующие областями иммунологически важных протеинов ВИЧ-2, найдут немедленное применение в диагностических методах, а.также в качестве возможных вакцин для ВИЧ-2.

В соответствии с изобретением получают новый синтетический пептид, соответствующий антигенному ВИЧ-2 йротеину, полезный в выбранных диагностических методах для обнаружения заражений ВИЧ-2.

Новый синтетический пептидный антиген, соответствующий части глюкопротеида

gp41, кодированной епч-геном ВИЧ-2, обнаружен в настоящее время. Этот пептид полезен для диагностики СПИДа, вызванного заражением ВИЧ-2 у подозреваемых лиц и в методах скрининга для воздействия ВИЧ2 в крови и полученных из крови препаратах с высокой степенью надежности и специфичности.

Этот пептид можно использовать в способах обнаружения антител к ВИЧ-2 в пробах. Эти способы включают контактирование пробы с пептидными антигенами при условиях, которые позволяют иммунологическому комплексу образовываться между пептидом и любыми специфичными к ВИЧ-2 антителами, которые могут присутствовать в данной пробе, Измерение формирования комплекса, если таковое имеет место, при помощи подходящих детекторов, указывает наличие или отсутствие антител к ВИЧ-2 е пробе.

55 двум аминокислотам, не соответствующим последовательности исходного и ротеина, присоединяться к амино- или карбоксильным окончаниям пептида. Такие дополнительные аминокислоты полезны для связи пептида с другим пептидом, с большим протеином носителя или с носителем. Аминокислоты, полезные для этих целей, включают тироэин, лизин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, цистеин и их производные. Можно использовать дополнительные способы модификации протеина, например NHZ — ацетилирование или амидирование СООН-конца для обеспечения дополнительных средств связи пептида с другой молекулой протеина или пептида или с носителем.

Последовательность нового пептида описана ниже.

Н2-41А5.

X-Asp-Gin-Ala-Arg-Leu-Asn-Ser-Тгр-G ly

-Cys-Ala- Phe-Arg-Gla-Val-Cys-His-Thr-ThrVa I-P ro- Trp-Ча!-Asn- Y-Z, где X — водород аминоконцевой NHg-группы пептида или дополнительная аминокислота, Новый пептид может также быть поле, зен как иммуноген в вакцинных композици- ях для иммунизации против заражений

ВИЧ-2 или для получения в животных ВИЧ-2 специфических антител против антигенов

В ИЧ-2.

Изобретение описывает пептид, соответствующий области глюкопротеида трансмембранной оболочки gp41 ВИЧ-2, ко10

0 торый синтезирован и проверен на иммунореактивность к ВИЧ-2 позитивным сывороточным пробам, Новый пептид полезен в испытаниях для диагностики эараже15 ния ВИЧ-2 или для предварительного воздействия на вирус и как иммуноген в композициях для стимулирования получения антител против ВИЧ-2 в животных, включая человека. Этот охватываемый изобретением пептид включает аминокислотную последовательность. содержащую по меньшей один непрерывный /линейный/ эпитоп, реактивный со специфическими антителами ВИЧ-2, Таким образом, изобретение охватывает иммунологически реактивный пептид и его функционально эквивалентные варианты, которые не влияют в заметной степени на антигенные свойства пептида, соответствующего области gp41, кодированной епчгеном ВИЧ-2. Пептид был синтезирован известными методами синтеза твердофазного пептида.

Этот синтез также позволяет одной или

1825424

1О связанная с аминоконцевой NH2-группой пептида, причем эта дополнительная аминокислота выбирается для облегчения связи пептида c n oTe Ho Ho TejI ; Y— отсутствует или Cys; Z - ОН или NH2, Пептид Н2-41А5 кодируется нуклеотидной последовательностью генома ВИЧ-2, охватывающей пары азотистых оснований

/bp/ 7908-7978, которая находится в области кодирования генов оболочки для gp41.

Пептид Н2 — 41А5, где X-Н: Y-Cys; Z-OH, предпочтителен.

Этот пептид можно использовать в способах обнаружения антител к связанным с

ВИЧ-2 или ВИЧ-2 антигенам, Предпочтительно, методы, которые используют пептид для обнаружения наличия специфических антител к ВИЧ-2 в пробе, включают контактирование пробы с пептидом при условиях. позооляющих образование иммунологического комплекса между антигеном пептида и любыми антителами к ВИ4-2, которые могут присутствовать о пробе, Формирование иммунологического комплекса. если таковой существует, показывает наличие антител к ВИЧ-2 о пробе и затем этот комплекс обнаруживается и измеряется пригодными средствами.

Такие методы включают, среди других, гомогенные и гетерогенные связанные иммунопробы, такие как радиоиммунопробы

/РИП/, метод иммуной пробы, связанной с ферментом /Ы (5А/. и анализ пятен Вестерн иа. Далее, протоколы испытаний, исщ)д.зующие новый пептид, позволяют поооести исследования, сраонительные и контрольные связи.

Пептид может быть меченым /генерирующим сигнал/ или немеченым в зависимости от типа используемой пробы. Метки, которые могут быть связаны с пептидами, относятся к разряду известных в технике и включают, среди прочих ферменты, радиоизотопы, фторогенные или хромогенные вещества, коферменты, биотин/авидин, коллоидное золото и магнитные частицы, Модификация нового пептида позволяет осуществлять связь известными средствами с протеинами или пептидами-носителями, или с известными носителями, например полистироловые или поливиниловые микротитровальные пластины, стеклянные трубки или стеклянная дробь, и хроматографическими носителями, такими как бумага, целлюлоза и производные целлюлозы и кремнезем.

Предпочтительными известными методами анализа, особенно для крупномасш5

55 табного клинического скрининга крови и полученных из крови препаратов. а также сыворотки, являются методы ELISA и пятен

Вестерна. В частности, предпочтительным является метод ELISA. Испытания ELISA, использующие пептид Н2-41А5. описанный выше. основаны на методах, используемых в настоящее время с полученными из клетки человека или иэ рекомбинантной ДНК ВИЧ1 протеинами или их частями в качестве антигеноо. Для использования в качестве реагентов о этих пробах пептид Н2-4IA5 обычно связывают с внутренней поверхностью микротитровальной лунки. Пептид может быть прямо связан с микротитровальной лункой.

Однако установлено, что максимальную связь пептида с лунками можно получитьб предварительной обработкой лунок полилиэи,ом до добавления пептида.

Пептид Н2 — 41А5 может быть ковалентно соединен известными методами с протеином-носителем, таким как альбумин бычьей сыворотки, используемым для покрытия лунок, Обычно пептид используется в концентрации 10-100 мгlмл для покрытия.

Пробы, которые должны испытываться на антитела к ВИЧ-2, затем вводят в покрытые пептидом лунки, где образуется иммунологический комплекс, если в пробе присутствуют антитела к ВИЧ-2, Для того, чтобы помочь обнаружить образование комплекса, можно ввести средства генерирования сигнала. Обнаруживаемый сигнал вырабатывается. если в пробе имеются специфические антитела к ВИЧ-2, Изобретение иллюстрируется следующими специальными примерами, которые ни о коем слу .ае не ограничивают объем защиты изобретения.

Пример 1. Для синтеза пептида

Н2-41А5 использовали синтезатор пептида

430А фирмы "Эпплайд биосистема". В синтезе использована и-метилбензилгидриламиносмола на твердофазном носителе. Все аминокислоты для использования в синтезе содержали третбутилкарбонильные группы

/т-Bоc/, защищающие а-NKg-группу. Аминокислоты с реакционноспособными группами с боковой цепью содержали дополнительные защитные группы для предотвращения нежелательнык и ненужных реакций боковой цепи, Отдельные защищенные аминокислоты. и польэованные для синтеза пептида Н2 — 41A5, выбирались из следующих (Вос-6Ь/ОВУ /-ОН. Вос-11еОН 1/2 Н20, Вос-Lys -/2-CI-2/-ОН (кристаллическая), Вос-Мет-Ok и Вос-Туг

1825424

-/2-Вг-2/-ОН, не использовались в синтезе пептида Н2-41А5);

Аминокислоты, используемые в синтезе пептида:

Вос-Ala-OH

Boc-Arg(Tos)-OH

Boc-Asn-OH

Вос-Asp(OBZI)-OH

Вос-Cys-(pMeOBZI)-OH

Вос-Glu(OBZI)-OH

В ос-G Iu-OH

Boc-Gly-OH

Boc-His(Tos)-OH

Вос-Fle-OH 1/2НгО

Вос-Leu-OH НгО

Вос-Lys(2-CI-2)-OH /кристаллич

Вас-Met-OH

Boc-Phe-OH

Вос-Pro-OH

Вос-Ser(ÂZI)-OH DCHA

Вос-Thr(BZI)-OH

Bo .-Тгр /формил/-ОН

Вос-Tyr(2-В r-Z)-OH

Вос-Ча1-ОН

То$-тозил или р-толуолсульфок

OBZI-бензилокси

pMeOBZl=n-метил бензилокси

2-CI-2 - карбобензоксихлорид

2-Вг-2 - карбобензоксибромид еская/ ислота

После завершения синтеза защитные группы удалили из синтезированного пептида и пептид отщепили от смолы на твердом носителе обработкой и ри 0 С безводной плавиковой кислотой (HF), используя в качестве удаляющих агентов совместно 10 (анизола и 10 диметилсул ьфида. В качестве до пол нител ьного удалителя добавили 2ь тиокрезола, так как Н2-41А5 является содержащим цистеин пептидом.

После отщепления HF в пробе промыли под струей йг с удалением любой остаточной HF при помощи воздействия на пробу вакуума при 0 С, Пептид зкстрагировали из смолы обработкой трифторуксусной кислотой /TFA/, которую затем удалили испарением при комнатной температуре. После удаления ТРА пептид осадили и промыли безводным простым эфиром.

До использования в специальных про бах пептид можно дополнительно очистить, если необходимо, при помощи обращеннофаэовой скоростной жидкостной хроматогpages. Очень подходящей колонной для такой очистки служит обращеннофаэовая колонна Vydek С-18. использующая для элюирования пептида градиент вода /TFA/ацетонитрил /TFA/, Пример 2. Пептид Н2 — 41А5, имеющий последовательность аминокислот Asp-Gln5 Ala-Arg-Leu-Asn-Ser-Trp-G ly-Cys-Ala-PheArg-Gin-Val-Cys-His-Thr-Thr-VaI-Pro-Trp-Val

-Asn-Cys-OÍ, синтезировали как описано в примере 1 и использовали в испытании

ELISA для измерения его иммунологической

10 реактивности.

На микротитровальные пластины внесли полилиэин в концентрации 1 мгlмл и выращивали 30 мин. Полилизин затем удалили и в лунки пластин добавили пептид

Н2-41А5 в концентрации 10 — 100 мг/мл для покрытия, После того,как пептид выращивали в лунке в течение времени, достаточного для связи пептида с лункой, пептидный рас0 теор удалили и 15 мин добавляли раствор глутаральдегида, который стабилиэует и рисоединение пептида к лункам, Затем раствор глутаральдегида удалили, лунки промыли буФерным раствором и добавили

25 смесь глицина и альбумина бычьей сыворотки, которая служит для блокировки несвязанных сайтов в лунках и минимизации неспецифической связи антител в течение самого испытания ELISA. После последней

30 операции промывки пластины были готовы к применению.

Обычная вариация известных методов

ELISA использовалась с приготовленными микротитровальными пластинами. Пробы

35 сыворотки отдельных лиц, разбавленные

1:50 в PBS /фосфатно-буферный соляной раствор/, содержащем 0.05 g, полиоксизтиленсорбитмонолауарата /Твин 20/ и 17, альбумина бычьей сыворотки, вносили в

40 каждую лунку и выращивали 90 мин при 37 С во влажной атмосфере, Разбавленные пробы сыворотки затем удалили из пластин и лунки промыли три раза PBS, содержащим

0.05О (Твин 20. В лунки затем добавили коньюгированное античеловеческое 1 g антитело и выращивали 90 мин. Конъюгированное антитело получали в козле или кролике и специфицировали для человеческих IgG, IgM иммуноглобулиновых легких цепей или их комбинаций. Предпочтительно, в ELISA испольэовали связанный с щелочной фосфатазой античеловеческий IgG

/иэ Dabopatts/, разбавленный 1:500 в PBS, 55 содержащем 0,05 $ Твин 20 и 1 альбумина бычьей сыворотки. После того,как конъюгант выращивали достаточно времени для реакции со связанными антителами человека, пластины промыли три раза. Для обнаружения антител к ВИЧ-2 в человеческой

1825424

14

Формула изобретения

Иммунореактйвность пептида Н2 — 41А5 по отношению к ВИЧ-2, положительным ВИЧ-1 и положительным и отрицательным пробам сыворотки, определенная при помощи метода иммунопробы, связанной с ферментом сыворотке, которая реагирует с пептидом

Н2-41А5, использованном как антиген /т.е. положительные реакции/, добавили хромогенный щелочно-фосфатазный субстрат

/таблетки N 104 SIgma Cot/, растворенный в буфере карбонат натрия /MCI и подрегулированный до концентрации 1 мг/мл, который был отщеплен ферментом, присоединенным к античеловеческому IgG для получения цветного продукта. Желтыйоранжевый — красно-коричневый цвет в каждой лунке, показывающий положительную реакцию, считали э спектрометре при

405 нм для количественной оценки реакции. Спектрометрические отсчеты подстроили для корректировки фоновых реакций, Пептид Н2 — 41А5 использовали в параллельных ELISA относительно 6 сывороточных проб, положительных для антител к

ВИЧ-2. 10 сывороточных проб, положительных для антител к ВИЧ-1,и 6 отрицательных к ВИЧ-1 /ВИЧ-2 сывороток. Как показано в таблице„б/6 подтвержденных положительных ВИЧ-2 сывороточных проб /100 / прореагировали с пептидом Н2-41А5. Таблица также показывает, что ни одна положительная к ВИЧ-1 сывороточная проба и ни одна отрицательная сыворотка не реагировала с

Н2-41А5.

Из приведенных результатов очевидно, что новый синтетический пептид, описан5 ный Н2 — 41А5, который соответствует обла" сти глокопротеида gp41 ВИЧ-1, кодированной геном оболочки, явно обеспечивает уникальный реагент для чувствительного и избирательного анализа на присутствие антител к ВИЧ-2.

Способ обнаружения антител к ВИЧ-2, включающий проведение иммуноферментного анализа исследуемой пробы с антигеном и последующую оценку образовавшегося иммунного комплекса, о т л и ч а ю шийся тем, что. с целью повышения чувствительности, в качестве антигена используют полипеитид X-Asp-Gin-Ala-ArgLeu-Asn-Ser-Тгр-Giy-Cys-À!a-Phe-Агу- GlnVal-Cys-HIs-Thr-Thr-Vai-Pro-Тгр-Val-Азп- Y25 Z, где Х вЂ” водород аминоконцевой группы пептида или дополнительная аминокислота, связанная с аминоконцевой NH2-группой пептида; Y — Cys; Z — ОН.

1825424

16

Продолжение таблицы

Составитель С.Вироваль

Техред М,Моргентал Корректор И.Шмакова

Редактор

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 2235 Тираж Подписное

ВНИИХИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раувская наб., 4/5