Способ культивирования бактерий вида bacillus аnтнrасis

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

; ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

;(21) 4517373/13

l(22) 27,04,89 (46) 30,08.93; Бюл. М 32

l(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и мик робиологии, (72) И.А.Бакулов, В.А,Гаврилов, А,Е.Лавре-, сюк и Л.Ф.Николайчук (56) ГОСТ 15 — 991 — 71. Вакцина СТИ живая против сибирской язвы животных, Авторское свидетельство СССР

М 1809556, кл. А 61 К 39/00, 1987.

54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕИЙ ВИДА BAClLLVS ANTHRACIS

57) Использование: микробиология, культиирование, споровая форма бактерий

acillus anthracls, сибирская язва, питаИзобретение относится к микробиологии, в частности к способам изготовления пор.Bacillus anthracis, и может быть использовано в научно-исследовательских учрежденияху занимающихся изучением сибирской язвы, а также в биологической промышленности при изготовлении проти осибиреяэвенных вакцин, Целью изобретения является увеличение уровня спорообразования и выхода бис массы спор штаммов Bacillus anthracls. уменьшение времени изготовления, снижение себестоимости и трудозатрат на производство целевого продукта.

Цель достигается тем, что при изготовлении споровой формы штаммов ВасП!цз

4nthracls используют вместо КПА новую

6поруляционную среду, содержащую сухой,, ЫЛ„„1837071 А1 (я)ю С 12 N 1/20//А 61 К39/00 тельная среда, вакцина против сибирской язвы. Сущность изобретения: для изготовления споровой формы культивирование бактерий проводят в течение 16-18 ч при

34-35 С, затем в течение 56 — 64 ч при 28—

30 С на питательной среде, содержащей в качестве источника азота гидролизат кормовых дрожжей с содержанием общего азота

1,2 — 1,5, аминного азота 0,5 — 0,7 и дополнительно агар, хлористый натрий, фосфорнокислый одноэамещенный калий, фосфорнокислый двузамещенный калий, щавелевокислый натрий, твин — 80. В результате увеличивается уровень спорообразования и выход биомассы спор, уменьшается время изготовления, снижается себестоимость и трудозатраты на производство вакцины, 1 табл. гидролизат кормовых дрожжей 12-15 г!л с . содержанием общего азота 1.2 — 1,5, аминного азота 0,5 — 0,7% и дополнительно агар Q()

3,5 — 40 г/л, хлористый натрий 4-6 г/л, фос- (Д форнокислый одноэамещенный калий 3 — 7 с г/л, фосфорнокислый двузамещенный калий 5-12 г/л., щавелевокислый натрий

0,8-1,2 г/л, твин-80 0,02-0,04%. Указанное количество общего и аминного азота обеспечивает высокий уровень спорообразованив (98-99 $). Кроме того, культивирование ) » штаммов проводят в иных условиях, а имен- а но через 16-18 ч выращивания при 34 — 35 С температуру понижают до 28-30 С и культивирование продолжают в течение 56 — 64 ч, Применение для наработки спорового материала штаммов Bacillus anthracis новой питательной среды, а также изменение

1837071 условий культивирования позволяют повысить выход спор в 15-20 раэ по сравнению с прототипом, уменьшить время изготовления, снизить себестоимость и трудозатраты на производство целевого продукта без изменения биологических свойств штаммов.

Пример. Для изготовления спорового материала штаммов Bacllius anthracis применяют новую споруляционную среду, в которой в качестве источника азотсодержащих веществ используют сухой гидролизат кормовых дрожжей 12-15 гlл.

Уменьшение количества гидролизата кормовых дрожжей в составе питательной среды ниже 12 г/л приводит к снижению биомассы спор, увеличение свыше 15 г/л нецелесообразно, так как не способствует повышению выхода спор, но удлиняет процесс спорообразования на 20-25 ч.

Для создания нейтрального рН питательной среды(7,2 +.0,2) на 1 л среды добавляют 5-12 г фосфорнокислого двуэамещенного калия и 3-7 г фосфорнокислого однозамещенного калия. Изменение количества этих компонентов ниже ипи выше приведенных допусков вызывает сдвиг рН в кислую или щелочную сторону, что неблагоприятно сказывается на росте сибиреязвенного штамма, Добавление в среду щавелевокислого натрия (0,8 — 1,2 г/л) и таина — 80 (0,02-0,04%) способствует быстромуспорообразованию, Изменениесодержания этих веществ приводит к замедлению образования спор.

Затем в питательную среду добавляют агар (3,5 — 40 r/ë), стерипизуют ее автоклавированием при 120 С в течение 40 мин и разливают по 0,5 л в бутыли емкостью 2 5 л (четверти), После застывания агара бутыли

cо средой контролируют на стерильность, выдерживая 16-20 ч при 36-37 С.

Для изготовления спор штамм Bacillus

anthracis засевают в мясо-пептонный бульон, посевы инкубируют при 36-.37 С в течение .14-16 ч. Затем бульонную культуру засевают в бутыли со споруляционной средой из расчета 4-6 мл в каждую бутыль.

Посевы инкубируют при 34-35 С в течение

16-18 ч, затем температуру понижают до

28 — 30 С и культивирование продолжают в течение 56 — 64 ч, После культивирования Bacillus апйгас!з в описанных условиях споровую культуру отсасывают иэ бутылей в стеклянную емкость через сифон с марлевым фильтром. Затем определяют концентрацию жизнеспособных спор путем рассева на чашках Петри с предлагаемой питательной средой и последующего подсчета выросших колоний.

50 данные, полученные при наработке 5 серий спорового материала вакционного штамма

55 — ВНИИВВиМ в параллельных опытах на

КПА и новой спорупяционной среде. Учитывая то, что одна иммунизирующая доза вакцины для крупных животных составляет

2 10 спор, с 1 л новой споруляционной среды получено 30000-37000 доз, тогда как с 1 л КПА — 1500-2000 доз сибиреяэвенной вакцины.

Таким образом, выход спор вакционного штамма 55-ВНИИВВиМ с единицы новой споруляционной среды в разработанных условиях культивирования в 15-20 раз выше, чем в прототипе.

Формула изобретения

Способ культивирования бактерий вида

Bacillus anthracis, включающий посев и инкубирование бактерий при 34-35 С на плотной споруляционной среде, содержащей источник азота, натрий хлористый, агар и воду,отличающийся тем,что,с целью

В результате сравнительных исследований установлено, что уровень спорообразования на предлагаемой споруляционной среде к этому времени составляет 98-99%, 5 тогда как на КПА этот показатель равен 5860%, лишь на 4-5-е сутки культивирования на КПА уровень спорообразования составляет 65 и 70% соответственно. Культивирование штамма на разработанной

10 питательной среде свыше 80 ч нецелесообразно, так как выход биомассы и уровень спорообразования при этом не повышаются.

Таким образом, при культивировании

15 штамма на разработанной питательной среде уровень спорообраэования выше, чем на

КПА в 1,8-1,9 раза. Кроме того, при выращивании на КПА часть спор находится в незрелом состоянии, а около 15-20% вегетативных клеток не образуют спор, тогда как на предлагаемой среде спорулируют почти все клетки (98 — gg%)

Большое значение для повышения выхода спор имеют условия культивирования.

Установлено, что понижение температуры культивирования до 28 — 30 С на разработанной питательной среде приводит к значительному увеличению урожая спор (в 8-12 раз).

30 В результате сравнительных исследований установлено, что выход спор с 1 л новой споруляционной среды при культивировании вакцинного штамма 55—

ВНИИВВиМ в описанных условиях состав35 пяет (60-74) 10, тогда как с такого же количества КПА получено (3-4) 10 спор.

В таблице приведены сравнительные

1837071

Выход спОр вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ с 1 л питательной среды

Составитель И .бакулов

Техред М.Моргентал Корректор И.Шулла

Редактор

Заказ 2855 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент" ° г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 овышения уровня спорообразования, вы. ода спор и ускорения способа, инкубироание проводят в течение 16-18 ч на среде, одержащей в качестве источника азота дролизат кормовых дрожжей с содержаием общего и аминного азота 1.2-1,5 и

5-0,7 соответственно и дополнительно одержащей калий фосфорнокислый одноамещенный, калий фосфорнокислый двуз амещенный, натрий щавелевокислый и твин-80 при следующем соотношении компонентов, г/л: гидролизат кормовых дрожжей с содержанием общего и аминного азота 1,2-1,5 и 0,5-0,7 соответственно 12-15; агар 35-40; натрий хлористый 4-6; натрий

5 щавелевокислый 0,8-1,2; калий фосфорнокислый однозамещенный 3-7; калий фосфорнокислый двузамещенный 5-12; твин-80 0,2-0,4; вода до 1 л, далее температуру понижают до 28-30 С и дополнительно

10 инкубируют на той же среде в течение 56-64 ч,