Штамм бактерий bacillus тнuringiеnsis var кursтакi для получения инсектицидного препарата

 

Использование: производство инсектицидных препаратов. Сущность изобретения: штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. Kurstaki выделен из окружающей среды. Депонирован в Северном Региональном Исследовательском центре департамента сельского хозяйства США, Пеория Иллинойс , под № NRRLB-1897. Штамм обладает ауксотрофностью, требующей аминокислотный комплекс лейцина и валина для роста, споруляции и продуцирования кристаллов. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГО УДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

BE ОМСТВО СССР (ГО ПАТЕНТ СССР) ФЬЕИРЦЩД "

М Й Ч"

К АТЕНТУ ин но

Ки ин етс

Че

Nl

RA (21 (86 (22 (46 (31 (32 (33 (71 ста (72 ти (56 (5

ТН

thu то из бо кл сп кр ни ют кот па пе на

4742274/13

РСТ/US 88/01560 (11.05.88)

13.10.89

30.08.93 Бюл. N 32

18,05.87

US

Соединенные Штаты Америки, предленные Министром торговли (US)

Рассел С,Трейверз и Филлис А.В. Map(LlS)

Biotechnology, вып,4, 1986, 305 — 308.

) ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS

RINGIENSIS VAR. KURSTAKI ДЛЯ ПОИзобретение касается получения новой ектицидной композиции, содержащей

ый штамм Bacillus thuringiensis чаг, taki ИВРИ В-18197 в качестве активного редиента.

Инсектицидная композиция использудля борьбы с видами насекомых отряда уекрылых, в частности, TRICHOPLUSIA овка ни), "совка капустная" и ARTOGEIA

АЕ "импортированные мермитиды".

Спорообразующий микроорганизм В.

inglensls был изолирован свыше 80 лет у назад, и с тех пор стал коммерчески естным в отношении биологической ьбы с вредителями. Спорообразующие ки В. thuringiensis каждая продуцирует ру (эндоспору) и ромбовидный белковый сталл (параспору или клеточное включе). Энфомоцидные свойства приписывая исключительно б-эндотоксину, рый является основным компонентом аспорального кристалла. Когда кристалл еходит в растворимое состояние в кишке екомого, он вызывает образование про„„5U„„1837772 АЗ (я)ю А 01 N 63/00, С 12 и 1/20

ЛУЧЕНИЯ ИНСЕКТИЦИДНОГО ПРЕПАРАТА (57) Использование: производство инсектицидных препаратов. Сущность изобретения: штамм бактерий Bacillus thurlngiensis наг. Kurstaki выделен из окружающей среды.

Депонирован в Северном Региональном Исследовательском центре департамента сельского хозяйства США, Пеория Иллинойс, под М МВВ1 В-1897. Штамм обладает ауксотрофностью, требующей аминокислотный комплекс лейцина и валина для роста, споруляции и продуцирования кристаллов.

1 табл. токсина, который активизируется в результате протеолитического расщепления.

Являясь довольно специфическим видом в отношении Чешуекрылых насекомых и некоторых мух и москитов, В, thurlnglensls является безвредной к невосприимчивым отрядам насекомых, животных и человека. В настоящее время в США В, thuringlensis разновидности Kurstaki включает в себя инсектицидные продукты В. thurlngiensis наиболее широко используемые для борьбы с этими вредителями. Однако по отношению к этим продуктам отсутствует эффективный контроль на экономических уровнях применения.

С другой стороны, синтетические пиретроиды являются химическими инсектицидными агентами, наиболее широко используемыми для борьбы с Чешуекрылыми вредителями. Пиретроиды являются высокоэффективными и обеспечивают более сильные средства борьбы с вредителями по сравнению и с используемыми в настоящее время инсектицидными продуктами В.

thuringiensis. Однако недостаток, связан1837772

III.II1 с ис«альзаванием пиретроидов, саста-! ° i l В !of i, ч1 О 0!Ii: я Вля 10 тся таксич!1ыми В атнашс«;В1 не подлежащих уничгожению бссп::з-;;->ночных, lef4 самым представляя а аснасп., для окружающей Водной жизни, !!ОВ1аму сущсствует потребноСть в э<)>фек-. тивных пнсекгицидах, активных против Чешуекрылых, которые безопасны для окружающей среды, эффективны по стоимо-. сти и которые дублиру от эффективности синтетических пиретроидов.

Цель изобретения состоит в получении

H0Bolil инсектицид«ай композиции, содержащей новый штамм В. thurlnglensls var, Kurstakl NRRL В-18197 в качестве активного

«.«!Лзд..е га, который мажет быть использован для борьбы B частности с Тг!с!1ор!Вв!а г:! и АВ1090!а г; ра! с насекомыми отряда

Чешуекрылых.

l)ОВый штамм f3. thuringiensis НЕЙЛИ В18197 бь л депо 1ирован в Северном Региональном Исследовательском центре "депаргамента сельского хозяйства США, Г!еария, !1ллинайс 61604, Новый пплмм является спорогенным, крисгаллабразующим мутантным штаммом

Выделенных иэ окружающей среды В, йог!Лс1!с л - Is и моет cflocOf5lfoctb прадуцирав:I: ь бипира 1идальные кристаллы, состоящие из таксичнага белка, и явллетсл у«икаль«ым Bт:Oм отношении, что обладает аукса1рафпас;. ью, требующей аминокислотI1 I1 комплекс лейцина и валина для роста, с«с руlu!«If!if >f прадуцированил кристаллов, l3 прсггиваполаж«асгь этому ранее наблюдаомь е шглмглы Б, thuringiensis проявляли ауксатрафнс1с1ь,не затрагивающую потребность В илинакислс1гах К,N/f,N!ckefion еГ а!., Арр!. М!с, >!>!с>|09у, 28, 14;24 — !28, 1974,,Цля целей изобретенич термин "ауксотрафнасгь" здесь с1з,«1 içeã па1ребнасть В пита "лf. è ы" ее щ" с I!3, необходимых для

p0cfB, cflОруллции и прадуцирования кристаллов vu1Kpoopràffèçìe.

Фраза "аминакислатный комплекс питательной среды" употребляется здесь для обозначения питательной среды, содержащей камбинацига двух или более аминакисЛОГ.

Новый штамм МБИ В-18197 размно>кон из пачвеннага слоя с использованием некnaccè÷ecêofo способа отбора посредстВам ацетата натрия и1епла. В соответствии с этим способам водная питательная среда буферизусп с,i примерна до 0,25 М ацетатом натрия, чгаб>ы допустить размна>кение толька пежела1,льнь х спарообразующих организмгв, присутствующих в образце окрузслк .,ега почве«нага слоя. Затем выращенные спароабразующие организмы и неспорообразующие организмы в образце убивали пугем тепловой обработки. Выжившие споры после этого высеивались на чашки и выращивались на соответствующей агаровой питательной среде для получения нового штамма согласно изобретению. Не прибегая к какой-либо конкретной теории, предполагается, что новый штамм согласно изобретения образу отся ва время процесса отбора в результате мутагенеза природных штаммов В. thurlnglensis с последующей обработкой ацетатом натрия и теплом, Примером способа селекции является следук>щий: 0,5 грамгла почвы было добавлено в 10 мл !=бульона (100 мл воды, 1 r триптона, 0,5 r экстракта дрожжей, 0,5 r хлористого натрия) в 125 мл.дефлекторной колбе, L-бульон был буфериэован до 0,25 M ацетатам натрия. Смесь встряхивалась в течение 4 часов при 250 об./мин. и 30 С. После использования проточного теплового устройства пастеризации смесь нагревалась при 80 С в течение 3 минут. Термообработанная смесь высеивалась на чашки с

L-агаром (L-бульон, отвержденный с помощью 1,57; агара) и инкубировалась в течение ночи (16 часов) при 30 С.

Штамм NRRL В-18196 имеет следующие характеристики: колонии явля атся круглы30 ми, цельными, выпуклыми и кремового цвета с диаметрам колонии 2 — 7 мм на питательном агаре после 24 часов. Вегетативные клетки являютсл аэрабными, грэмпаложительными, подвижными палочками размеров 1 — ),2 мкм на 3 — 5 мкм, Концевые (верхушечные) споры вегетативных клеток не раздувают спорангий и составляют от 33 да 50% Вегетативных палочек. Клетки являются положительными по катализе фермен40 та глюкозы гидролизу казеина, но вопреки таксаномическому описанию прежде наблюдаемых штаммов В. thurlngiensls, штамм согласно изобретению не использует цитраты. Новый штамм Не ферментирует

45 маннит, арабиноэу и кислозу.

Дополнительно штамм NRRL В-18197 гидролизавал крахмал, использовал эскулин, продуцировал лецитиназу и ферментировал салицин; клетки не продуцировали

50 уреазу и не ферментировали маннозу или сахарозу. Штамм является стойким по отношению к антибиотикам пеницилинового типа, к таким как нафициллин и метициллин, и является стойким по отношению к низким

55 уровням, т.е. около 10 гlмл, неомицина, канамицина и брамида э1ида, Как сказано выше, продуцирование спор и белковых кристаллов В, thuringiensls NRRL В-18197 требует водной питательной среды, которая содержит лейцин-валиновый аминокислот1837772

5 0

30

40

50

55 ны комплекс. Для оптимального образова ия кристалла бактериями согласно из бретению предпочитаемый состав специ ьной питательной среды следующий:

0,3 триптона, 0,2% триптозы, 0,45% дрож-. же ого экстракта, полученного из буфера фо фата натрия 0,01 М при рН 6,8 с добавле ием 10 MgSO4 и 10 Мп$04 после об аботки в автоклаве. Примером предпочтит льной среды роста является среда ТЗ, содержащая следующие ингредиенты: 0,3% тр тона, 0,2 триптозы,,0,15 дрожжевого кстракта (или 0,65% пептона Bacillus), 10 1 М натрий фосфатного буфера с рН =

-6,, 0,01 1 M сульфата магния и 0,001% 1

M льфата марганца. Продуцирование клеток производится в аэрббных условиях при лю ой температуре, удовлетворительной дл роста микробов. Согласно изобретени, т.е. примерно от 10 С до 40 С; предпочи аемый диапазон температуры между

27 С и 32 С. Величина рН питательной среды соответствующей для выращивания ку ьтуры В. thuringlensls близка к нейтрально ти, т.е. рН от 6,7 до 7,2. Время инкубации яв яется временем необходимым для полно о освобождения спор и кристалла и пр дпочтительно составляет от 18 до 24 часо, Клетки могут выращиваться в любой де лекторной встряхиваемой колбе в течени небольших опытов. Для операций в боле крупных масштабах удобно выращивать ку ьтуру в резервуаре, применяя помешива ие и аэрацию в отношении инокулирова ной жидкой питательной среды. После ин убации клетки собираются традицион ым способом седиментации, как, напр мер, центрифугированием или фи ьтрованием, Клетки могут использо. ва ься как таковые или в замороженном виде я последующего использования. Штамм вы ерживают при 30 С и 250 об./мин в 2-х ли ровых конических колбах Эрленместера с т ойными перегородками при объеме 25% и анят при температуре 25ОС нэ среде ТЗ, от ержденной 1,5 агаром.

Чтобы получить инсектицидную компози ию с В. thuringiensis чаг. Kurstakl ЙЯИ

В- 8197 в качестве активного ингредиента ш амм, составляющий.до 30% общего объем смешивают с инертными ингредиента) м которые составляют оставшийся объем, т; по крайней мере, 70% объема. Инертн и ингредиент может быть разбавителем, ка например, вода. Другие инертные ингр иенты представляют консерванты, агент регулирующие текучесть, агенты, с собствующие прилипанию, спредеры, э льгаторы, поверхностно-активные вещ ствэ, экстендеры и буфер. Используемый интервал доз для штамма составляет от

1,1 х 10 до 5 х 10 спор на 0,405 га. Инсектицид, содержащий мутант В thurlngiensls

NRRL В-18197 в качестве активного ингредиента в укаэанных дозах, является высокоэффективным в уничтожении насекомых отряда Чешуекрылых, в частности совки капустной и импортированными мермитидами (см. таблицу).

Пример способа получения инсектицидной композиции включает смешение — через воздушное измельчение для обеспечения частиц определенного размера и гомогенности — штамма NRRL В-18197, составляющего до 30% общего объема, с инертными ингредиентами, которые составляют оставшийся объем. Эти инертные ингредиенты включают консервант, 2 поверхностно активных вещества, агент, регулирующий текучесть, разбэвитель и буфер, Смесь затем гранулируется и упаковывается в герметичные и влагонепроницаемые контитперы.

Инсектицидные композиции могут распыляться с использованием соответствующих методов распыления и устройств. Новый инсектицид также может быть инкапусилирован или заключен в соответствующий инкапсулирующий материал, такой как органический полимер, и применяться в порошковой форме. Также предусматривается, что генетический материал для дельтаэндотоксина нового штамма В. thuringlensls

NRRL В-18197 может переноситься с помощью техники рекам бинантных ДН К в другие бактерии и растения для обеспечения усиленной борьбы против вредителей. Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Пример. В полевых испытаниях эффективность инсектицида, содержащего в качестве активного ингредиента NRRL В18197, в отношении совки капустной и импортированных мермитидов сравнивалась с эффективностью синтетического инсектицидного продукта, содержащего пиретроид

"ПИДРИН" ("Pydrln") и инсектицидный продукт В. thuringiensis разновидности Курстаки "ДИПЕЛЬ" ("О! реГ). "ПИДРИН" является товарным знаком продукта, продаваемого фирмой "Шелл корпорейшен", и содержит

30% циано (3-феноксифенил)метил-4-хлоральфа(1-метил)бенэолацетата и 70% инертный ингредиентов. "ДИПЕЛЬ" является товарным знаком продукта, продаваемогофирмой "Абботт лабораториз" и содержит

3,2 В. thuringlensls разновидности Курстаки и 98,8 инертных ингредиентов.

Также испытывались две других инсектицидных композиции, содержащих в качестве активных ингредиентов В. thur inglensis

1837772 (1,2,3)

Средняя оценка повреждения листвы

15 сентября

Обработка и норма/0,405 га

Среднее количество мермитид импортированных на 10 растений, 15 сентяб я

Среднее количество совки капустной на

10 растений, 15 сентяб я

ПИДРИН 2,4 ЕС

78,372 г активного ингредиента

В. thuringiensls

В-18197 5

0,0 а

1,00 а

1,25 а

0,0а

1,0 abc

0,50 аЬс

var. Kurstakl ИЯВ1 В-18195 и В, thuringiensis

var, rnorrlsoni NRRlL В-18196. Инсектициды, содержащие в качестве активных ингредиентов новые штаммы NRRL В-18197, B18195 и В-18196, содержали 5,5 х 10 спор на 0,5 л воды, 0,01 общего объема составлял жидкий детергент (добавленный как спредер) и остальной объем составляла вода.

На Восточном Берегу Мэриленда капуста листовая была прямо высажена семенами в 4-рядных делянках по 30,48 см длины

07 июля 1986 г. Растения отстояли друг от друга на 5 см в ряду и 91,5 см между рядами.

Обработки были организованы по схеме рандомизированных блоков с 4 повторами.

Каждый ряд был буферизован защитным рядом. Почва была супесчаной почвой Норфолк "А". Все обработки опрыскиванием включали 5,5 10 спор в 0,5 литров воды, в

g которую добавлялось 0,01 жидкого детергента в качестве распыливающего вещества (спредера), Опрыскивания производились с помощью садового опрыскивателя тромбонового типа, калиброванного для подачи

113,55 л состава на 0,405 га, Ряды обрабатывались опрыскиванием

11, 18 и 25 августа и 2 сентября и 8 сентября.

15 сентября производились оценки поврежденной листвы и количества насекомых. Повреждения вследствие естественно происходящего нашествия совки капустной и импортированных мермитидов было умеренным; Оценки повреждения листвы были в диапазоне от 1--5 и индексировались следующим образом; (1) 0-3 повреждения— случайные отверстия на листьях; (2) 410 повреждения — несколько листьев с отверстиями;(3) 11 — 25 повреждения— среднее/умеренное число листьев с отверстиями; (4) 26-50 повреждения — большинство листьев с отверстиями; и (5)

51-100;4 повреждения — повреждение корневой шейки и/или все листья с отверстиями.

Данные анализировались методом дисперсионного анализа, и средние значения выделялись с помощью испытания множественного ряда Дункана (DMRT) при P =0,05

5 уровня (Дункан 1951). Результаты приведены в таблице ниже.

Таблица ясно показывает отличные инсектицидные свойства нового штамма согласно изобретению в отношении совки

10 капустной и импортированных мермитидов.

Штамм В. thuringlensls В-18197 обеспечил статистически ту же защиту капусты листовой, как и "ПИДРИН", Инсектицидные композиции, содержащие штаммы NRRL

15 В-18195 и ИВРИ В-18196, в качестве активных ингредиентов, показывающие идентичные уровни защиты от совки капустной и импортированных мермитид в выражении среднего повреждения листьев, являются

20 статистически менее эффективными, чем

"ПИДРИН". Однако эти инсектициды обес.печивают 10-кратное увеличение активности по сравнению с промышленным инсектицидом В. thuringlensis "ДИПЕЛЬ".

25 Такое увеличение хорошо демонстрировалось, когда обработки веществом "ДИПЕЛЬ" показывали идентичный уровень борьбы (повреждение менее 10 ), как и штамм В-18195 при разбавлении 1:10 пер30 воначального состава. (1) Любые два числа в одной и той же колонке с последующей той же буквой значительно не отличаются (Р = 0,05) DMRT. (2) Распыление производилось 11, 18, 25

35 августа и 2, 8 сентября. (3) Вред, причиненный, главным образом, совкой капустной и импортированными мермитидами. (4) ДИПЕЛ = 7,26 миллиардов междуна40 родных единиц на 373,2 г. (5) Калибровано по выходу 7,26 миллиардов международных единиц на 3?3,2 г; °

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus thuringiensls

45 var, Kurstaki NRRL В-18197 для получения инсектицидного препарата, 10

1837772

Продолжение таблицы

Составитель Г.Смирнова ! Редактор В.Трубченко Техред M.Ìoðãåíòàë Корректор М.Андрушенко

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 ; Заказ 2873 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5