Штамм бактерий bacillus вrеvis-продуцент рестриктазы в @ bi

 

Использование: биотехнология и практика научно-исследовательской работы в молекулярной биологии, биохимии генетической инженерии. Сущность изобретения: продуцент В. brevls В КМ В-679 выращивают в аэробных условиях в питательной среде , содержащей источники углерода, азота и минеральные соли до поздней логарифмической фазы роста, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами. Биомасса В. brevls В КМ В-679 содержит новую сайт-специфическую эндонуклеазу BbvBI, узнающую и расщепляющую последовательность ДНК 5 G CfT/CXA/G)CC3 .B количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах, содержание рестриктазы BbvBI в биомассе 7000-10000 ед на 1 г сырого веса. Для изошизомера BtvBt, рестриктазы HgiCI, выход очищенного фермента не указан. Выход очищенного препарата рестриктазы BbvBI составляет 1200-1500 ед. на 1 г сырой биомассы. Эндонуклеаза рестрикции BbvBI не содержит примесей фосфатаз, неспецифических эндонуклеаз и экзонуклеаз.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК. (э!)э С 12 N 9/16, 1/20

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОАЗИСА!-(ИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4896774/13 (22) 27.12.90 (46) 07.08.93. Бюл, М 29 (71) Институт биологической и медицинской химии АМН СССР и Институт молекулярной биологии им. В,А.Энгельгардта (72) Н.Н.Соколов, H.В.Аникейчева, M.À.Çëüдаров, А.Б.Фицнер, И.B.Карпычев, А.А.Калугин, О.Т.Самко, Э.Б.Хорошутина и

Г.И.Либрик (56) 1. Kroger М., Hobom G., Schule Н„Мауег

H. Nucleic Acids: Research. 1984, ч, 12, р.

3127 — 3141.

2. Авторское свидетельство СССР

N. ii il 70777, кл. С 12 и 9/14, 1983. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus Ьгеу!э

ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ BbvBI (57) Использование: биотехнология и практика научно-исследовательской работы s молекулярной биологии, биохимии генетической инженерии. Сущность изобретения:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в практике научно-исследовательской работы в молекулярной биологии, биохимии, генетическОй инженерии, Целью изобретения является получение штамма бактерий, продуцирующих новую эндонуклеаэу рестрикции ВьчВ! со специфичностью 5 G G(T/Ñ)(À/G)CC3 с высоким выходом.

Поставленная задача достигается тем, что биомассу В. brevis ВКМ В-679 выращивают в аэробных условиях в питательной

„„5Q ÄÄ 1832129А1 продуцент В. brevis BKM В-679 выращивают в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли до поздней логарифмической фазы роста, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами. Биомасса B. brevis BKM В-679 содержит новую сайт-специфическую эндонуклеазу BbvBl, узнающую и расщепляющую последовательность ДНК 5 G

С(Т/C}{A/6)ÑÑÇ â количествах, достаточных для получения рестриктаэы в препаративных масштабах, содержание рестриктазы

ВьчВ! в биомассе 7000-10000 ед на 1 г сырого веса. Для изошизомера BbvBl, рестрик тазы Нд!С!, выход очищенного фермента не указан. Выход очищенного препарата ре--стриктазы BbvBI составляет 1200 — 1500 ед. на 1 г сырой биомассы. Эндонуклеаза рестрикции Вь В! не содержит примесей фосфатаэ, неспецифических эндонуклеаэ и зкзонуклеаз, CrO среде, содержащей источники углерода, заM тем и минеральные соли до поздней логарифмической фазы роста, целевой продукт выделяют иэ полученной биомассы извест- О ными методами, Эндонуклеаза рестрикции Вь В!, изошиэомер Нц!С!, узнает и гидролизует участок нуклеотидной последовательности

ДНК 5 G 6(Т/С)(А/6)ССЗ . Рестриктаза расщепляет ДНК фага Я по 25 участкам, ДНК аденовируса Ad2 по 57, ДНК обезьяннего вируса SV40 по 1, ДНК фага ЯХ174 по 3 и плазмиду pBR322 по 9.

Г)ОИСК ШТаММа-ПРОД)гг! I Q! I ГЛ 31!)ГЦЗ Ji! IJ) t" и Р и П O Ь! O Ц Ц,) Р а а О а О О та I г г, Сг г - ;".!;, i, Q1

ГгРесс МОТО го< Teстнr)оаа! г !1! j:!" .: !,"!;(!l ?Гг:; ПЕ

СТРгЛКГаэ В ТО)!УО)!1 ИЫХ al(СТО!с i .- ";:".;!Е (Т)! м?луггоорглнгг! -г<гг)г) г rlj)Q)?г1 гг »"l(!!,!«ч ;! г )г)"

ФП )Е ?ОМ ?гров ГК-ОО О ;С?ц<Ч?г3(г!И (", ц ;;" розно;:. rc!:: г!:.!1 г4 Гг г рг р " :г!г )!i г !ггг : г !ггг ° l... j,j! 1 !lI Г! 7! l

МОр(!)0310?-!1-?СС..:",,";-:. ОСОбэ?:И;г- .. . !-.I

3 Р(Э;.г." ---l Pb) «f, . !

K)Jp i у р а г г !! rj. г l ! г г и i < г! г"»" г г! a " * г г ., г

)а ° КОГО д!!НГ)!И аГ,ГОЕ РОГ) Г! ?цтГ)1! г !. (г,"(Н)гй КгЕЛКИЕ бЛЕ((,!ц;И((0!3!)!!i!j j I ) гга!Iг

ПЕТГ)ги С I.,IßQOj)Q!) T()!!Ij! Ьl;1 .1! г.. О(3;г! Ь" Qjl ИО

bJi eстя ц 1130, Г)!ад;!le КОп О! Iг:!", I - . .1: i;О! :.:.! . (гоiff!j)! 6VI?j 0!!Q г! 6)\7!fbej!р () )г !. ll r ..; —; )гг.

3!<3)лер?-:0 пом,j !i: lf!1 . I)<

ОТНОЦ!ГЭ!".I10 К К!г!(? КОРСО),, Э! Ц".О, УТИ)IИЗ 11!ИЛ lГJ "(Э(iоl! II". (гио : .,:,;:! .! !".

J3(3Ta3 Гггз + 1-г:! ?1! !I! I!!, Индол и сероводород - !ц) цб!)(1;;у(;:, «j(ОПТ!г)Ма)И,!!Ыо УСЛС!)г..! -:ЫРО!гцнхранения культуры.

K!jJ!b; Vf)a В. 1>!гцгг!)) B j«?г)! В-6, 9:

Раотот В УС)!ОВИЯХ а - РОЦ?гл; Ij .!(f 37 ";;;,-, б!(ггt .;

Оно Хоттглгигор(3, с()дер>3(а?г)(31;! 2 "г,, rj;I(;!:.()зь.:, бЕЗ Г)НОКОЭ1-lг Иа Срвдгэ С ?г!дргцгг, .ЭЭ)-:)3, КИ.,::.: к!л ь) среды („В. При I!i! Г)ц?ц? ?ц.".! ц" : . л .!.

") f ))!I 37 С Н Л К аг! Л Л КО j! Р а Э. И ! (! Х ц . ? г:.: >

-!гг11e!! i !Q 1,",:. !!!;!li(! I!Р Р,г, —,) г -- .:г гг;г г;П-, !!,1

ГЛ Ю К го Э Ь? 1, (>; С р ) Г),: 1.. 1,:Э, (: р: ° цГ (: гидролизатом 2,5.

НОШЕ Н?3И 1? 1 0 К О «)! Е?1 г;; p::.: ",. .

ОГ)ТИМУ!«1 РОС«га;Уя!.j У! .,":!, f(!г.:Г,: ." !гг :::

37Î(I j -7 ч -1

11 !1 )cIJjep г)Ы:)ггоо г ?г, рг г;гг гг:,.г г г г;:, ре(.Грглг<т азг В! „,, 1 1-. бг, - ))аг-! р 1! цг),,;с,<, Д И Т f! P! В Ы 0 а Ц! И В г И И ги : "; j:, t 7 " Ы

Фермеитере при 37 С с аэ!)О(?Ио.: :,"-; срсло !. ()1 16!)ь?м Г?1др07!Изэ! Ol i

РабОЧ1 18 !кизяком мясо-пеп Г f! Iîj«? агэре по )лзол?1

НОВЫМ (иаС)!ОМ ИЛ!.! В ЛИОФггЛ fal!i)eпг- Иllt!!«

В И де В а г,!f г)!„! p a ) Выделение рестриктазы BI>vBI rlpoj)o дят фракционированием в двухфазной сис.:::-:!г!Е )je.llt,aòj(ËQHr)3ÈKОЛЬ/дЕКСтраН И

:(1)0)!аг()г!)аАией иа колонках с аФфинными

;Oг!Ог)б!..(31-?ИЫ).!!Л СОрбЕНтаМИ.

?л:!Куб)ациг)1!Ная смесь для определения

ОКТИгц?ОСТИ рЕСТргЛКтаЗЫ Bj>)CBI, ОбЬЕМОМ 40—

50 ::кл, г;одегц-:::, . 0.01 М трис-НО, рн 7,5, 0,г3? !v1 ?л;-,С!(, 0,001 М дглтиотреитола, 100 мкг/мл б?:!чь=-*гг! сывj)poToчного альбумина, .гкг )1)-! .< Фага ). л 0,3-3 мкл Фермента. !

73:,:;; б. (-;.;,;,О(ll!0!,ij;!т при 37 С в течение 60 п(;-!;I)i,"-Г)3 i . дролиза Днк Фага л. раз=.,;:;,-.-. :Зл;-. .:: рцфорезом в l,2 — 1,5 /. агарозг i

, ;!;Л " Л :"; С !О(.Л() Г),,г!ОЩ!Л?.г? ПРОКРагЦИВаНИЕМ

Г -. г" ; 6ГЦ !": 3С !Oil ЗТИДИ?1, 3а Е()ИЧгИЦ)7 аКтИВ

:;; !3.:,:;.:::)3!г?,- 3ь„В! пРииима;от колиI:)!!.:.".-It i-a !«!) !лкл}, которое за 1 ч

? Г..: ".:.:?ц.:.! !.Ог?!!ОСТ)НО ГндрОЛИЗувт 1 МКГ

,";. " i.!,! при jr*. лмал)ли,!х условиях реакг, : 1 . и ..1 .. p 1. Культуру B. brevis BKM . -:".i .), p:, (Q;)ãjrIreïьнО адаптлруют в тече; ):г и )и 31 С в условлях аэрации на .: .. -! (!; QJI .ИО?," С!)г)ДЕ, СОДЕРжаЩЕй В ! "!j г::-!!)(.ц: .": КИJI!.кл 33,0 г; 5,!a(:f 7,0 r, до !

I,г ЯТ j!J!!l ПОСЕВа е ФЕРМЕНтЕР iOTO

С:;:г) . 1:. Да (iil PÎèa е ÍÓÞ КУЛЬТУРУ На г„ л ."::, . ".;.;.ды з расчета 1:|0, и размно, !(:!! ""!,!! Ю i"lË Ь, "!)bl ПРОПОДЯгт ПОСЛЕ . )..::., ц:гц1,;ц::; ".реду ииокулята в соотноше;,:,:,; 1; !Г; к;-)3=;,е;,,; -.роды а условиях аэрации

i0! ",:",, Р)г-! Овады 12- 7,1.

3)пи l!:",!р; инваиии рН 1<ультуральной ... ; и,(;lгг!3?.:!071,()QIT>((!1)ают в пределах 7,0i,6, " - -и,"..Клине поод07!>Ка!От до достиже-! " г), .!". .!! I! Э!.; ОГц рИ(!))ЛИ !()СКОЙ (!)азЫ рОСТа, . ; д Гцг)r!:). : Л:30,,,-QCb! 6--1,5 r/Ë КУЛЬ".", ?г?р: ц"..-I! e !j";г. rpl!!: Газы !В(г(гБ! В био . j!r!0-10000 Qn./ã микро г:

Ггll) "Д"! f"! г

i ).г 1гг",) !": . . 1:, ". Е О Э Ст Г) И КТО 3 Ы. (1- ;1 ио =-.сы В. ЬгеЛ BKM В-679 сус.(е:!д .".ру» e l..:!I!cpa, клетки разрушают уль;-и: j) -,(c::P0й jiea(!ь?те?г)ац!лей при 2-4 С и г.,г г с,;,—:е!?э!110 центрглфугиру)от при !0)г,00(! „ —.-::-Ic-=; e! e 60 мин. Содержащуюся н!ills садо-!Ной х:идкости рестриктазу !

:;;„,!, c!aêциоиируют в системе полиэти-! е ...:. :(()Г! ÄJдекстран по Альбертсону, посл-: :-::г О 01,)ra! Iöe)IH)J!0 по Ферменту Вь) Б!

Q; !)> ; Il;;io Фазу хром()тoгpаФиру!От в калий3)г)г..:-ти<:... 1)уФере а градиенте концентрац)! ) :(.! 1а кej!n)Iках с голубой сеФарозой .I.r .- B:"Ð ;:3r.:-пес! ц?", !лвеция), ФосФоцеллю1832129 лозой Р11 ("Whatman", Англия) и гепаринсефарозой Cl бВ ("Pharmacla", Швеция).

Получают 15000 ед. активности фермента в 5 мл буфера с 507; глицерином. Выход очищенного препарата рестриктазы Вь,В(5 составляет 1500 ед. на 1 r сырого веса биомассы, Активность фермента не снижается при хранении при -20 С в течение б — 8 мес, Препарат рестриктазы Вь,В не содер>кит примесей фосфатаз, экзонуклеаз и не- 10 специфических эндонуклеаз и пригоден для целей молекулярного клонирования и структурных исследований ДН К.

Пример 2. Культивирование штамма

В, brevis ВКМ В-б79 проводят аналогично 15 описанному в примере 1, за исклк>чением того, что в качестве питательной среды используют среду, содер>вящую в 1 л: 250 мл основного перевара Хоттингера; 5 г МаС!; 1 г К2НР04; до 1 л Н20, 20

Выход биомассы 4-5 г/л культуральной жидкости, Содержание эндонуклеазы рестрикции в биомассе 7000-8500 ед/г сырого веса.

После проведения очистки фермента, 25 как описано выше, выход рестриктэзы В ну В составляет 1200 ед. активности/г сырого веса биомассы.

Таким образом, но предлагаемому способу получают новую зндонуклеазу рестрикции Вь В .

Биомасса штамма В. brevis BKM В-679 содержит новую сайт-специфическую зндонуклеазу Вь

5 GG(T/А)(А/6)СС3 в количествах, достаточных для получения фермента е препаративных масштабах содержание рестриктазы

В!> В! в биомассс 7000-10000 ед/г сырого веса.

Выход очищенной рестриктазы HglCl, изошизомера Вь BI, авторами не указан (1).

Для рестриктазы Вь В) выход очищенного фермента составляer 1200-1500 ед. на

1 г микробной массы, Зндонуклеаза рестрикции Bb Bl не содержит примесей фосфатаз и неспецифических нуклеаз.

>ый фермен ео>i,ei быт!) использо" ван в биотехнологических и генно-инженерных исследованиях.

Формула,aîáðåòåíèë

Штамм бактерий Hacll(цв brevis Bi

Составитель А. Точилкин

Техред M Моогентал Корректор,г1 Q>„.яль

Редактор

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

Заказ 2604 Тираж Подписное

ВНИИГ!И Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5