Способ получения альфа-амилазы

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧ Е СКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕЯЮЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

".ì0 . Р (с

" :-. ищ

ERA

k ПАТЕНТУ

1 (21) 3451221/13 (62) 3244760/15 (22) .11.06.82 (23) 13.02,81 (46) 30.08.93. Бюл. ¹ 32 (31) 8005184, 8011842 (32) 15.02.80, 10.04,80 (33) GB (71) СПС Интернэшнл Инк (US) (72) Чарльз Энтойн Кольсон, Пирр Эмил Корнелис, Колетт Симон, Дигнефф, Рауль

Г.П.Валон, Коррине Валон (BE) (56) Патент. Японии № 5Н 0 52-76480, кл. С 12 N 15/00, опублик, 1975.

Изобретение относится к области технической генетики, а именно к способу получения альфа-амилазы.

Целью изобретения является повышение эффективности способа получения альфа-а мил азы.

П р и м е.р 1. Клонирование гена альфаамилазы.

Применяют следующие материалы: ограничивающая эндонулеаэа Hindi ll; лигаза

ДНК Т4; фаг/лямбда NM 590. ДН К фага получают экстракцией фенолом иэ высокочистых частиц фага; плазмида pBR322, ДНК плазмиды очищают из клеток Е.coli, лизированных лизоцимом, в хлорид цезия-бромид этидия градиентах плотности; микроорга-ниэм-хозяин: Е.coll; микроорганизм-донор штамм Bacillus megaterium со следующими микробиологическими признаками: морфология: палочки (0,5 — 0,7 х 2,0 — 50 мкм), подвижные, грамположительные, споры терминальные и субтерминальные; питательный бульон: хороший рост;,, Ы2,, 1838410 АЗ (я)5 С 12 и 15/00//(С 12 и 15/00, С 12 R 1:00) (54)(57) СПССОБ ПОЛУЧ >, ...,, ..., АМИЛАЗЫ путем культивирования в условиях продуцирования альфа-амилазы микроорганизма-продуцента, о т л и ч а ю щ: и и с я тем, что, с целью повышения эффективности способа, в качестве микроорганизма-продуцента используюr микроорганизмы, выбранные из группы штаммов: E,coli СЕ 7001 (рСР1) NCil3 № 11

570, Е.соИ С1 7002 (рСН2) NCIB N 11573, Е,coli CL 7003 (лямбда альфа Amyl) NCI;3 ¹

11586, В.su0tIIic С3 8001 (рСН1) NCIB №

11629. питательный бульон: хороший рост, колонии плотные посредине и более расплывчатые вокруг; молоко: пептониэация без изменения рН; желатин; не сжижает; восстановление нитратов: отрицательная реакция; каталаэная реакция: отрицательная; оксидазная реакция: отрицательная; цитоэромоксидазная реакция: отрицательная; продуцирование индола: отрицательная; образование сероводорода: отрицательная; потребление углеводов: потребляет арабинозу, ксилозу, галактозу, глюкозу, левулезу, мальтозу, рафинозу, сахарозу. крахмал и кислоты, полученные из них, нарамноэу, маннозу, мелибиозу, инулин и салицин не потребляет; потребление многоатомных спиртов: потребляетсорбитол иманнитол, не погребляет аденитол, дульцитол и ионозитол:

1838410

55 (pCP1). декарбоксилазная реакция на лизин: отрицательная; уреолиз; слабый; сопротивляемость действию тяжелых металлов: растет непосредственно на 500 м.д. С бульон хлорид натрия: рост при концентрации хлорида натрия 3,5; ; оптимальная температура роста: 30—

37 С; максимальная температура роста: 40—

50ОС; минимальная температура роста: 520ОС; потребность в кислороде: аэробный микроорганизм.

Микроорганизм сдан на хранение в Национальную коллекцию промышленных бактерий 12 февраля 1980 r под номером

NCIB N 11568.

Ниже приводится описание применения способа его получения.

А. Рекомбинация in vitro между ДНК лямбда и В.megaterium.

Около 7 мкг ДЕК В.megaterlum расщепляют 10 ед. Hindlll при температуре 37 С в течение 1 ч в объеме 25 мкл буферного раствора Трис при рН=7,5. Около 2 мкг лямбда

M 590 расщепляют аналогичным образом тем же ферментом. Реакции останавливают путем нагрева в течение 10 мин при температуре 75 С.

С целью определения эффективности расщепления образцы обеих реакционных смесей подвергают электрофорезу в геле агарозы в течение 20 ч при напряжении 20

В. После окрашивания геля этидийбромидом должны получить две полосы ДН К лямбда, полученные в результате расщепления отдельного участка Hindlll на ДНК лямбда, и очень большое количество почти переКрещивающихся полос бактериальной ДНК, расщепленной на большое количество участков.

Расщепление ДНК смешивают и инкубируют в течение 5 ч при температуре 10 С

0,15 единиц ДНК лигазы Т4, чтобы могли. происходить произвольная повторная ренатурация и ковалентное окружение фрагментов ДНК.

По окончании инкубации ДН К смешивают с препаратом, инкапсидированным in

vitro, состоящим из смеси двух комплементарно-дефективных лизатов фага (лямбда

Dam и лямбда Sam), индуцированных из неподавляющих штаммов.

Для оценки эффективности этого способа выполняют два контрольных опыта.

1. Образец смеси был введен в Е.cali. В результате должно быть получено 3 ° 10

Ф

50 пятен на 1 мкг введенной ДНК лямбда, что указывает на большую эффективность о6работки лигазой.

2. Полученные таким образом пятна были исследованы визуально. Если из них 70;ь были прозрачные, а не мутные, то это указывает на присутствие фрагмента ДНК.

В.megaterlum, который стыкует и, следовательно, инактивирует лямбда ген CI, отвечающий за помутнение пятна.

В. Отделение деривата фага лямбда, несущего В.megateter! um амилазу, Остаток инкапсидационной смеси применяют для заражения Е.coli в количестве приблизительно 10 жизнеспособных час-. з тиц на посев. После роста зараженных Е,coli и образования пятен посевы сортируют на присутствие пятен разложения крахмала.

Это делают путем кратковременного действия на посевы парами иода. При этом пятно, образованное таким фагом, будет окружено прозрачной зоной, образующейся в результате диффузии и действия амилазы из лизованных клеток. Фаг, содержащий это пятно, немедленно отбираютдля субкультивирования (дли ельное действие паров иода убило бы фаг), Потомство этого пятна размножилось в чистоте (продуцируя амилазу) и обозначено как лямбда NM 590 Amyl. Фаг лямбда

NM 590 Amyl сдан на хранение в Национальную коллекцию промышленных бактерий 12 февраля 1980 г, под номером NClB N

11569.

С,.Повторное клонирование гена амилазы в плазмиду pBR 322.

1 мкг ДНК из лямбда NM 590 Amyl и 0,3 мкг плазмиды PBR 322 расщепляют, смешивают и обрабатывают лигазой, как описано в части А. Этот препарат, применяют для трансформации (по обычной методике) штамма HB 101. Отбор производят по сопротивляемости ампициллину (ар)— свойству, которое сообщается клеткам в присутствии этой плазмиды. Обычно эта плазмида сообщает также сопротивляемость к тетрациклину (ТС). Однако введение посторонней ДНК в эту плазмиду расщепляют tet ген, таким образом, содержание чувствительных к тетрациклину трансформированных клонов отражает содержание содержащих плазмиды клонированных ДНК; В данном случае 16 / клонов содержали новую плазмиду, которая придавала амилазе активность к Е,coii. В соответствии с одновременной международной номенклатурой плазмид новые плазмиды, описываемые в настоящем описании, называются (pCP), а конкретная плазмида согласно настоящему примеру обозначена

1838410

Это показывает, что повторное клонирование гена тем же самым ферментом (в данном случае Hlndlll) является очень эффективным. способом (16 вместо 1:10 ), Плазмидосоде ржащий микроорганизм обозначен Е.coli CL 7001 (pCP 1) и сдан на хранение в Национальную коллекцию промышленных бактерий (NCIB) 12 февраля

1980 г. как NCI В М 11570.

Амплификация и продуцирование фермента.

Продуцирование фермента в содержащих плазмиду (pCP 1) клетках улучшают двумя следующими способами.

1. Насыщенные культуры.

Культуры инкубируют в течение ночи при температуре 37 С на вращающемся вибраторе в пятилитровых колбах Эрленмейера, содержащих 1 л культуральной среды (LB; дрожжевой экстракт-триптон), 2, Хлорамфеникольная амплификация.

Культуры инкубируют при температуре

37 С на вращающемся вибраторе в пятилитровых колбах Эрленмейера, содержащих 1 л культуральной среды (LB), до достижения плотности 0,8 (650 нм), после чего добавляют 150 мкг/мл хлорамфеникола. Это предотвращает дальнейшую репликацию хромосомной ДНК, но не репликацию содержащей ген амилазы плазмиды (pCP 1).

После амплификации (до 3000 копий) плаэмиды по сравнению с хромосомной ДНК хлорамфеникол был удален, чтобы мог продолжаться синтез протеина, а именно, после амплификации клетки отделяют от среды методом центрифугирования, промывают для удаления хлорамфеникола и повторно культивируют для продуцирования амилазы.

О. выделение фермента, Клетки культивируют в течение ночи, после чего их суспендируют в 25 -ном растворе сахарозы в 0,5 объема культуры и подвергают вибрации в течение 10 мин при температуре 24 С, в результате такой обработки происходит плазмолиз клеток. Затем добавляют ЭДТК к 1 мМ конечного раствора (чтобы стенки клеток стали проницаемыми) и материал подвергают вибрации в течение еще 10 мин при температуре 24 С, Суспензию центрифугируют и клетки быстро повторно суспендируют в холодной (приблизительно 0 С) воде и подвергают вибрации при этой же температуре еще 10 мин. Суспензию снова центрифугируют и из всплывшего слоя выделяют фермент.

Для сравнения культивируют микроорганизм-донор (Bacillus megaterium) и определяют ферментативную активность.

Количество фермента на 1 мл культуральной среды определяют по методу ДНС, причем одну ферментную единицу определяют как количество фермента, продуцирующее 1 мг восстановленного сахара (с применением

5 мальтоэы в качестве эталона для сравнения) в 1 мин в течение 10 мин инкубационного времени. Субстрат был очень чистой амилазой, Микроорганизм-донор продуцировал

10 66,0 ферментных единиц на литр культуры.

Насыщенные культуры Е.coii CL 7001 (рСР1) продуцировали 116,6 един иц/л кул ьтуры, тогда как после культивирования (амплификации) в течение 5 ч с хлорамфениколом и с

15 последующим культивированием в течение

15 ч без хлорамфеникола бактерии Е.coti CL

7001 (pCP 1) продуцировали 84,5 единиц/л.

Это показывает, что метод насыщенных культур обеспечивает достаточное повыше20 ние продуцирования фермента.

Фермент, продуцированный бактериями Е.coli С1 7001 (рСР1), идентифицированный как альфа-амилаза, имеет следующие свойства. Он расщепляет и амилазу и ами25 лопектин на глюкозу, мальтоэу и мальтотриозу, главным образом мальтозу, и он расщепляет циклодекстрин и мальтотриозу на глюкозу и мальтозу. Он расщепляет пуллулан на паноэу и/или изо-панозу.

30 П.р и м е р 2. Клонирование теплостойкого гена альфа-амилазы.

Микроорганизмом-донором был исходный штамм Baciilus, выделенный из компоста и идентифицированный как Bacillus

35 coagulans. Он продуцирует теплостойкую альфа-амилазу и отличается следующими микробиологическими признаками: морфология: палочки (0,6 — 1 х 2,5-5,0 мкм), подвижные, грамположительные и

40 грамотрицательные, споры центральные или терминальные, не деформированные; питательный бульн: хороший рост; питательный скошенный агар: хороший рост, нитевидные, раскидистые, кремово45 белые; потребление органических кислот; лимонной — положительная реакция,малоновой — отрицательная; желатин; ожижение;

50 продуцирование ацетилметилкарбинола (ацетаина): положительная; гидролиэ о-нитрофенилагалактозида; положительная; восстановление нитратов: положитель55 ная, может получать газ; каталаэная реакция: положительная, продуцирование индола: отрицательная; декарбоксилазная реакция: на лиэин— отрицательная орнитин — отрицательная, аргинин — отрицательная;

1838410 образование сероводорода . отрицательная; потребление углеводородов: потребляет; пуллуман потребляет на минимальной среде; потребление многоатомных спиртов; потребляет глицерин, сорбитол, маннитол, инозитол, не потребляет адонитол, дульцитол; уреолиз: отрицательная; потребление лецитина: отрицательная; оптимальная температура роста: 50 С; максимальная температура роста: 55—

60ОС; минимальная температура роста, 15—

25 С; потребность в кислороде: аэробный и анаэробный, Штамм сдан»а хранение в NCIB 12 февраля 1980 r как NCIB N 11571.

ДНК экстрагировали и подвергали действию Е,cali RI; lindlll; PStt; Salt; BamHI u

BglIl. Только Bgi и мог.произвести много фрагментов в широком диапазоне молекулярных весов. Однако, можно было получить фрагменты с Е,coli Rl npu концентрации хлорида натрия менее 50 мМ.

Поэтому применяют Е.соИ Rl äëÿ получения фрагментов для клонирования в Е.соИ Rl переносчика лямбда ДНК (лямбда JM 781).

А. Ограничение ДНК В.coagutans и ДНК лямбда NM 781, 1,25 r ДНК лямбда NM 781 разрезают одной единицей Е,coli Rl в 25 мкл следующего буферного раствора: 10 мМ Трис-HCI (pH=7,5), 10 мЫ 2-серкаптоэтанола. 10 мМ сульфата магния и 100 MM хлорида натрия, 1 мкг ДНК В,coagulans разрезают,тем же ферментом в аналогичном буферном растворе за тем исключением, что концен:рацию хлорида натрия понижают до 50 MM.

Инкубацию продолжают 2 ч при температуре 37 С, и реакцию останавливают нагреванием при температуре 75 С в течение 10 мин. Полноту ограничения контролируют методом электрофореза в 1 -ных агарозных гелях.

В, Связывание и выделение рекомбинатных фагов, Ограниченные ДНК смешивают и связывают с применением двух единиц Т4 ДНК лигазы в смеси, содержащеи 50 мМ TpucHCI (pH=8), 10 MM сульфата магния, 10 мМ

2-меркаптоэтанола и 0,1 мМ АТФ. Реакцию продолжают 10 — 15 ч при температуре 10 С.

После связывания аликвотные части 0,2 мкг

ДНК смешивают с АТФ для получения конечной концентрации 10 М, Эти аликвотные части подвергают инкапсидации in vitro и применяют для инфицирования штамма

НВ :01 Ес.соИ. Было получено около 1,6 х

10 ПОЕ (пятнообраэу|ощих единиц) на 1 мкг

5 лямбда ДНК. Некоторые из этих фагов проя вля ют ам ил азную активность (обнаружение амилазной активности на чашках Петри и выделение и очистку фаза — см, пример 1).

Наблюдалось довольно большое содер10 жание продуцирующих амилазу фагов (i в

400). Один был отобран и обозначен как лямбда NM 781 альфа Amyl. Он сдан на хранение в Национальную коллекцию промышленных бактерий 12 февраля 1980 r. под

15 номером NCIB N.* 11572.

С. Повторное клонирование гена амилазы из лямбда NM 781 альфа Amyl в плазмиду рВ R 322.

1 мкг ДНК лямбда NM 781 альфа Amyl u

20 такое же количество ДЕК из плазмиды pHR

322 разрезают Е.coli Rt nðè обычных условиях. Связывание и трансформацию выполняют по методике, описанной в примере 1.

Колонии Е. coll НВ 101. содержащие реком25 бинантную плазмиду, обнаруживают по амилазной активности. Одна такая колония отобрана и обозначена Е, coli CL 7002 (рСр2), Она сдана на хранение в Национальную коллекцию промышленных бактерий 12

30 февраля 1980 г. под номером NCIH N

11573.

Амплификация гена.

Амплификация кодирующего амилазу гена лямбда NM 781 альфа Amyl и продуци35 рование амилазы осуществляют следующим образом. Бактерию-хозяина (F.coli НВ 101) культивируют в LH среде с 2 мМ хлорида . магния при температура 37 С до достижения оптической 0,3 (650 нм), Затем добавля40 ют лямба NM 781 альфа Amyl, при этом количество фагов было рассчитано так, чтобы множественность заражения составляла приблизительно 1 — 2, т,е, один или два фага на одну бактериальную клетку. Затем про45 должают культивирование при энергичном перемешивании при температуре 37 С до понижения оптической плотности. Когда оптическая плотность понижае ся ниже 0,5, культуру собирают и помещают на лед. Kynb50 туру: центрифугируют и всплывший слой испытывают на амилазную активность.

Амплификацию и продуцирование фермента E.coli 7002 (рСр 2) осуществляют по методам насыщенной культуры и амплификации хлорамфениколом, как описано в примере 1, Амилазную активность определяют по методу ДНС и в лизате фага, и в культурах

Е.coli, содержащих рекомбинантные плазмиды.

1838410

10

20

30

40

50

В случае применения фага (лямбда NM

781 альфа Amyl) весь фермент выделяется вследствие лиэиса клеток и, следовательно, находится в культуральной среде, B случае применения плазмиды большая часть фермента (96,) находится в клетке.

D. Повторное клонирование в дериват фага лямбда, способный к лизогенизации

Е.coll

Применяют бактериофаг лямбда Т4 lig

С(857 warn barn sam (лямбда NM 989).

Этот фаг содержит ген ДНК лигазы бактериофага Т4 и способен к лизису Е.coli, Кроме того, он содержит теплочувствительный ген иммунитета и две амбер-мутации в гене Е и гене S соответственно. Мутация гена не дает бактерии лизоваться под действием инфекции этим фагом. Целью субклонирования была замена гена ДНК лигазы геном, кодирующим амилаэу, ДНК фага и плазмиды (рСР 2) были разрезаны Е, coli Ri и фрагменты были связаны.

ДНК фага, полученная в результате лигации, была затем упакована in vitro и пятна иссле.довали визуально путем посева на штамм

Е,coli Sup Е, Sup F. Пятна, показывающие амилазную активность, собирают и фаг очищают по вышеописанной методике.

Затем этот фаг применяют для лиэогенизации штамма Е.coli С1 600 (С1 1205) по обычной методике, Лизогенные колонии проверяют визуально на крахмалсодержащей среде с применением метода окрашивания иодом. Полученный при этом штамм обозначен Е.coli CL 7003 (лямбда альфа

Amyl) и сдан на хранение в Национальную коллекцию промышленных бактерий 6 марта 1980 года под номером MCIB N. 11586.

Амплификацию гена осуществляют следующим образом, Лизоген выращивают при температуре 32 С. в среде LB до плотности

0,8 при 650 нм, затем его центрифугируют и клетки суспендируют в свежей среде LB, предварительно нагретой до температуры

45 С. Потом культуру инкубируют в водяной бане при температуре 45 С в течение 15 мин с целью индуцирования литического цикла (так как ген иммунитета является теплочувствительным).

Затем продолжают инкубацию при энергетичном перемешивании при температуре 37ОС в течение 3 ч, после чего определлют амилазную активность во всплывшем слое и в клетках.

Выделение и характеристика амилазы, полученной из ля мбда NM 781 альфа Amyl, Е.coli CL7002 (pCP 2) и Е/coli Ci 7003 (лямбда альфа Amyl).

Как в примере 10 применяют метод "осмотического удара" для выделения фермента. Кроме того, так как фермент согласно этому примеру является термостабильным, он мог быть далее очищен путем добавления к водному 10 мМ раствору Са, подогрева раствора до 80 С и выдержки в течение 10 мин, в результате такой обработки все протеины Е.coll осаждаются и можно получить альфа-амилаэу в исключительно чистой форме, фактически никакие другие ферменты не присутствуют. была определена специфичность альфа-амилазы, она активна к амилазе и крахмалу, продуктами гидролиза являются глюкоза, мальтоза и мальтотриоза со следами компонентов с большим молекулярным весом. Этот фермент не активен к циклодекстрину, Была также исследована теплостойкость фермента и оказалось, что она очень высока. Оптимальная температура активцости с 0,5 амилозы находится.в интервале

80 — 90 С. С 8 -ным растворимым крахмалом оптимальная температура составляет около 100ОС, Пример 3. Субклонирование плазмиды рСР 2 в плаэмиду рС 194 и экспрессия новой плаэмиды в Bacillus subtilis.

Настоящий пример иллюстрирует методику, по которой рекомбинантной ДНК, полученная в соответствии с настоящим изобретением, может быть экспрессирована в бактерии-хозяине, отличной от Е.coll, а именно в штамме Bacillus subtilis.

Плазмида рСР 2 (из примера 2) содержит фрагмент размерами 3,31 килобаз из донора. В,coagulans, кроме того, плазмида характеризуется тем, что сообщает сопротивляемость к ампициллину и тетрациклину и содержит два участка ограничения для каждого из R.coli Rl и Hindlll, Плазмиду рСР

2 расщепляют на 4 фрагмента Е/coll Rl u

Hindlll, обрабатываютлигазой и применяют для трансформации НВ 101, как в предыдущих примерэх, Полученные новые плазмиды, обозначенные как рСР 2,3, имеют фрагмент 2,64 килобаз ДНК В.coagulans, причем указанный фрагмент содержит ген, кодирующий альфа-амилазу. Плазмида рСР 2,3 имеет один участок для каждого Е.coli Rl u Hindlil и придают им ампициллиновую и тетрациклиновую сопротивляемость.

Для следующей стадии выбирают плазмиду рС 194, которая известна своей способностью к репликации себя в Bacillus

subtilis. Плазмида рС 194 придает хлорамфеникольную сопротивляемость и имеет один участок Hindlli, рСР 2,3 и рС 194 были обработаны

Ни сИ!! смешаны и легированы для образования новой плазмиды, обозначенной рСН

18384 10

Итого (ед/л)

150

Составитель С. Светлышев

Редактор В. Трубченко Техред М. Моргентал Корректор М. Шароши

Заказ 2905 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

7, содержащей кодирующий альфа-амилэqy ген и имеющей хлорамфеникольную и

d ïèöèëëèuî0óþ сопротивляемость, хотя уровень хлорамфеникольной сопротивляе,мости Е,соИ бып низок. Как и прежде, препарат был применен для трансформации

F,coll НВ 101.

Штамм мутанта В subtllls, обозначенный В 1133, не проявляющий альфа-амилазной активности, был затем обработан в соответствии с методом для образования протопластов. Затем протопласты трансформируют рСН 1 по методике трансформации а среде полиэтиленгликоля Чана и

Когана.

Г1осле этого протопласты инкубируют в богатой среде в течение 1,5 ч, чтобы плазмида B бактерии экспрессировала сопротивляемость к хлорэмфениколу.

Затем протоплэсты сеют на регенерационную среду, к которой добавляют хлорамфеникол в количестве 20 мкг/мл. После инкубации в течение двух суток при температуре 37 С появляются колонии трансформированных клеток, это колонии, проявляющие альфа-амилазную активность, которые могут быть обнаружены окрашиванием парами иода. Один клон, обозначенный

5 В.subtills CL 8001 (pCH 1), сдан на хранение

13 января 1981 r, под номером NCB М

116929. Исходный штамм QB 1133 тоже сдан на хранение 13 января 1981 г. под номером NClB М 11628. l0 В.subtilis CL8001(pCH 1) стабилен только в присутствии хлорамфеникола. Он может быть применен для продуцирования альфа-амилазы путем культивирования в среде, содержащей хлорамфеникол (20

15 мкг/мл). Альфа-амилаза может быть легго выделена из культуральной жидкости.

После культивирования в течение ночи в присутствии хлорэмфеникола количество продуцированной альфа-амилазы было сле20 дующим;

Всплывший слой Клетки (ед/л) (ед/л)

136 14