Способ получения декстраназы

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4486435/13 (22) 26.07.88 (46) 15.04.93. Бюл. М 14 (71) Институт микробиологии АН БССР и

Научно-производственное объединение

"Биотехнология" (72) А.Г.Лобанок, О.Н,Зинченко, Г.А.Моподова, Т.И.Данилова, А.К.Хасирджева, B.È.Øèëo, 3.А.Рожкова, Е.И.Беленькая, И.И,Кюдулас, О.Е.Анченко и В.И.Лауцюс (56) Авторское свидетельство СССР

М 896069, кл. С 12 N 15/00, 1980.

Авторское свидетельство СССР

М 1756355, кл. С 12 N 9/64, 1987. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕКСТРАНАЗЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения декстраназы из микромицетов, и может

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения декстраназы иэ микромицетов. Фермент может найти применение в пищевой промышленности при переработке сахарной свеклы, пораженной слизистым бактериоэом и для приготовления профилактических средств против кариеса зубов.

Целью изобретения является упрощение способа и ускорение процесса за счет сокращения сроков культивирования продуцента.

Способ заключается в том, что продуцент Aspergillus Insuetus ВКПМ F342 выращивают на оптимизированной среде следующего состава в мас.%: культуральная жид."ость Leuconostoc mesentегоides ВКПМ. Ы „1808873 А1 (51)5 С 12 и 9/46, 1/14//(С 12 N 9/46, С 12 R 1/66) применяться в пищевой промышленности и медицине. С целью упрощения способа и ускорения процесса эа счет сокращения сроков культивирования продуцента в питательную среду, на которой выращивают микромицет Aspergillus Insuetus ВКПМ F342 вносят в качестве индуктора синтеза декстраназы и источника углерода культуральную жидкость Leuconostos mesentегоldes ВКПМ В-581 с содержанием декстрана 24-32 мг/мл и редуцирующих веществ

30-60 мг/мл. Преимущество предлагаемого способа заключается в доступности и легкости приготовления индуктора, снижении его концентрации в питательной среде в 1,5-2 раза, сокращении сроков культивирования продуцента в ферментере на 18 ч при сохранении высокого уровня декстраназной активности до 80 ед./мл. 6 табл.

СО

8-581 10-12; МаКОэ — 0,3; КС! — 0,05; MgS04.

7НзΠ— 0,05; KHzPO4 — 0,1; автолизат дрож- р жевой или ферментолизат биомассы микроорганизмов — 0,2-0,5; рН 5,0-5,2 (вода— остальное), Культивирование ведут в течение 84 часов в колбах на качалке (180 об/мин) или 42-48 часов в ферментере при поотоянном перемешиввнии (200 об/мин). );» аэрации — 1 объем воздуха/1 обьем сре- д ды/мин и температуре от 29 до 31 С, В качестве посевного материала используют 48часовой инокулюм, полученный в колбах на питательной среде вышеприведенного состава, Таким образом, декстран вводится в питательную среду непосредственно в составе культуральной жидкости Leuconostoc

1808873

mesentегоides беэ его предварительного мг/мл, редуцирующих веществ — 30 мг/мл, выделения и очистки. Причем используют Наряду с декстраном она содержит автоликультуральную жидкость определенного, зованные клетки бактерий, фруктозу, обраэкспериментально обоснованного состава, зовавшуюся из сахарозы a процессе а именно с содержанием декстрана от 24 до 5 синтеза декстрана, а также другие продукты

32 мг/мл и концентрацией редуцирующих жизнедеятельности бактерий L.mesenteвеществ от 30 до 60 мг/мл. Кроме того, мно- roides, которые могут служить дополнительгократными экспериментами установлено, ным источником углерода для продуцента что культуральная жидкость L.mesente- декстраназы. Содержание декстрана в nuroldes является хорошим индуктором синте- "0 тательной среде, приготовленной на основе за декстраназы.лишь для А.insuetus ВКПМ 1 mesentегоides составляет 0,25, В контF342, - . рольных вариантах в качестве индуктора исП ример 1. Получение культуральной пользуют декстран в концентрации 025 и жидкости L.mesentегоides. 0,5 .

Елезептего1дез культивируют на пита- "5 Дестраназную активность измеряют в тельной среде следующего состава (%): KCI глюкозных единицах, Результаты приведе— 0,01;: gS04 7Н20 — 0,01; КН2Р04 — 0,1; ны в табл.2.

Ма НРОд 12HgO — 0,25; NH4CI — 0,05; пеп- Из представленных результатов видно, тон — 0,02; дрожжевой экстракт — 0,1; саха- что грибы Penlcillium piscarlum, Penlcilllum роза или меласса — 10, вода — остальное. 20 funiculosum, Spicaria vlolacea и дрожжи

Культивирование осуществляют в колбах Lipomices sp. накапливают максимальное

Эрленмейера без аэрации и перемешива- количество фермента на средах с декстрания при температуреот24до26 С. Количе- ном в количестве 0,5%. На среде с культуство декстрана в культуральной жидкости ральной жидкостью активность гораздо определяют,осаждаяегоэтиловымспиртом 25 ниже, Культивирование А insuetus ВКПМ Fи высушивая до постоянного веса при 342 на питательной среде с10% культураль105ОС. Результаты опыта приведены в . ной жидкости L.mesentегоides позволяет табл,1, достичь такого же уровня накопления деПредставленные в табл.1 результаты кстраназы в среде, как при использовании в показывают, что при культивировании на 30 качестве индукторадекстрана. среде с мелассой(отход сахарной промыш- Пример 3. Культивирование А.insuленности, содержащий сахарову) образова- etus на средах с декстраном и культуральние декстрана идет хуже, чем на среде с ной жидкостью L.mesentегоides BKllM Всахарозой, Максимальное количество пол- 581. исахарида в обоих случаях накапливается к 35 Культивирование проводят в колбах 3р48 часам культивирования и составляет на ленмейера на качалке при температуре от сахарозе от 29,8 до 30,0 мг/мл, на мелассе 39 до 31 С в течение 4 суток на среде, содердо 17,2 мг/мл. - ., жащей кроме индуктора следующие компоПример 2, Культивирование различ- ненты (): автол изат дрожжевой — 0,3; ных продуцентов декстраназы на питатель- 40 йайОз — 0,3; КН Р04 — 0,1; KCI — 0,05; ных средах с декстраном и культуральной IgS04 7HzO — 0,05; вода — остальное, рН жидкостью L.mesentегоldes. 5,0-5,2. В качестве индуктора используют

B качестве продуцентов используют на- йолиглюкин или культуральную жидкость иболее активные в образовании декстрана- 48- часовой культуры Lmesentегоides, ползы культуры Реп!сИ}1цв plscarium БИМ 45 ученную на питательной среде с сахарозой

Г-102, Penlcillium funlculosum 15, Splcarla или мелассой, Результаты представлены в .vlolacea ВКПМ F464, Asperglllus !пsuetus табл,3.

ВКПМ F342 и Llpomyces зр.. Из данных, представленных в табл.3, Культивирование НроДуцентОв прово- видно, что при культивировании продуцента дят в колбах на питательных средах опти- 50 на среде с полиглюкином максимальный мального для кйждого йродуцента состава, уровень активности (от 80 до 83 ед/мл) .наВ качестве индуктора используют культу- блюдается только при концентрации этого ральную жидкость L.mesentегоldes в коли- полисахарида в среде от 0,5 до 1,0 . Исчестве Л%;которуюполучают,культивируя пользование в качестве индуктора культубактерию в течение 48 ч на среде с 10 55 ральной жидкости L.mesentегоides, сахарозы. Перед добавлением в питатель- полученной на среде с сахарозой, позволяет нуюсреду культуральнуюжидкостьавтокла- достичь такого уровня активности уже при вируют. Концентрация декстрана в концентрации декстрана 0;26 (10 кч; ькультуральной жидкости составляет 25 туральной жидкости). Оптимальной для накопления декстраназы концентрацией

1808873

15

35

50 культуральной жидкости в питательной среде является 10-12%. Снижение или повышение ее содержания в питательной среде для культивирования А,lnsuetus приводит к уменьшению активности декстраназы.

Культуральная жидкость L.mesenteioldes, полученная на питательной среде с мелассой, не обеспечивает активный синтез декстраназы А,insuetus и не может быть использована в качестве индуктора, Пример 4, Культивирование

А.insuetus на питательной среде с культуральной жидкостью L.mesentегоides различного состава.

В опытах используют полученную на питательной среде с сахарозой 48-часовую культуральную жидкость L.mesentегоides

ВКПМ В-581, различающуюся по содержанию декстрана (от 20 до 32 мг/мл) и редуцирующих веществ (от 30 до 100 мг/мл), Культуральную жидкость вносили в питательную среду в количестве 10%. Результаты представлены в табл.4, 1

Из таблицы видно, что определяющее значение имеет концентрация декстрана в культуральной жидкости, При содержании декстрана ниже 24 мг/мл декстраназная активность в среде не достигает своего максимального значения, Концентрация декстрана от 24 до 32 мг/мл позволяет достичь уровня активности от 78,0-82,0 едlмл. Существенное значение имеет и концентрация редуцирующих веществ (P B). В примерах 3-7 она находится в интервале от 38 до 60 мг/мл и не влияет отрицательно на накопление декстраназы.

Вслучаях,,когда концентрация PB составляет от 70 до 100 мгlмл, происходит репрессия синтеза декстраназы, даже если концентрация декстрайа при этом оптимальная.

Пример 5, Культивирование

А.insuetus ВКПМ F-342 в ферментере, Состав питательной среды (в мас, ): культуральная жидкость L.mesentегоides—

12 или полиглюкин — 0,5; автолизат дрожжевой — 0,3; ИаКОз — 0,3; КНгРОд — 0,1; KCI—

0,05; MgSO4 7Н20 — 0,05; воды — остальное, рН 5,0-5,2. Аэрация — 1 объем воздуха/объем среды/мин, Перемешивание — 200 об/мин, температура культивирования 30»»-1О. Результаты эксперимента и редставлены в табл,5.

Представленные в табл,5 результаты показывают, что при использовании в качестве индуктора культуральной жидкости

L.mesentегоides синтез декстраназы происходит более интенсивно и максимум накопления фермента наблюдается к 42-48 часам, в то время как в известном способе максимал ьный уровень активности декст раназы—

63-80 ед/мл удается достичь за 60-70 часов культивирования в ферментере.

Пример 6. Культивирование А.insuetus ВКПУ F-342 в колбах, Культивирование проводят в колбах Эрленмейера объемом 250 мл со 100 мл питательной среды такого же состава, как в примере 5, на качалке со скоростью 180 об/мин при температуре 30» 1". Результаты приведены в табл.6, Из данных, представленных в табл.б, видно, что и при культивировании в колбах на питательной среде с к,ж. L.mesentегоides максимум накопления декстраназы наблюдается раньше, чем при культивировании на питательной среде с полиглюкином, Таким образом, преимуществами предлагаемого решения по сравнению с известным являются; доступность и легкость приготовления индуктора; снижение его концентрации в питательной среде в 1,5-2 раза, сокращение сроков культивирования продуцента в ферментере на 18 ч и в колбах на 12 ч при сохранении высокого уровня декстраназной активности..Формула изобретения

Способ получения декстраназы, предусматривающий глубинное культивирование продуцента Aspergillus insuetus ВКПМ

F-342 в аэробных условиях на питательной среде, содержащей индуктор декстраназы, автолизат дрожжевой, минеральные соли и воду, до максимального накопления активности декстраназы, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и ускорения процесса за счет сокращения сроков культивирования продуцента, в качестве индуктора синтеза декстраназы и основного источника углерода используют 9-15 мас. культуральной жидкости бактерии Leuconostoc mesentегоtdes ВКПМ В-581 с содержанием декстрана 24-32 мг/мл и редуцирующих веществ 30-60 мг/мл.

1808873

Таблица 1

Динамика накопления декстрана при культивировании

L. mesentегоides на среде с сахарозой и мелассой

Таблица 2

Культивирование различных продуцентов на питательных средах с декстраном и культуральной жидкостью

1 mesentегоides ВКПМ В-581

Таблица 3

Культивирование A,insuetus на средах с различными индукто рами

1808873

Продолжение табл,З.

Таблица 4

Таблица 5

Динамика накопления активности в культуральной жидкости А insuetus при культивировании в ферментере

Культивирование А lnsuetus на питательной среде с культуральной жидкостью LëïåsåìåãîÛås различного состава

12

1808873

Продолжение табл.5

Таблица 6

Динамика накопления декстраназы при культивировании А. insvetvs

ВКПМ F-342 в колбах

Составитель В,Соина

Редактор B.Tðóá÷åíêî Техред М.Моргентал Корректор М.Петрова

Заказ 1258 Тираж. Подписное

ВНИИПЙ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r, Ужгород, ул.Гагарина, 10".