Способ лечения сахарного диабета и способ получения имплантата для лечения

 

Изобретение относится к хирургии и терапии и может быть использовано при лечении сахарного диабета. Способ лечения основан на внутримышечной имплантации определенного количества перививаемой культуры клеток доброкачественной инсулиномы человека. Способ получения имплантата для лечения сахарного диабета включает культивирование клеток инсулиномы и формирование банка культуры При культивировании клеток измеряют их количество и содержание инсулина в культуральной среде через заданные промежутки времени и по полученным данным определяют производительность инсулина данной культурой клеток, по которой определяют объем имплантата Изобретение позволяет повысить эффективность лечения путём увеличения ремиссий и точности определения объема имплантата. 2с и 1 зпф-лы

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН

К ПАТЕНТУ

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 5025634/14 (22) 02.03.92 (46) 15.12.93 Бюл. М() 45-46 (76) Лифшиц Юрий Зиновьевич; Кожара Светлана

Павловна; Ландау Светлана Михайловна (54) СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ САХАРНОГО ДИАБЕТА

И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИМПЛАНТАТА ДЛЯ

ЛЕЧЕНИЯ (57) Изобретение относится к хирургии и терапии и может быть использовано при лечении сахарного диабета. Способ лечения основан на внутуимышечной имплантации определенного количества перививаемой культуры клеток доброкачественной (is) ЦК (и) 200424 71 (51) 5 А 61 К35 39 инсулиномы человека. Способ получения имплантата для лечения сахарного диабета включает культивирование клеток инсулиномы и формирование банка культуры, При культивировании клеток измеряют их количество и содержание инсулина в культуральной среде через заданные промежутки времени и по полученным данным определяют производительность инсулина данной культурой клеток по которой определяют объем.имплантата Изобретение позволяет повысить эффективность лечения путем увеличения ремиссий и точности определения объема имплантата. 2 с и1 зп.ф-лы.

2004247

Изобретение относится к хирургии и терапии и может быть использовано npin лечении сахарного диабета.

Известны способы лечения инсулиноэависимого сахарного диабета, включающие . имплаятацию фетальных Р -клеток внутрипеченочно или внутримышечную имплантации P -клеток новорожденных поросят.

Однако все -эти способы малоэффективны из-за короткого срока ремйссии.

Известны также способы получения имплантата для лечения сахарного диабета путем культивирования инсулин продуцирующих .клеток и формирования банка культуры. К недостаткам этих способов следует отнести низкую точность определения объема трансплантата, т.е. количество клеток, которое необходимо имплантировать конкретному пациенту, Наиболее близким по технической сущ- 20 ности и принятым за прототип является способ лечения сахарного диабета, включающий внутримышечную имплантацию клеток поджелудочной железы. Однако и этот способ имеет низкую эффективность лечения.

Из способов получения трансплантатв в качестве прототипа выбран способ, основанный на однослойном культивировании клеток инсулиномы человека сроком до 1 недели,.

Недостатком известного способа*является низкая точность определения объема тра н спл а нтата.

Задачей изобретения является повышение эффективности лечения сахарного З5 диабета путем увеличения ремиссии трансплантации и увеличения точности выбора объема трансплантата.

Поставленная задача решается тем, что в способе лечения сахарного диабета, вклю- 40 чающем имплантацию клеток поджелудочной железы, имплантируют перевиваемую культуру клеток доброкачественной панкреатической инсулиномы человека, Культуру клеток имплантируют внутри- 45 печеночно или внутримышечно, преимущественно в прямую мышцу живота в виде взвеси, например, на физрастворе, При этом количество имплантируемых клеток для конкретного пациента определяют по о0 соотношению

12 — 1

q - ., ед./тыс. сут, Аср t1 п> +пт где пср2 — среднее арифметическое

55 количество клеток культуры на интервале t>.

Величину q измеряют несколько раз и среднее значение заносят в паспорт или сертификат культуры при формировании банка.

N —, 0

q где N — количество имплантируемых клеток, тыс.;

Q — суточная потребность пациента в инсулине, ед.: р †. суточная производительность инсулина 1 тыс. клеток, ед, В способе получения имплантата для лечения сахарного диабета, включающем однослойное культивирование клеток инсулимы человека и формирование банка культуры, при культивировании клеток измеряют их количество и содержание инсулина в культуральной среде через заданные промежутки времени и по полученным данным определяют производительность инсулина данной фракции культуры, по которой вычисляют количество клеток культуры, необходимое для приготовления имплантата конкретному пациенту.

Интервалы времени, через которые измеряют содержание инсулина в культуральной среде могут быть любые, однако предпочтительно задавать их в пределах от одних до нескольких суток. Это обеспечивает более высокую точность вычисления суточной производительности инсулина клетками, по которой определяется объем имплантата. При этом необходимо из учитывать непрерывный рост количества клеток в культуральной среде и для расчетов использовать их среднеарифметическое значение на соответствующем временном интервале.

Способ получения имплантата осуществляют следующим образом. У длительна наблюдаемого больного с доброкачественной панкреатической инсуломой выполняют энуклеацию опухоли; Инсулиному измельчают. По стандартной методике выделяют. культуру клеток инсулиномы и культивируют на "матросах" в среде МЕМ или ДМЕМ, В процессе культивирования определяют суточную производительность инсулина заданным количеством клеток (1 тыс., 10 тыс., и.т,д;) данной культуры. Для этого измеряют начальное количество клеток п1 и содержание инсулина l1. в культуральной среде, Через интервал времени tq (от одних до нескольких суток) вновь измеряют коли-, @ство клеток пг и содержание инсулина I2 и по полученным данным вычисляют суточную производительность инсулина клетками q по соотношению

2004247

N - —, тыс., 0 р

20 ю т амбулаторно, периодически определяя ч его суточную потребность в инсулине, которая начинает снижаться на 7-е — 10-е сут сле имплантации. Через 2-3 мес больные бычно отказы,ваются от приема инсулина, 40 либо его потребность стабилизируется на а низком уровне 8-20 ед. в сутки. н

Пример 1 конкретного получения имплантата, У больной Н„и/б N.. 10713, и наблюдаемой в течение 7 лет с установлен- 45 л ным диагнозом — доброкачественная панк- л реатическая инсулинома 19.03.91 г. и и роизведена энуклеация опухоли.

Взят фрагмент опухоли массой 5,0 r, из которого получен банк культуры клеток ин- 50 суломы по следующей методике. Фрагмент опухоли измельчили до фрагментов размером 1-2 мм, Трехкратно промыли средой в

Ига, Добавили среду Игла 5 мл, Добавили я коллагеназу до концентрации 2 мг/мл. Ин- 55 кубировали в термостате при 37 С в течение

15 мин. Произвели деэагрегацию ткани íà р магнитной мешалке при 32-37 С в течение

15 мин. Центрифугировали при 1000об/мин

10 мин. Получили фракцию ¹ 11, Ее не исПосле нарастания до монослоя на всем

"матросе" клетки перевивают на новый .

"матрас". а заросший "матрас" направляют для формирования банка культуры. путем программного замораживания клеток и хра- 5 нения в жидком азоте.

Способ лечения сахарного диабета осуществляют следующим образом. Путем тща.тельного обследования больному проводят коррекцию гликемии на аппарате "искусст- 10 венная поджелудочная эндокринная железа", например на "Биостаторе" фирмы

"Mlles" (США). (ФРГ) и уточняют суточную потребность в инсулине данного пациента и определяют необходимое для имплантации l5 количество клеток инсуломы по соотношению где N — количество имплантируемых клеток, тыс.;

0 — суточная потребность пациента в инсулине ед.; 25 р — суточная производительность инсулина 1 тыс. клеток имеющейся в банке культуры, ед.

Забирают из банка культуры необходимое количество клеток N, готовят из них 30 имплантат в виде взвеси на 15-30 мл физраствора и с помощью одноразового шприца вводят имплантат пациенту внутримышеч- но, например в прямую мышцу живота.

После имплантации больного наблюда- 35 пользовали. Добавили свежей среды с коллагеназой, дезагрегация на магнитной мешалке при 32-37 С 15 мин, Центрифугировали в течение 10 мин при 1000 об/мин. Получили осадок клеток — это фракция N. 2. Францию

N. 2 клеток дважды отмыли средой Игла и оставили в холодильнике до употребления.

Добавили свежую среду Игла с коллагеназой и приготовили соответственно фракции, клеток М 3 и N. 4. Каждую фракцию соответственно дважды отмыли средой Игла, Все фракции М 2, N. 3, М 4 объединили и высеяли на один маленький "матрас" на среду

ДАЕМ (Дульбенко MEM) с 10 сыворотки эмбриона, предварительно проверенной на токсичность на перевиваемых СУ1 клетках. почки обезьяны, В культурах клеток наблюдали три типа клеток: зпителиальные, фибробластоподобные и фибробласты. Клетки наросли до монослоя эа 14 дн и были перевиты на другой "матрас", Оставшийся после пересева "матрас" дорос до полного монослоя за 4 нед и его вновь перевили на следующий "матрас". На третьей неделе роста культуры было измерено содержание инсулина 11 и количество клеток и> на первом

"матрасе". Получены величины l> - 2172 ед. п1 = 700 тыс. Через семь суток измерения повторены. Получены величины b =3838 ед., п2 = 10 кл. Из соотношения q - полб 2 I1

«p учили ql = 0,28 ед,/тыс. в сутки. Аналогичные измерения и вычисления для матрасов

М 2, йг3 и М 4 дали р = 0,33; рз =0,26 и

q4 = 0,35, Культивировали клетки инсуломы еловека в течение 3 мес и провели 3 переивки клеток. Из полученных 4 х полностью аросших до полного монослоя матрасов формировали банк путем проц земного эаораживания клеток и хранения в жидком зоте. В сертификат банка занесено средее значение qcp =0,3. Следует отметить, что тогрешнасть измерения количествз клеток о нашим оценкам может лежать в предеах + 10 тыс., так как измерения проводи= ись по площадям матрасов и зависят. от лотности монослоя.

П р и и е р 2. Больной 3., 1950 г.р, и/б

7248, болеет сахарным диабетом 8 лет, уточная доза инсулина была 70 ед. 1 риаз в утки, Поступил в клинику КНИИКиЭХ

0.05.91 r. с жалобами на похудание, голоные боли, частые гипогликемические состония. Гликемия натощак 13-14 лмоль/л. ольному проведена коррекция л;кемии на ппарате "Биостатор" фирмы "f_#_iles" США, екомендовано дробное введение инсулина, На фоне субкоменсации сахарного диаета больному 24.05.91 г. выполнена вплотzuv4247 рансплантация клеток инсулиномы человека.

По соотно.пению Й вЂ” — — было подсчитана

ñ1 необходимое для имплантации количество клеток и --- — - 233 тыс. Иэ банка культуры

70 5

0,3 клеток взято и разморожено примерно 230250 тыс. клеток. Приготовлена взвесь иэ этих клеток на 23 мл физраствора и с помощью одноразового шприца введена в 10 прям ую мышцу живота пациента.

В течение первой недели после имплантации потребность в инсулине у. больного оставалась прежней. Через 4 нед — потребность в инсулине 8 ед. в сутки, а через 14 нед 15 больной отказался от инъекций инсулина, Наблюдается амбулаторно в течение 8 мес, состояние субкомпенсации, жалоб нет.

П р и и е р 3. Больной Г., 1938 г. р. и/б . N. 7231 болеет сахарным диабетом 12 лет. 20

Принимал инсулин 50-60 ед, в 2-х инъекциях в сутки. Поступил в клинику КНИИКиЭХ10.04.91 г. в состоянии декомпенсации. Гликемия натощак 16-18 ммоль/л. Больному проведена коррекция гликамии на аппарате 25

"Биостатор", Выписан в состоянии субкомпенсации на дозе инсулина 46-50 ед. (3 раза). Через 2 мес в состоянии компенсации (глюкоза гатощак 6,0 ммоль/л, количество вводимого инсулина 50 ед. 1 раз в сутки) 30 выполнена аллотрансплантация клеток инсуломы человека.

По соотношению N = — подсчитано»e- .

q 5 обходимое для имплантации количество глеток и = -"- =. 166.тыс, 4,:-.,Я0

0,3

Иэ банка культуры взято и размножено примерно 160-180 тыс. клеток, з которых 40 приготовлена извесь на 20 мл фйзраствора и с помощью одноразового шприца введена в прямую мышцу живота пациента, Потребность в инсулине у больного в течение первой недели после имплантации 45 оставалась прежней; Спустя 7-10 дн у больного появилось чувство гипогликемии (глЮкоза снижалась до 2,7 ммоль/л); поэтому начали снижать количество вводимого инсулина до 18 ед. 2 раза в сутки. Через 14 нед 50

Формула изобретения

1, Способ лечения сахарного диабета,, включающий имплантацию клеток подже- 55 лудочной железы, отличающийся тем, что имплантируют перевариваемую культуру клеток доброкачественной инсуломы человека. после трансплантации наступила нормализация гликемии при дозе инсулина (простого) 18 ед. в сутки. Больной наблюдается более 7 мес, состояние удовлетворительное.

Доза инсулина от 14 до 20 ед. в сутки 2 раза, находясь на обычном режиме питания (без ограничения углеводов).

По предложенному способу выполнена аллотрансплантация культуры и-и инсулиномы 4-м больным. Из них 2 человека полностью отказались от введения инсулина (один из них принимает сахароснижающие препараты). Один больной снизил вводимую дозу инсулина на 30 ед., один больной снизил дозу инсулина на 20 ед. (тяжелая форма, осложненная микро- и макроэнгиопатией и нефропатией).

Сроки наблюдения 5 — 8 мес, Таким образом применение предложенных способов позволит повысить эффективность лечения больных с сахарным диабетом. (56) Шалимов А.А. и др. Опыт коснотрансплантации культур клеток панкреатических островков после хирургического лечения хронического панкреатита. Клиническая хирургия. 1990, N. 11, с, 1-3.

Комиссаренко В.П„Комиссаренко И,В.

Трансплантация различных видов культур эндокринной части поджелудочной железы плодов человека и новорожденных поросят больным сахарным диабетом (Тез. докл. на

10-й Всесоюзной конф, по трансплантации органов — Киев. 1985, с. 55, 56), Istet. Рапегеаз -Transplantation artif.

Pancreas workspop Voullgamenl Beach, Athens.

1980, Stuttgart, New-Зов. 1982, р, 81-82.

Morris P.l. Crey D.W., Suston R;, Pancreatik !stet Transplantation, British.

1989, vol, 46, М 1, р, 224 -241.

Шумаков В.И., Блюмкин В.Н. и др, Клиническая аллотрансплантация культур островковых клеток поджелудочной железы плодов человека. Проблемы эндокринологии,,1985, т. 32, Ъ 1, с, 18-22, Structure Function and Immunology of

Human lnsuloma Cells. Diabetes, v, 37.

September, 1988, р. 1270-1286, 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что культуру клеток имплантируют в прямую мышцу живота в виде взвеси на физрастворе, при этом количество имплантируемых клеток определяют по соотношению = О/а.

2004247

Составитель Н. Хрусталева

Редактор Г. Мельникова Техред M.Ìoðãåíòàë Корректор М. Петгг.:.=.

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Заказ 3362

Производственно-издательский комбинат."Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 10 1 где Ц - количество имплантируемых кле- диномы человека и формирование банка ток, тыс.: .культуры, отличающийся тем. что при куль

Q - суточная потребность пайиента в ин- тивировании клеток измеряют их.количестсулине, ед.; во и содержание инсулина в культуральной

q - суточная производительность инсу- 5 среде через заданные промежутки времелина 1 тыс.клеток.ед. ни и по уровню этих величин определяют производительность инсулина данной

3. Способ получения имплантата Allfl культурной клетки, по данной величине оплечения сахарного диабета, включающии ределяют количество клеток культуры, неоднослойное культивирование клеток инсу- обходимое для приготовления имплантата.

10.