Способ получения биологически активных компонентов

 

Использование: биотехнология, может быть использовано в биохимии и клинической химии. Сущность изобретения: осуществляют выделение щелочной фосфатазы, гиалуронидазы и хитиназы из ракообразных , преимущественно креветок, путем экстракции целых ракообразных и/или целых их частей водой при 1-35°С в течение 1-12 ч, обработкой полученного экстракта центрифугированием или фильтрацией, очисткой , экстракцией и удалением нежелательных веществ. 3 з.п. ф-лы, 1 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з С 12 N 9/16, 9/24, 9/26

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ количества биоактивных компо(21) 4742338/13 (22) 23.10,89 (46) 30.08,93. Бюл. ¹ 32 (31) 884721 (32) 24,10.88

1 (33) NO (71) Марине Биохемикалс А.С. (MQ) (72) Рагнар Олсен, Эвен Стенберг, Эрлинг

Сандсдален и Карл А.Алмос (NQ) (56) Comp. Biochem, Physioi. v, 80, В, 4, 801—

804, 1985.

Physioi; Lool, ч. 21, 105, 1984. . Gates В.l. and Trevis I."Purification and

characterizatioii of Carboxypeptidases А and

В from the White Shrimp Penques $etiferus"

Biochemistry, 1973, 1, ¹ 10, р, 1867 — 1874.

Изобретение относится к биотехнологии, касается способа получения биологически активных веществ, например, ферментов, таких как щелочная фосфатаза, экс.рагированных из ракообразных(Рйу!шт

arthropodes), особенно из креветок.

Преимущество способа, согласно данному изобретению, состоит в том, что биоактивные соединения можно выделить из исходного сырья, т,е. из ракообразных посредством обычной экстракции водой так, что биоактивные соединения присутствуют в растворенном состоянии, это означает, что компоненты могут быть выделены путем

"концентрирования, экстракции и фильтрации для удаления примесей.

Другое преимущество способа, согласно настоящему изобретению состоит в возможности работать с весьма незна .ительной потерей активности биоактивных компонентов, приводящей в результате к возможности выделения иэ рассола!

ЖÄÄ 1838406 АЗ (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ КОМПОНЕНТОВ (57) Использование: биотехнология, может быть использовано в биохимии и клинической химии. Сущность изобретения: осуществляют выделение щелочной фосфатазы, гиалуронидазы и хитиназы иэ ракообразных, преимущественно креветок, путем экстракции целых ракообразных и/или целых их частей водой при 1 — 35 С в течение 1 — 12 ч, обработкой полученного экстракта центрифугированием или фильтрацией, очисткой, экстракцией и удалением нежелательных веществ. 3 з.п, ф-лы, 1 ил. основного нентов, Дальнейшее преимущество упомянутого изобретения.заключается в возможности экстракции ценных в коммерческом отношении продуктов из продуктов, являющихся отходами, которые иначе требовали бы обработки для устранения загрязнения ок ружающей среды.

Дополнительное преимущество состоит в сохранении питательной ценности ракообразных.

Соответственно изобретению ценные вещества выделяют из свежего или консервированного сырья. состоящего из ракообразных, преимущественно из креветок, а такжеиз их частей продуктов, с применением воды.

Экстрагированный рассол обрабатывают соответственно данному изобретению в независимом порядке с применением одной или нескольких следующих стадий од1838406 нократно или многократно: очистка, концентрирование, экстракция и/или удаление желательных веществ, далее выделение и возможная стандартизация и стабилизация очищенных биоактивных веществ.

Консервированный исходный материал может быть доступным или в замороженном состоянии (в блоках или в индивидуальном виде), химически консервированным, например, в рассоле, консервированным посредством ферментации, силосования, сушки, облучения или добавления консервирующих средСтв.

Экстракцию соответственно изобретению можно осуществлять при использовании растворителя на основе воды, особенно чис1ой или очищенной воды при температуре в пределах 0 — 100 С,и рН в пределах 1 — 14 в зависимости от выделяемого продукта.

Наиболее благоприятные температура и рН составляет, соответственно 15 С и рН 8,1.

Операции по очистке включают прежде всего предварительное, "грубое" фильтрование первичного экстрагированного рассола для удаления нерастворимого материала в виде частиц, например, путем фильтрования или центрифугирования для получения неочищенного экстракта, далее происходят "тонкую" очистку биологически активных компонентов с применением хроматографических методов, таких как ионообменная хроматография, афин ная хроматография, гельфильтрация, или же по- добные им. Выбор метода должен зависеть от конкретных биологических и физико-химических признаков индивидуальных макромолекул, Коллоидный материал можно удалить из исходного сырья посредством добавления средства, способствующего фильтрованию, такого как поликатионы или полианионы на основе полиакриламида, также путем экстракции и/или фильтрования при образовании окончательного экстракта.

Стадии способа согласно изобретению включают концентрирование неочищенного экстракта и окончательного экстракта, которое может быть осуществлено, например, мембранным фильтрованием (поперечное фильтрование) или концентрированием при пониженном давлении. Полезно повторять операции концентрирования несколько раз во время процесса выделения и концентрировать вещества в 1 — 50 раз на каждой стадии.

Для получения стандартизованных биоактивных продуктов желаемой концентрации и активности, окончательный экстракт можно, найример, обработать посредством

55 трис-HCl буфером с добавлением 0,1-0,5 моля хлорида натрия.

Пример 1. Щелочная фосфатаза из креветок (Pandalus borealis) 12 т креветок экстрагируют 2500 л воды 8 ч при рН 8,1 и температуре 15 С. Общее содержание протеина в экстракте составило около 2,5 мг протеина/мл, уровень щелочной фосфатазы в данном экстракте составил приблизительно 2,5 единицы на 1 мг протеина, Мето измерения соответствует стандартному медиафильтрации/ультрафильтрации и, в случае необходимости, провести дополнительную операцию хроматографирования.

Окончательный продукт может быть до5 ступен в твердом или жидком виде. Стабилизацию очищен ного жидкого биоактивного продукта можно осуществлять посредством замораживания или добавления, например, солей, кислот и/или основания (для установления рН) или других обычно применяемых стабилизаторов, Продукт можно превратить в твердое состояние посредством обычно используемых процессов высушивания таких, например, как высушка вымораживани15 ем.

Для изготовления продукта с желаемой активностью на 1 r вещества обычно добавляют пригодный для применения материал, служащий разбавителем или носителем, 20 Предлагаемый способ поясняется чертежом. Блок замороженных свежих креветок экстрагируют (1) по меньшей мере 8 ч водой (рН 8,1, температура 15 С), Полученный экстракт обрабатывают путем "грубого" фильтрования (2), например, на вращающемся сите с отверстием 0,5 мм, Экстракт концентрируют (3) В 10 раз в системе поперечного (cross-flow) фильтрования. Если необходимо или желательно, экстракт может быть заморожен или высушен с помощью замораживания для промежуточного хранения (4).

Если экстракт замораживают, то перед дальнейшей обработкой его следует размо35 розить или растворить, установить требуемую температуру (5). Материал в виде частиц осаждают в резервуаре (6) посредством добавления флокулирующего средства, например, пликатиона на основе полизкри40, ламида при концентрации 0,1 г/л экстракта, Далее материал фильтруют (7) на фильтрпрессе, Осветленныи фильтрат концентрируют (8) в 10 раз в поперечной системе фильтрования. Фермент связывают с 10 л

45 Q-сефарозы в колонке (9, имеющей площадь поверхности 500 см, при скорости 8 л/ч. Колонку уравновешивают трис-НС(буфером (рН 7,2:1 мМ хлорида магния). Целевые ферменты элюируют из колонки

1838406 тоду, при котором измеряют скорость гидрализа п-нитрофенилфосфата в диэтаноламиновом буфере при 37 С. Экстракт подвергают "грубому" фильтрованию с применением вращающегося сита. (Ротосито) с отверстиями 0,5 мм.

Фильтрат концентрируют в 10 раз посредством ультрафильтрации в системе с поперечной фильтрацией, представляющей собой блок из полых полисульфоновых волокон, с пропусканием молекул до 10000 дальтон. Такая концентрация достигается без существенной утраты активности (менее 10%). Объем после упомянутого концентрирования составил около 250 л.

Коллоидные частицы удаляют из концентрированного экстракта путем прямой фильтрации после добавления поликатиона на основе полиакриламида. Применяют около 0,1 r поликатиона на 1 л экстракта, После флокуллиравания и фильтрации фло-. куллированных частиц с применением рамного фильтра, окончательный экстракт дополнительно концентрируют, Второе концентрирование производят в 10 раз в системе поперечной фильтрации, состоящей из блока полых палисульфоновых волокон с пропусканием молекул до 10000 дальтон. Объем после этого последнего концентрирования составляет и рибл изител ьно

20л, Щелочную фосфатазу связывают с 10 л

0-сефарозы (непрерывный поток) в колонке с плошадью поверхности приблизительно

500 cM, co скоростью 8 л/ч, Колонку уравновешивают трис-HCI буфером (при рН 7,2, 1 мМ хлорида магния). Нежелательные протеины элюируют трис-HCI буфером (pH 7,2.

1 мМ хлорида магния). Нежелательные протеины элюируют трис-HCI буфером (рН 7,2, 1 MM хлорида магния), к которому добавлено 0,25 мл хлорида натрия, Щелочную фосфатазу элюируют упомянутым буфером, к которому добавлено 0,4 моля хлорида натрия. Элюат, содержащий щелочную фосфатазу, концентрируют до требуемой целевой концентрации и после этого диафильтруют с использованием 0,03-малярного триэтаналаминнового буфера (рН 7,6, 3-моля хлорида натрия, 0,001 моля хлорида цинка).

Пример 2. Гиалуронидаза из креве„ток (Pandalus borealis) 12 т креветок экстрагируют 2500 л воды 8 часов при рН 8,1 и температуре 15 С. Общее содержание протеина в данном экстракте составляет приблизительна 2,5 мг/мл. Уровень гиалуронидазы измеряют па сокращению мутности при инкубировании с гиалуроновой кислотой и добавлении альбумина. Экстракт подвергают "грубому" фильтрованию

55

- равен приблизительно 6 — 8 единицамlмг протеина. Хитиназу измеряют как свободный N-ацетил-глюкозамин после разложения коллоиднога хитина хитиназой и

Й-ацетил-гл юкозаминидазой

Экстракт подвергают "грубому" фильтрованию на вращающемся сите с отверстиями 0,5 мм. Фильтрат концентрируют приблизительно в 10 раз путем ультрафильтрования с блока из полых полисульфоновых волîKQн с пропусканием Mîllекул до

10000 дальтон. Потеря активности этой ста.дии фильтрования невелика. Объем после упомянутого концентрирования составляет приблизительно 250 л.

40 с на вращающемся сите с отверстиями диаметром 0,5 мм, фильтрат концентрируют приблизительно в 10 раз посредством ультрафильтрации в системе с поперечной фильтрацией, состоящей из блока полых полисульфановых волокон с пропусканием молекул до 10000 дальтон. После этой стадии концентрации не происходит существенного снижения активности.

Окончательный объем продукта на данной стадии равен 250 л.

Коллоидальные частицы удаляют иэ концентрированного экстракта путем прямой фильтрации после добавления поликатиона на основе полив риламида.

Применяют приблизительно 0,1 г фильтрующего средства на 1 л экстракта. После флокулиро.вания и удаления частиц на фильтр-прессе, фильтрат концентрируют еще в 10 раз в системе поперечной фильтрации, состоящей из блока полисульфоновых полых волокон с пропусканием молекул до

10000 дальтон, Окончательный объем после упомянутого концентрирования составляет приблизительно 20 л..

Гиалуронидазу связывают приблизительно с 10 л G-сефарозы (непрерывный поток) в колонке с площадью поверхности 500 м, со скоростью 8 л/ч. Колонку уравновешивают трис-HCl буфером (рН 7,2, 1.ммаль хлорида магния). Гуалоуродиназу эл юируют трис-HCI буфером (рН 7,2, 1 ммоль хлорида магния), к которому добавлена 0,25 моля хлорида натрия.

Элюат, содержащий гуалоруонидазу, доводят до требуемой окончательной концентрации, затем высушивают посредством вымораживания.

Пример 3. Хитиназа из креветок (Paodalus borealis).

12 т креветок экстрагируют 2500 л воды при рН 8,1 и температуре 15 С, Общее содержание протеина в этом экстракте составляет приблизительно 2,5 мг протеина в

1 мл. Уровень хитиназы в данном экстракте

1838406

Коллоидные частицы удаляют иэ концентрированного экстракта путем прямой фильтрации после добавления поликатиона на основе полиакриламида, На 1 л экстракта берут 0,1 г вспомога- 5 тельного вещества, способствующего фильтрованию. После флокуллирования и удаления частиц на фильтр-прессе, фильтрат концентрируют еще в 10 раз в системе поперечного фильтрования из полых пол- 10 исульфоновых волокон с пропусканием молекул до 100000 дальтон. Окончательный объем после упомянутого концентрирования составляет приблизительно 20 л, Хитинаэу связывают с 10 л Q-сефарозы 15 (быстрый поток) в колонке с площадью поверхности 500 м со скоростью 8 л/ч, Колонку уравновешивают трис-НО буфером (рН

7,2, 1 ммоль хлорида магния), Хитиназу элю: ируют трис-HCI буфером (рН 7,1, 1 ммоль 20 хлорида магния) с использованием солевого градиента в пределах от 0,1 до 0,5 моля хлорида натрия, Элюат, содержащий хитиназу, концентрируют до требуемой окончательной концентрации, затем высушивают 25 вымораживанием. .В следующей таблице заявитель приводит данныЕ удельной активности первоначально и после выделения из колонки с

0-сефарозой ферментов согласно приме- 30 рам. Выход приведен в процентах содержания фермента в исходном водном материале.

После нескольких повторов стадий фильтрации, концентрирования и очистки 35 удельная активность щелочной фосфатазы в конечном счете доводится до 2200 ед/мг.

Как следует из изложенного выше, удельная активность, достигнутая для щелочной фосфатазы, является высокой, что 40 указывает на получение очень чистого продукта. Хитиназа экстрагируется с колонки с

Q-сефароэой при градиенте концентраций от 0,1 до 0,5 M NaCI, в то время, как щелочная фосфатаза и гиалуронидаэа выходят 45 при 0,4 М и 0,25 M NaCI соответственно.

Следовательно, хитиназа выявляется в обеих фракциях, содержащих гиалуронидазу и щелочную фосфатазу. но главная фракция хитиназы выделяется выше 0,4 M NaC1, 50

Это, естественно, является объяснением довольно низкому выходу (в ) хитинаэы в указанной таблице по сравнению с другими ферментами. Фракции, собранные для гиалуронидазы и щелочной фосфатазы, содержат хитинаэу, но их дополнительно очищают с помощью афинной хроматографии, благодаря чему достигается разделение разных ферментов.

Таким образом, получают высокочистые ферментные продукты, Формула изобретения

1. Способ получения биологически активных компонентов, преимущественно ферментов, предусматривающий извлечение целевого продукта»э ракообразных (Grustacea, phylum Arthropndes) и его очистку с использованием ионообменной хроматографии, отличающийся тем, что извлечение целевого продукта осуществляют путем экстрагирования целых ракообразных и/или целых их частей водой при температуре в пределах 1 — 35 С, и редпочтительнее в пределах 10 — 25 С, в течение

1 — 12 ч, предпочтительно, 8 ч, и в дополнение к ионообменному хроматографированию эккстракт очищают фильтрованием, центрифугированием или хроматографией, концентрированием и/или удалением нежелательных веществ, выделением, стандартизацией и стабилизацией концентрированных биоактивных компонентов.

2, Способ по п,1, отл и ч а ю щийс я тем, что экстрагируют креветки, особенно блок свежезамороженных креветок посредством их размораживания водой, 3, Способ по и. 1, отличающийся тем, что очистку экстракта проводят путем грубой фильтрации на вращающемся сите с отверстиями 0,5 мм с последующим концентрированием в 1 — 20 раз, предпс тительно D

10 раз, в поперечно-продольной фильтровальной системе, добавлением в концентрат поликатиона на основе полиакриламида в концентрации 0,05-0,15 г/л экстракта, предпочтительно 0,1 г/л, фильтрованием на фильтр-прессе, концентрированием в 1 — 50 раз, предпочтительно в 10 раз, в поперечнопродольной системе и ионообменной хроматографией на колонке. 4; Способ по и, 1, отличающийся тем, что перед очисткой экстракт хранят в замороженном или лиофильно высушенном состоянии.

1838406

Составитель И. Привалова

Техред М. Моргентал Корректор М, лароши

Редактор Т. Горячева

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 е

Заказ 2905 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР.

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5