Способ изготовления сосудистого ксенотрансплантата

 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам изготовления протезов из сегментов трахеобронхиального дерева птиц, предназначенных для пластики артерий малого и среднего диаметра. Задачей изобретения является увеличение эластичности и биологической стойкости ксенотрансплантата при сохранении естественной армировки и снижение антигенности. Для этого в способе изготовления сосудистых ксенотрансплантатов из сегментов трахеобронхиального дерева птиц, включающим обработку их ферментами и дубление, осуществляют соленые обработки 2-10% -ными растворами NaCl в течение 30-35 ч., одну до, а другую после ферментной обработки. При этом ферментную обработку проводят террилитином в течение 4-6 ч. при 40-45°С и при расходе фермента 40-50 ПЕ на 1 г сухого вещества трахеи, затем после второй солевой обработки очищают поверхность протеза от мышечных структур и обрабатывают 0,25-0,5%-ными растворами глутарового альдегида в течение 24-30 сут при температуре от -4 до +10°С с еженедельной заменой раствора. 1 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к способам изготовления протезов из сегментов трахеобронхиального дерева птиц, предназначенным для пластики артерий малого и среднего диаметра.

Известны различные способы изготовления сосудистых ксенотрансплантатов путем обработки их протеолитическими ферментами с последующей инактивацией ферментов, отмывки и дубления трансплантата. Однако известные способы не позволяют достигнуть сочетания эластичности, прочности и биологической стойкости по- лучаемых ксенотрансплантатов.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ изготовления ксенотрансплантатов, включающий обработку сегментов трахеобронхиального дерева птиц ферментами, гепарином и консервацию (дубление) в раствор (0,625%) глутарового альдегида.

Однако известный способ не позволяет изготовить протез, обладающий биомеханическими свойствами, близкими к артериям мышечного типа человека, а также добиться полного устранения иммуногенности протеза из-за остаточной антигенности тканей. Указанные недостатки приводят к неудовлетворительному морфогенезу трансплантата, и, как следствие, к возникновению тромбоза, гиперплазии неоинтимы, воспалению вокруг протеза и прекращению его функциональной деятельности.

В основу изобретения поставлена задача создать способ изготовления сосудистого ксенотрансплантата, обладающего повышенной эластичностью, биологической стойкостью и более низкой антигенностью при сохранении естественной армировки.

Поставленная задача решается тем, что в способе изготовления сосудистого ксенотрансплантата из сегментов трахеобронхиального дерева птиц, включающем обработку их ферментами и дубление, осуществляют солевые обработки 2-10%-ными растворами NaCl в течение 30-35 ч одну до, а вторую после ферментной обработки. При этом ферментную обработку проводят террилитином в течение 4-6 ч при 40-45^оС и при расходе фермента 40-50 ПЕ на 1 г сухого вещества трахеи, затем после второй солевой обработки очищают поверхность протеза от мышечных структур и обрабатывают 0,25-0,5%-ными растворами глутарового альдегида в течение 24-30 сут при температуре до 4-10^оС с еженедельной заменой раствора.

Двойная солевая обработка до и после ферментной позволяют максимально удалить из ксенопротезов высокоиммунный клеточный состав и нефибриллярные белки при сохранении низкоантигенного хрящевого матрикса, осуществляющего каркасную функцию. При концентрации NaCl 2-10% и проведении солевой обработки в течение 30-35 ч происходит максимальный выход биологических веществ. Установлено опытным путем, что уменьшение концентрации NaCl и снижение времени обработки не дает полного выхода биологических веществ (уменьшается выход белков и нуклеотидов из ксенопротеза), а увеличение указанных параметров нерентабельно, так как не увеличивает выхода биологических веществ (контроль за выходом биологических веществ в экстрагирующие растворы осуществлялся по методу Лоури и Калькара). Изменение режима и параметров ферментной обработки в сторону их уменьшения снижает выход биологических веществ, в сторону увеличения - нерентабельно, так как не сказывается на повышении выхода биологических веществ. Предлагаемая длительная обработка раствором глутарового альдегида с концентрацией 0,25-0,5% и при низкой температуре (4-10^оС) позволяет достигнуть максимально возможной биологической инертности ксенопротезов и их хирургической пригодности за счет получения более однородной по толщине структурной стаблизации тканей. Минимальная концентрация глутарового альдегида установлена опытным путем с учетом его бактерицидного действия для предотвращения разложения ксенотрахеи. Увеличение концентрации глутарового альдегида существенно не влияет на биомеханические и иммунологические характеристики ксенотрансплантата. Снижение температуры ведет к замерзанию раствора, а повышение нарушает равномерность стабилизации обрабатываемых тканей. Время обработки установлено опытным путем, уменьшение его не позволяет достигнуть равномерной и однородной структуры ксенотрансплантата, увеличение свыше 30 сут нерентабельно, так как за это время достигается полная стерильность и стабилизация ксенотрансплантата.

П р и м е р 1. Свежую трахею птицы механически очищают от окружающих тканей, промывают в проточной воде и проводят через раствор NaCl в возрастающих концентрациях от 2 до 10% в течение 30 ч, после чего обрабатывают раствором террилитина из расчета 40 ПЕ на 1 г сухого вещества в течение 4 ч при 40^оС. Затем проводят вторую солевую обработку NaCl в возрастающей концентрации от 2 до 10% в течение 30 ч. Механически очищают трансплантат от поверхностного мышечного слоя и помещают в раствор глутарового альдегида, постоянно увеличивая концентрацию от 0,25 до 0,5% (1 нед. - 0,25%; 2 нед. - 0,25%; 3 нед. - 0,5%; 4 нед. - 0,5%) при Т = -4^оС в течение 24 сут. Раствор заменяли каждые 5-6 сут., так как прекращалось поглощение глутарового альдегида. Получен ксенотрансплантат, обладающий прочностью и эластичностью, близкими к таковым у артерий мышечного типа человека, и с удовлетворительными антигенными свойствами. Данные характеристики полученных протезов сведены в таблицу.

П р и м е р 2. Осуществлен в условиях примера 1. Исключение составляет: трахея птицы свежезамороженная, продолжительность солевых обработок 33 ч, расход террилитина 45 ПЕ на 1 г сухого вещества, Т = 43^оС в течение 5 ч. Дубление глутаровым альдегидом проводилось при Т = 2^оС в течение 28 сут. Данные характеристик полученных протезов сведены в таблицу.

П р и м е р 3. Осуществлен в условиях примера 1. Исключение составляет: продолжительность солевых обработок 35 ч, расход террилитина 50 ПЕ на 1 г сухого вещества при Т = 45^оС в течение 6 ч. Дубление глутаровым альдегидом проводилось при Т 10^оС в течение 30 сут. Данные характеристик полученных протезов сведены в таблицу.

П р и м е р 4. Осуществлен в условиях примера 1. Исключение составляет: трахея птицы свежезамороженная, продолжительность солевых обработок 28 ч расход террилитина 30 ПЕ на 1 г сухого вещества при Т = 35^оС в течение 3 ч. Дубление глутаровым альдегидом проводилось при Т 12^оС в течение 20 сут. Данные характеристик полученных протезов сведены в таблицу.

П р и м е р 5. Осуществлен в условиях примера 1. Исключение составляет: продолжительность солевых обработок 37 ч, расход террилитина 80 ПЕ на 1 г сухого вещества при Т = 50^оС в течение 7 ч. Дубление глутаровым альдегидом проводилось при Т 12^оС в течение 35 сут. Данные характеристик полученных протезов сведены в таблицу.

Ксенопротезы, изготовленные по предлагаемому способу, представляют собой трубку, основу которой составляют кольца, утолщенные в средней части и истонченные по краям. Эти кольца своими краями заходят друг за друга и соединяются сетью коллагеновых волокон. Такое соединение делает их подвижными, а трубку прочной. Трансплантат полностью лишен клеточных элементов в отличие от протезов, изготовленных по способу-прототипу, в которых обнаружены значительные количества клеток как в веществе хряща, так и в надхрящнице, и в соединительной ткани. В результате предлагаемого способа получены протезы, состоящие из низкоиммунных компонентов, в сочетании с естественной архитектоникой волокнистых структур, что обеспечивает долговечность их функции в условиях гемодинамических нагрузок и развитие "функционального сосудистого слоя" из тканей реципиента.

Образцы протезов подвергались морфологическому, биомеханическому, иммунологическому изучению. Результаты представлены в таблице.

Ксенопротез, обработанный по предлагаемому способу, значительно превосходит по эластичности как в продольном, так и в окружном направлениях трансплантаты, обработанные по способу-прототипу. Биомеханические свойства предлагаемого протеза близки к таковым у артерий мышечного типа человека. При этом естественная армировка и прочность сохраняется (в относительных величинах прочность даже возрастает). Увеличение концентрации фермента до 60 не приводит к уменьшению прочности стенки при сохранении эластичности. В то время как уменьшение концентрации фермента делает протез более ригидным при сохранении требуемой прочности. Высокая эластичность в сочетании с естественной армировкой позволяют протезу длительно функционировать при имплантации в артерии малого и среднего диаметра.

Обработанные по предлагаемому способу и по способу-прототипу стандартизированные образцы ксенотрансплантатов имплантировались в подкожную клетчатку крыс vistar. В сыворотке крови, получаемой от крыс, определялся уровень антител к образцам методом стандартного твердофазного иммунофермнетного анализа. В период максимального титра антител превышение их концентрации в крови животных с имлпантированным протезом, обработанным по способу-прототипу, по сравнению с предложенным составляет 193%, тчо свидетельствует о более полноценной иммунной адаптации в процессе морфогенеза ксенотрансплантата, полученного по предлагаемому способу.

Для изучения морфогенеза ксенотрансплантата, изготовленного по предлагаемому способу, в условиях низких гемодинамических показателей ксенопротез диаметром 3,0-3,5 мм и длиной 30-35 мм имплантировали в брюшную аорту кролика. Выполнено 42 операции на кроликах породы шиншилла. Срок наблюдения составил 1-150 сут, к концу которого все протезы оказались проходными. В течение 3 нед. после операции в осевшем на поверхности имплантата фибрине происходит процесс формирования неоинтимы. Снаружи протеза образуется тонкая соединительно-тканная оболочка. Из формирующейся неоадвентиции обнаруживается рост тонких прослоек соединительной ткани в направлении неоинтимы. Рубцового сращения протеза с окружающими тканями не обнаружено. Отсутствует поздняя макрофагальная инфильтрация.

Предлагаемый способ изготовления сосудистых ксенотрансплантатов обеспечивает возможность получения протезов, значительно улучшающих результаты реконструктивных сосудистых операций на артериях среднего в малого диаметров, так как обладают свойствами, необходимыми артериальным сосудам, находящимся длительное время в постоянно пульсирующей системе, а именно прочностью, высокой эластичностью, сохраненной в процессе обработки естественной армировкой, защищающей от сдавления окружающими тканями, биологической стойкостью, нулевой хирургической порозностью.

Формула изобретения

СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ СОСУДИСТОГО КСЕНОТРАНСПЛАНТАТА из сегментов трахеобронхиального дерева птиц путем обработки ферментами и дублением глутаровым ангидридом, отличающийся тем, что осуществляют солевые обработки трансплантата в растворе NaCl возврастающей концентрации от 2 - 10% в течение 30 - 35 ч каждую, причем одну до, а вторую после ферментной обработки, которую проводят террилитином в течение 4 - 6 ч при 40 - 45^oС при расходе 40 - 50 ПЕ на 1 г сухого вещества трахеи, после второй солевой обработки очищают поверхность трансплантата от мышечных структур и обрабатывают его 0,25 - 05% -ным раствором глутарового альдегида.

РИСУНКИ

Рисунок 1