Способ определения антител к ретровирусам человека

 

Использование: медицина, иммунная биотехнология и лабораторная диагностика, способ для определения антител к ретровирусам человека. Цель: повышение эффективности способа, Сущность: при определении антител к ретровирусам человека в качестве антигенного компонента иммунодиагностической тест-системы в едином антигенном комплексе используют совместно несколько синтетических пептидов, соответствующих антигенным детерминантам белков нескольких ретровирусов и обладающих иммунореактивностью с антителами соответствующей противовирусной специфичности. Это позволяет в одном анализе определять в исследуемом образце биологической жидкости наличие антител с разной противовирусной специфичностью, направленных против антигенных детерминант нескольких ретровирусов. Последнее упрощает и удешевляет способ. 4 з. п. ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к иммунной биотехнологии и лабораторной диагностике и может быть применено при конструировании диагностических тест-систем, предназначенных для определения антител к ретровирусам человека.

В настоящее время известны четыре вида возбудителей из семейства ретровирусов, вызывающие инфекции у человека Т-лимфотропный вирус человека I типа (HTLV-I), Т-лимфотропный вирус человека II типа (HTLV-II), вирус иммунодефицита человека 1 типа (HIV-1) и вирус иммунодефицита человека 2 типа (HIV-2). Установлено, что HTLV-I вызывает Е-клеточный лейкоз/лимфому взрослых и HTLV-1-ассоциированную миелопатию/тропический спастический парапарез. HTLV-II является возбудителем Т-лейкоплакии и волосатоклеточного лейкоза. Другая группа патологий человека включает синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) и ассоциированный с ним комплекс, первичной причиной которых являются вирус HIV-1 и HIV-2.

На сегодняшний день отсутствуют эффективные средства специфической профилактики и лечения данных патологий, поэтому большое значение в предотвращении распространения инфицированности ретровирусами человека имеет специфическая лабораторная диагностика. Наиболее массовым, и интенсивно развивающимся подходом, применяемым в лабораторной диагностике ретровирусных инфекций человека, является определение противовирусных антител. Для целей скрининга крови на наличие антител к ретровирусам используют иммунодиагностические тест-системы на основе иммуноферментного анализа (ИФА), радиоиммунного анализа (РИА), иммунофлюоресценции (ИФ), реакции пассивной агглютинации (РПА) и других методов, в которых в качестве антигенного компонента применяют вирусный лизат, рекомбинатные белки и синтетические пептиды. Тест-системы на основе синтетических пептидов, имитирующих антигенные детерминанты вирусных белков и способных к специфическому взаимодействию с противовирусными антителами, представляют диагностикумы нового поколения и являются наиболее перспективными, поскольку обладают рядом преимуществ, а именно: инфекционной безопасностью антигенного компонента как при производстве, так и при применении; высокой диагностической специфичностью; высокой стандартностью антигенного компонента в результате доступности структуры для контроля; стабильностью неопределенно долгое время; низкой себестоимостью.

Возможности применения синтетических пептидов для раздельной детекции антител к разным ретровирусам человека продемонстрированы во многих известных исследованиях. Однако определение антител к ретровирусам человека, проводимое по отдельности для каждого вида возбудителя, имеет существенный недостаток для скринирующих исследований, проводимых при обследовании групп риска, контроля за переливаемой кровью и других массовых исследований, заключающийся в необходимости проведения нескольких анализов для каждого исследуемого образца крови. В связи с этим возможность суммарного определения в одном анализе антител, направленных против нескольких ретровирусов человека, явится более удобным и экономически выгодным.

Наиболее близким аналогом данного изобретения является способ определения антител к HIV-1, основанный на совместном использовании синтетических пептидов белков gp120 env и gp41 env HIV-1.

Целью изобретения является повышение эффективности способа. Технический результат выражается в упрощении и удешевлении способа. Технический результат достигается тем, что в качестве антигенного компонента иммунодиагностических тест-систем, в едином антигенном комплексе совместно используют несколько синтетических пептидов, соответствующих антигенным детерминантам белков нескольких ретровирусов и обладающих иммунореактивностью с антителами соответствующей противовирусной специфичности. Это позволяет в одном анализе определять в исследуемом образце биологической жидкости наличие антител с разной противовирусной специфичностью, направленных против разных антигенных детерминант нескольких ретровирусов. Таким образом происходит суммация диагностической специфичности использованных синтетических пептидов нескольких ретровирусов.

Отличительным от наиболее близкого аналога признаком является совместное использование синтетических пептидов нескольких ретровирусов, а не совместное использование синтетических пептидов одного ретровируса.

Предпочтительным является совместное использование в скринирующих иммунодиагностических тест-системах (ИФА, РИА, ИФ, РПА и др.) для определения антител к ретровирусам человека синтетических пептидов, соответствующих аминокислотной последовательности нескольких белков нескольких ретровирусов человека, в диапазоне концентраций при иммобилизации от 0,001 мкг/мл до 1000 мкг/мл.

Более предпочтительным является совместное использование в скринирующей иммунодиагностической тест-системе ИФА для определения антител к ретровирусам человека синтетических пептидов, соответствующих аминокислотной последовательности надмембранного, трансмембранного, кор и матриксного белков нескольких ретровирусов человека, в диапазоне концентраций при иммобилизации от 0,1 мкг/мл до 100 мкг/мл.

П р и м е р 1. При конструировании диагностической тест-системы ИФА, предназначенной для скринирующего исследования сывороток крови на наличие антител к ретровирусам человека: вирусу иммунодефицита человека 1 типа (HIV-1) и Т-лимфотропному вирусу человека II типа (HTLV-I), применяют совместное использование 4-х синтетических пептидов, соответствующих антигенами детерминантам структурных белков gp120 rnv HIV-1. gp41 env HIV-2. p19 gag HTLV- и gp46 env HTLV-I (формулы пептидов приведены в табл.1).

По результатам испытания контрольных сывороток, содержащих и не содержащих антитела к HIV-1 и HTLV-I, проводят сравнение диагностической чувствительности и специфичности тест-систем: а) с предлагаемым совместным использованием 4-х синтетических пептидов HIV-1 и HTLV-I; б) с совместным использованием 2-х синтетических пептидов HIV-1; в) с совместным использованием 2-х синтетических пептидов HTLV-I.

Пептиды синтезируют твердофазным методом по стандартной методике (Andreev S.M. et al.//Biomed. Sci. 1991, Vol.2. р. 271-278). Получение антигенного компонента тест-систем осуществляют посредством совместной иммобилизации синтетических пептидов в одной лунке иммуноферментного планшета по следующей схеме.

Готовят отдельные растворы пептидов (I), (II), (III) и (IV) в 0,01 М карбонатном буфере (рН 9.6) концентрациях а) 20 (I), 12 (II), 30 (III) и 3 (IV) (мкг/мл);
б) 10 (I) и 6 (II) (мкг/мл);
в) 15 (III) и 1,5 (IV) (мкг/мл).

Полученные растворы пептидов смешивают в равном объемном соотношении в соответствии с вариантом тест-системы. Приготовленную смесь растворов пептидов вносят по 100 мкл в лунки 96-луночного полистиролового планшета "Greiner" (Германия) на 12-16 ч при +4^оС. По истечении указанного времени сорбции пептидов, лунки планшета четрыхкратно отмывают 0,01 М фосфатносолевым буфером, содержащим 0,05% Твина-20 (ФСБ-Т).

Свободные сайты твердой фазы забивают путем сорбции 3% раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) в ФСБ-Т по 100 мкл в лунку при -37^оС в течение 1 ч, после чего лунки двукратно отмывают раствором ФМБ-Т.

Анализ исследуемых образцов сыворотки крови человека проводят по следующей методике.

Сыворотки в разведении 1:20 в ФСБ-Т, содержащем 0,5% БСА, вносят по 100 мкл в лунку планшета с иммобилизованными пептидами и инкубируют при +37^оС 0,5 ч, после чего лунки четырехкратно отмывают раствором ФМБ-Т.

В лунки вносят по 199 мкл протеина А St.aureus в рабочем разведении в ФСБ-Т, содержащем 0,5% БСА, и инкубируют 0,5 ч при +37^оС, после чего лунки четырехкратно отмывают ФСБ-Т.

В лунки вносят по 100 мкл хромогенного энзим-субстрата, содержащего 0,032% ортофенилендиамина в 0,1 М цитратно-фосфатном буфере (рн 5,0) и 0,012% Н₂О₂, и инкубируют 10 мин в темноте при комнатной температуре. Ферментативную реакцию останавливают добавлением в каждую лунку по 50 мкл 3 М раствора Н₂SO₄.

Величину экстинкции определяют с помощью фотометра при длине волны 492 нм.

Интерпретацию результатов осуществляют следующим образом.

Вычисляют величину контрольного уровня (КY) по формуле KY Mx2 )где М среднее значение экстинкции, полученное при испытании контрольных сывороток, не содержащих антитела к вирусам HIV-1 и HTLV-I). Результат испытания считают положительным, если уровень экстинкции, полученный для испытуемого образца, находится в пределах +/- 5% KY (результат "+/-") или более, чем на 5% превышает KY (результат "+", "++", "+++"). Результаты испытания считают отрицательным, если уровень экстинкции, полученный для испытуемого образца, более чем на 5% ниже KY (результат "-").

Результаты испытания контрольных сывороток, содержащих и не содержащих антитела к ретровирусам HIV-1 и HTLV-I, представлены в табл.2.

Результаты свидетельствуют, что тест-система с совместным использованием синтетических пептидов, соответствующих антигенным детерминантам белков ретровирусов HIV-1 и HTLV-I, позволяет во всех контрольных сыворотках идентифицировать наличие или отсутствие антител к HIV-1 и HTLV-I и демонстрирует такую же высокую диагностическую чувствительность и специфичность, как и тест-системы для отдельного определения анти-HIV-1 и анти-HTLV-I антител.

П р и м е р 2. Опыт проводят аналогично примеру 1. Отличие заключается в том, что в качестве контрольных используют положительные сыворотки с низким уровнем антител к белкам вирусов HIV-1 ("стандартная панель сывороток, содержащих антитела и HIV-1", НПО "Вектор", г.Новосибирск, серия N 002) и HTLV-I. Результаты опыта представлены в табл.3.

Результаты показывают, что все испытуемые сыворотки, содержащие низкий уровень антител к белкам вирусов HIV-1 и HTKV-I, были верно идентифицированы как положительные (100%) в тест-системе с совместным использованием синтетических пептидов HIV-1 и HTLV-I. При этом, серопозитивность по антителам к ретровирусам установлена при испытании образцов в одной тест-системе, в отличие от необходимости проведения двух анализов при использовании двух тест-систем для отдельного определения анти-HIV-1 и анти-HTLV-I антител.

Предлагаемый способ, позволяющий в одном анализе обнаруживать антитела с разной противовирусной специфичностью, упрощает и удешевляет скринирующее обследование на серопозитивность к ретровирусам, поскольку позволяет проводить один анализ исследуемого образца вместо нескольких. Положительный результат в таком объединенном тесте позволяет с меньшими временными и материальными затратами выявить все серопозитивные образцы крови при серодиагностике ретровирусных инфекций человека.

Формула изобретения

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К РЕТРОВИРУСАМ ЧЕЛОВЕКА, включающий контактирование исследуемого образца биологической жидкости с антигенами ретровирусов человека с последующей регистрацией результатов иммунологической реакции, отличающийся тем, что исследуемый образец контактируют с антигенным комплексом, образованным несколькими антигенами, представляющими собой синтетические пептиды, соответствующие антигенным детерминантам белков нескольких ретровирусов человека и обладающие иммунореактивностью с антителами соответствующей противовирусной специфичности.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что определяют антитела к ретровирусам: вирусу иммунодефицита человека 1 типа (H1V-1) и T-лимфотропному вирусу человека 1 типа (HTLV-1).

3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что антигенный комплекс образуют из четырех синтетических пептидов, соответствующих антигенным детерминантам структурных белков gp 120 env HLV-1, gp 41 env HIV-1, p19 gag HTLV-1 и gp 46 env HTLV-1.

4. Способ по пп. 1 3, отличающийся тем, что синтетические пептиды используют в диапазоне концентраций при иммобилизации от 0,1 мкг-мл до 100 мкг/мл.

5. Способ по пп. 1 4, отличающийся тем, что антигенный комплекс из синтетических пептидов иммобилизуют в лунках планшетов для иммуноферментного анализа.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4