Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l. - продуцент моноклональных антител к igm человека

 

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 5028462/13 (22) 24.02.92 (46) 30.11.93 Бюп. Ия 43-44 (71) Крымский медицинский институт (72) Ефетов КА; Татин С.Ю.; Князева ОА„Троицкий

Г.В. (73) Крымский медицинский институт (64) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS L — ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕП

К IGM ЧЕЛОВЕКА (57) Использование: биотехнология, иммунология, медицина. Сущность изобретения: штамм получают путем гибридизации клеток селезенки мышей (ю) RU (и) 20036S5 С1 (51) 5 С I2N5 00 C12P2 ОВ

Ва1Ь/с. иммунизированных препаратом (Гс)5 р —, фрагмента IgM человека (получен гель-фильтрацией трипсинового гидролизата igM, выделенного из сыворотки крови больного болезнью Вапьденстрема), с клетками миеломной линии Sp 2/О Аф4.

Секретируемые гибридомой моноклонапьные антитела связываются с IgM человека. Антитела могут использоваться для структурных и функциональных исследований IgM человека и разработки диагностических тест-систем. Штамм обозначен В5 и хранится под номером ВСКК(П) N472D. Продукция антител в культуральной жидкости составляет 10 мкг/мл, в асцитической — 5 мг/мл.

2003685

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для структурных и функциональных исследований иммуноглобулинов М человека, разработки иммунодиагностических и иммунотерапевтических препаратов в биологии и медицине, Получение больших количеств таких антител возможно только с помощью гибридомной технологии. В литературе имеются сообщения о получении мышиных моноклональных антител к tgM. Ho каждая вновь слитая гибридома является новой по определению, так как синтезируемые ею моноклональные антитела индивидуальны по первичной структуре, специфичности к данной детерминанте, аффинности и другим свойствам, Получение панели антител к разным антигенным детерминантам иммуноглобулина М расширяет возможности иммунологических методов исследования. Для получения гибридомы иммунизация мышей моноклональным цельным IgM, но в большинстве случаевдля иммунизации предпочтительнее использование (Fc)5 р -фрагментов, так как это исключает появление гибридомных клонов, продуцирующих моноклональные антитела к вариабельным участкам молекулы IgM.

Целью изобретения является получение гибридомного штамма, продуцирующего моноклональные антитела к IQM человека. пригодные для использования в различных видах биохимических и иммунологических исследований, Происхождение штамма, Для иммунизации использовали мышей линии BALB/ñ.

Антиген — препарат (Fc)5,и -фрагментов IgM человека (полученных гель-фильтрацией трипсинового гидролизата igM, выделенного из сыворотки крови больного болезнью

Вальденстрема) вводили в количестве 100 мкг в забуференнам растворе с полным адъювантом Фрейнда. Повторную иммунизацию проводили через месяц таким же количеством антигена, но без адьюванта.

Через месяц после второй иммунизации мышам вводили 100 мкг препарата внутривенно, Через 3 дня у животных определялся титр антител к Ig M методом иммуноферментного анализа. Мышь с лучшим иммунным ответом испольэовали для получения гибридомы, Для этого 10 клеток селезенки иммунной мыши гибридизовали с 4 10 клеток миеломы Sp2/о Ag14 в присутствии

50 -ного раствора полиэтиленгликоля с мол. мас, 4000 (tvlerci, ФРГ), После гибридизации клетки высевали в 96-луночные планшеты по 10" клеток на лунку. В качестве питающего слоя использовали перитональные макрофаги мыши, которые высевали по

10 клеток на лунку за сутки до гибридизации. Для культивирования и селекции гибридом испольэовали среду RPMJ-1640 с добавлением 20 фетальной бычьей сыворотки, 10 M гипоксантинэ, 4:10-7 М аминоптерина и 1,6 10 М тимидина.

Гибридому клонировали 2 раза методом лимитирующего разведения (из расчета 1 клетка на 3 лунки 96-луночного планшета). После второго клонирования более 90 полученных субклонав продуцировали антитела к

IgM человека. Продукция антител сохранялась в течение 25 пассажей в культуре и 15

15 пассажей на животных. Сред для культивирования — среда RPMJ-1640 с добавлением

110 фетальной бычьей сыворотки, 2мМ глутамина,2мМ пирувата, по 100 ед,/мл пенициллина и стрептомицина, Посевная доза

20 — 10 клеток в 1 мл. Через 2-3 дня концент5 рация антител в куя ьтуральной жидкости достигала примерно 40 мкг/мл.

Контаминации бактериями, грибками и микроплазмами не обнаружено.

Для длительного хранения гибридомные клетки могут быть заморожены в фетальной сыворотке с добавлением 110 диметилсульфоксида. Способ криоконсервирования — 1 сут. при -70 С, затем клетки

30 переносятся в жидкий азот. Размораживают клетки, перенося ампулу из жидкого азота в водяную баню на 37 С.

Для выращивания гибридомы в асцитной форме клетки вводили в брюшную по35 лость мышей BALB/c, предварительно обработанных пристаном, в количестве 10 клеток на мышь. Опухоли развивались у мышей через 10-14 дней. Секреция антител клетками гибридомы, выращиваемыми в асцитной форме, сохранялась в течение 15 пассажей на мышах.

Гибридома получила условное название

В5. Моноклональные антитела, продуцируемые штаммом В5, относятся к первому под45 классу мышиных IgG и связывают IgM человека. Принадлежность к подклассу определяли при помощи преципитирующих антисывороток к мышиным IgG разных подклассов (Siglna, США) методом радиальной

50 иммунодиффуэии по Оухтерлони. Взаимодействие антител с igM человека определяли методом иммуноферментного анализа.

Пример . Гибридомные клетки помещали в пластиковый флакон площадью 25

55 см по 5 10 клеток в 5 мл среды RPMJ1640 с 10Я, фетальной сывороткой, 2мМ глутамина, 2мМ пирувата, по 100 ед,/мл, пенициллина и стрептомицина. Клетки культивировали 2-3 дня при 37 С в атмосфере, 2003685

Формула изобретения

1 М

472 D - продуцент моноклональных антиШтамм гибридных культивируемых кле- тел к lgM человека. ток животных Mus musculus I. ВСКК(П) N

Составитель К.Ефетов

Техред М.Моргентал К РР Р О.Густи

Редактор Л.Павлова

Заказ 3308

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 содержащей 5 СОг, Культуральную среду собирали, ценрифугировали 10 мин при 80 об/мин. Супернатант, содержащий моноклональные антитела к lgM человека, использовали в иммуноферментном анализе.

В качестве антигенов вносили различные моноклональные иммуноглобулины (выделенные из сыворотки крови больных миеломной болезнью методом ионообменной хроматографии) и (Fc)5,и -фрагмента IgM человека (полученные гель-фильтрацией трипсинового гидролизата !9М) в концентрации 10 мкгlмл в бикарбонатном буферном растворе по 50 мкл в лунку на

96-луночном пластиковом планшете. Инкубировали в течение 60 мин при 37 С, затем сливали, тщательно встряхивали и вносили по 100 мкл в лунку 1 раствор бычьего сывороточного альбумина на 60 мин при 37 С.

После окончания инкубации раствор альбумина сливали, планшет промывали водой и забуференным физраствором с 0,05 твином (PBST) вносили супернатант культуральной среды по 50 мкл в лунку и инкубировали при 37 С. Через 60 мин все сливали, промывали холодной водой и

PBST, добавляли по 50 мкл коньюгата антител к lgG мыши с пероксидазой в разведении 1:500 в растворе PBST и инкубировали при 37 С 60 мин. После тщательной промыв5 ки в лунки вносили субстрат — 2.2 -азино-ди(3-этилбензтиазолинсульфонат/6/)(ABTS) в

0.05М цитратном буфере с добавлением перекиси водорода и инкубировэли на шейкере при комнатной температуре (21OC) в

10 течение 30 мин, после чего оценивали результат на спектрофотометре "Multlskan" (Flow, Великобритания) при длине волны

405 нм.

Получены следующие данные, выра15 женные в процентах от максимальной экстинкции (100 — 0,9): !АМ вЂ” 100 j, (Fc)5u—

80%, IgG — 0%, IgA — 0%

Таким образом, было показано, что гибридома В5 продуцирует моноклональные

20 антитела, взаимодействующие с IgM человека, Получен новый по определению, патентоспособный штамм клеток. (56) Левицкий В.А. и др. Известия AH Лат25 вийской ССР, 1989, ¹ 12, с. 104-107.