Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l., используемый для получения моноклональных антител к jgg человека

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения иммунодиагностических и иммунотерапевтических препаратов в биологии и медицине. Сущность изобретения: получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к I gG человека. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии Balb/c, иммунизированных препаратом I gG, с клетками миеломы Sp 2/0 Ag 14. Моноклональные антитела относятся к изотипу I gG 2 а, они специфически связывают целые молекулы I gG человека, но не их Fab- и Fc-фрагменты. Концентрация МКА в культуральной жидкости составляет 5 - 10 мкг/мл, в асцитной - 5 мг/мл. 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для структурных и функциональных исследований иммуноглобулинов G (lgG) человека, разработки иммунодиагностических препаратов в биологии и медицине.

Известны штаммы, продуцирующие моноклональные антитела (МКА), взаимодействующие с lgG1, 2, 3, 4 человека, а также с их Fab-, Fc- [4] и только Fc-фрагментами [1] . Отличительным свойством предложенного штамма является продукция антител, взаимодействующих с целыми молекулами lgG1, lgG2, lgG3, lgG4 человека в шарнирной области и не вступающих в реакцию с Fab-, Fc-фрагментами lgG.

Для гибридомного слияния ранее [4, 1] использовались клетки миеломной линии NS1, которые в отличие от используемой в изобретении линии Sp 2/0 Ag14 синтезируют легкие цепи иммуноглобулинов, способные встраиваться в молекулы антител [2] , что может приводить к инактивации части антител [3] и соответственно снижать эффективность применения для иммуноферментного анализа.

Известно, что каждая вновь полученная гибридома обладает строго индивидуальными параметрами. МКА, продуцируемые разными гибридомами, различаются по своей первичной структуре, специфичности к различным антигенным детерминантам, аффинности, способности связывать комплемент, цитотоксичности, гемагглютинирующим и многим другим свойствам. Использование нескольких МКА к иммуноглобулинам в комплексе расширяет возможности применения их в биохимических, иммунологических и клинических исследованиях. Поэтому получение МКА к разным антигенным детерминантам иммуноглобулинов человека, являющимся центральным звеном гуморального иммунитета, позволяет использовать их в различных вариантах иммуноло- гических методов.

Технический результат изобретения заключается в получении гибридного штамма культивируемых клеток Mus musculus L. , продуцирующего МКА к антигенной детерминанте, расположенной в шарнирной области lgG человека.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии BALB/с иммунизируют внутрибрюшинным введением 100 мкг lgG (выделенного из сыворотки крови больного аденокарциномой желудка методами переосаждения сернокислым аммонием с последующей ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе) в 0,005 М фосфатном буферном растворе с 0,15 М NaCl, pH 7,4 (PBS) с полным адъювантом Фрейнда. Иммунизацию повторяют через 4 недели без адъюванта. Через 4 недели после второй иммунизации мышей бустируют путем внутривенного введения 100 мкг lgG в PBS. Через 3 дня у животных определяют титр антител к lgG человека методом иммуноферментного анализа. Мышь с лучшим иммунным ответом используют для получения гибридомы. Для этого 10⁸ клеток селезенки иммунной мыши гибридизируют с 4 х 10⁷ клеток миеломы Sp 2/0 Ag14 в присутствии 50% раствора полиэтиленгликоля с мол. м. 4000 (Merck, ФРГ). После гибридизации клетки высевают в 96-луночные планшеты по 10⁵ клеток на лунку. В качестве питающего слоя используют перитонеальные макрофаги мыши, которые высевают по 10⁴ клеток на лунку за сутки до гибридизации. Гибридому клонируют два раза методом лимитирующего разведения (из расчета 32 клетки на 96-луночный планшет), высевая клетки на слой перитонеальных макрофагов. После второго клонирования более 90% полученных субклонов продуцируют антитела к lgG человека. Наиболее продуктивный клон выводят в массовую культуру и обозначают Н11G5.

Штамм Н11G5 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Тип роста штамма - суспензионный, клетки округлой формы, расположены кластерами. Гибридома вызывает образование смешанных асцитных и солидных опухолей при прививке в перитонеальную полость мышей линии BALB/с в дозе 1 млн. клеток на мышь.

Культуральные признаки. Гибридому культивируют в пластиковых флаконах на 50-250 мл. Посевная доза 5 х 10⁵ клеток на 1 мл. Кратность рассева 1: 5, время субкультивирования 3-4 дня. Среда для культивирования - RPM1-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, по 2 мМ/л глутамина и пирувата, по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина. В первые 3 недели после гибридизации в среду добавляют 10^-4 М гипоксантина, 4 х 10^-7 М аминоптерина и 1,6 х 10^-5 М тимидина, так как клетки миеломы Sp 2/0 Ag14 дефектны по ферменту гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазе. Клетки выращивают в атмосфере 5% СО₂ при 37^оС.

Культивирование в организме животного. Наработку МКА проводят культивированием клеток "in vivo" на мышах линии BALB/с (предварительно обработанных внутрибрюшинно тетраметилпентадеканом по 0,5 мл) в количестве 1-2 млн. клеток на мышь. Опухоли образуются через 10-14 дней после прививки.

Характеристика полезного продукта. МКА, продуцируемые штаммом Н11G5, относятся к lgG2а подклассу, специфически взаимодействуют с lgG человека в шарнирной области. Принадлежность к подклассу lgG определяют при помощи преципитирующих сывороток против lgG мыши разных подклассов (Sigma, США) методом радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони. Взаимодействие антител с lgG человека определяют методом твердофазного иммуноферментного анализа.

Продуктивность штамма, стабильность продукции антител. Концентрация МКА через 3-4 дня культивирования "in vitro" составляет 5-10 мкг/мл, в асцитной жидкости - 5 мг/мл. Контроль продуктивности осуществляется с помощью иммуноферментного анализа, титр 1/5000. Продуктивность антител сохраняется в течение 25 пассажей в культуре и 15 пассажей на животных.

Контроль контаминации. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК.

Способ криоконсервирования. Для длительного хранения клетки штамма замораживают в фетальной бычьей сыворотке с добавлением 10% диметилсульфоксида. Режим замораживания: сутки при -70^оС, затем ампулы с клетками переносят в жидкий азот. Размораживают клетки, перенося ампулу из жидкого азота в водяную баню на 37^оС. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 70-80% по окрашиванию трипановым синим.

П р и м е р. Гибридомные клетки помещают в пластиковый флакон площадью 25 см² по 5 х 10⁵ клеток в 5 мл среды RPМ1-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, по 2 мМ/л глутамина и пирувата, по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина. Клетки культивируют 3-4 дня при 37^оС в атмосфере, содержащей 5% CO₂. Культуральную среду собирают, центрифугируют 10 мин при 800 об/мин. Супернатант, содержащий МКА к lgG человека, применяют в иммуноферментном анализе. В качестве антигенов используют различные иммуноглобулины, выделенные из сыворотки крови здоровых людей и больных миеломной болезнью (методом переосаждения сернокислым аммонием с последующей ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе): lgG дон, lgG1 Куз, lgG1 Мис, lgG1 Рощ, lgG2 Боб, lgG2 Рыб, lgG2 б/н, lgG3 Дал, lgG4 Жел, lgG4 Бер, lgA, а также lgM (выделенный из сыворотки крови больного болезнью Вальденстрема переосаждением бидистиллированной водой с последующей гель-фильтрацией) и пипаиновые Fab-, Fc-фрагменты lgG человека. Антигены разводят до концентрации 10 мкг/мл в 0,05 М Na-карбонатном буфере, рН 9,2 и вносят по 50 мкл в лунку 96-луночных планшетов. Инкубируют в течение 1 ч при 37^оС, затем сливают и вносят по 100 мкл в лунку 1% -ный раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) на 1 ч при 37^оС. После окончания инкубации раствор BSA сливают, планшет промывают холодной водой и PBS с 0,05% твином (ПBST), вносят супернатант культуральной среды по 50 мкл в лунку и инкубируют при 37^оС. Через 1 ч содержимое лунок сливают, лунки промывают холодной водой и PBST, добавляют по 50 мкл конъюгата кроличьих антител к lgG мыши с пероксидазой в разведении 1: 500 в растворе PBST и инкубируют при 37^оС 1 ч. После тщательного промывания в лунки вносят 0,4 мМ раствор субстрата - 2,2^I-азино-ди-[3-этил- бензтиазолинсульфонат(6)] (ABTS) в 0,05 М Na-цитратном буфере, рН 4,0 с добавлением перекиси водорода до конечной концентрации 0,01% и инкубируют на шейкере при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем оценивают результат на спектрофотометре "Multiskan" (Flow, Великобритания) при длине волны 405 нм.

Полученные данные, выраженные в процентах от максимальной экстинкции (1,0-100% ), представлены в таблице.

Данные, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что гибридома Н11G5 продуцируют МКА, специфически взаимодействующие с антигенной детерминантой lgG человека, расположенной в шарнирной области. (56) 1. Lowe J. , Bird P. , Hardie P. et al. // J. Immunol - 1982, v. 47(r). - p. 221-396.

2. Milstein C. , Aletugbo K. , Cowan N. J. et al. // Cold Spring Harbor Symp. Quabt Biol. -1976. -v. 41, p. 793.

3. Kohler O. , Howe S. C. , Milstein C. // Eur. J. Immunol. -1976. -v. 6. -p. 292.

4. Европейский патент N 0163141, кл. C 12 P 21/00, 1985.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. ВСКК(П) N 491 D, используемый для получения моноклональных антител к IgG человека.

РИСУНКИ

Рисунок 1