Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l. - продуцент моноклональных антител к мелиттину из яда пчелы (apis mellifera)

 

Испопьзовыание: биотехнология Сущность изобретения: штамм получен при гибридизации клеток селезенки мышей BALB/c, иммунизированных препаратом мепиттина из яда пчелы, с клетками миепомной линии Sp 2/0 Ag 14. Секретируемые гибридомой моноклональные антитепа связываются с ,:епиттииом из яда пчелы. Штамм культивируется в стандартных условиях для выращивания гибридом и легко переводится в асцитическую форму. Штамм обозначен M2F9 и депонирован под номером ВСКК (П) 578 D.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К ПАТЕНТУ.

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 5028457/13

{22) 24.02.92 (46)-30.11.93 Бюл. Ия 43-44 (71) Крымский медицинский институт

{72) Князева ОА; Ефетов КА; Тэтин С.Ю. (73) Крымский медицинский институт (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ М08 MUSCULUS L

- ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

К МЕЛИТТИНУ ИЗ ЯДА ПЧЕЛЫ (APIS

MEllIFERA) (в) RU (и) 2003683 СХ (51)5 СИХ500 СИРИ 08 (57) Испопьзовыание: биотехнология. Сущность изобретения: штамм получен при гибридизации клеток селезенки мышей BALS/с, иммунизированных препаратом мепиттина из яда пчелы, с клетками миеломной липин Sp 2/О Ag 14. Секретируемые гибридомой моноклональные антитела связываются с гелиттином из яда пчелы. Штамм культивируется в стандартных условиях для выращивания гибридом и легко переводится в асцитическую форму.

Штамм обозначен M2F9 и депонирован под номером ВСКК (П) 578 О.

2003683 делали забор крови из хвостовой вены. Для д слияния отбирали животных с максималь- M ным титром антител. 10 клеток селезенки

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для исследования мелиттина — токсического пептида пчелиного яда, механизм его взаимодействия с природными и синтетическими липидными мембранами, выделения мелиттина с помощью аффинной хроматографии, Мелиттин — пептид, состоящий из 26 аминокислотных остатков с мол. мас. около

3000 Да (1). Характерное распределение аминокислот в молекуле обуславливает формирование гидрофильного и гидрофобного участков. Такое строение позволяет пептиду встраиваться в липидные мембраны и разрушать клетки в микромолярных концентрациях (2). Получение моноклональных антител к мелиттину расширяет возможности применения последнего для изучения строения и физико-химических свойств клеточных мембран, Несмотря на свои небольшие размеры, мелиттин является иммуногенным пептидом (3), В литературе имеется указание о получении моноклональных антител к мелиттину (3). Но слияние каждой гибридомы дает основание считать ее новой по определению, т.к. продуцируемые ей антитела к данному вещсству отличаются целым рядом и нди видуал ьн ых особенностей — аффинностью к данному антигену, первичной структурой и как следствие этого физико-химическими свойствами. Использование набора моноклональных антител к данному иммупогену позволяет значительно расширить спектр и возможности иммунологических методик.

Полученные (3) моноклональные антитела не являлись преципитирующими, что исключает возможность. применения их в реакциях преципитации.

Целью изобретения является получение штамма гибридомы, синтезирующего моноклональные антитела к мелиттину из яда пчелы, пригодные для использования в различных видах биохимических и иммунологических исследований.

Происхождение штамма.

Мышей линии BALB/с иммунизировали внутрибрюшинным введением 50 мкг мелиттина из яда пчелы в забуференном фосфатами физиологическом pBGTBQpe c полным адьювантом Фрейнда. Иммунизацию повторяли через месяц таким же количеством антигена, но без адьюванта. В процессе иммунизации у животных с помощью иммуноферментного анализа определяли титр антител в мелиттине. Для этого иммунной мыши гибридизовали с 4 10 клеток миеломы Sp2/О Ag14 в присутствии

50%-ного раствора полиэтиленгликоля с мол. мас. 4000 (Merck, ФРГ). После гибридизации клетки высевали в 96-луночные планшеты по 10 клеток на лунку. В качестве питающего слоя использовали перитональные макрофаги мыши, которые высевали по

10 клеток на лунку за сутки до гибридиза"0 ции. Для культивирования и селекции гибридомы использовали среду ВРМИ640 с добавлением 20% фетальной бычьей сывороткой. 10 М гипоксаытина„4 10 М аминоптерина и 1,6 10 М тимидина.

Гибридому клонировали 3 раза методом лимитирующего разведения (из расчета 1 клетка на 3 лунки 96-луночного планшета), После третьего клонирования более 90 полученных субклонов продуцировали антитела к

20 мелиттину. Продукция антител сохранялась в течение 30 пассажей в культуре и 21 пассажа на животных. Среда для культивирования — среда ВРМИ640 с 10 фетальной бычьей сывороткой, 2 мМ глутамина, 2 мМ пирувата, по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина, Посевная доза — 10 клеток

5 в 1 мл. Через 2-3 дня концентрация антител в культуральной жидкости достигала примерно 40 мкгlмл.

Контаминации бактериями, грибками и микроплазмами не обнаружено.

Для длительного хранения гибридомные клетки могут быть заморожены в фетальной бычьей сыворотке с добавлением

10% диметилсульфоксида. Способ криоконсервирования — 1 сут. при -70 С, затем клетки переносятся в жидкий азот.

Размораживают клетки, перенося ампулу иэ жидкого азота в водяную баню на 37 С.

40 Для выращивания гибридомы в асцитной форме клетки водили в брюшную полость мышей BALB/с (предварительно обработанных пристаном) в количестве 107 клеток на мышь. Опухоли развивались умышей через 10-14 дней. Секреция мотноклональных антител клетками гибридомы, выращенными в асцитной форме, сохранялись в течение 21 пассажа на мышах.

Гибридома получила условное название

IVI2F9. Моноклональные антитела, продуцируемые штаммом, относится к первому подклассу мышиных IgG и связывают мелиттин из яда пчелы. Принадлежность к подклассу определяли при помощи преципитирующих

55 антисывороток к мышиным IgG разных подклассов (Sigma, США) методом радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони. Взаимо-! ействие антител с мелиттином определяли етодом иммуноферментного анализа. Дан2003683

Ф о Р м У л а и з о б Р е т е н и 578 D - продуцент моноклональных антиШтамм гибридных культивируемых кле- тел к мели ггину из яда пчелы. ток животных Mus musculus L. ВСКК (П) 45

Составитель О.Князева

Техред M.Ìîðãåíòàë

Корректор; О, Густи

Редактор Л.Павлова

Заказ 3308

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101 ные моноклональные антитела являются преципитирующими. Способность к преципитации выявляли методом двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони, Пример 1. Для проведения твердофазного иммуноферментного анализа использовали специальные плоскодонные

96-луночные планшеты. На них наносили антигены: мелиттин, фосфолипазу (являющуюся также компонентом пчелиного яда) и для контроля — бычий сывороточный эльбумин в концентрациях 10 мкгlмл в бикарбонатном буферном растворе по 50 мкл в лунку. Инкубировали в течение 60 мин при

37 С, затем сливали, стряхивали и вносили по 100 мкл в лунку 1 раствор бычьего сывороточного альбумина на 60 мин при 37 С.

После окончания инкубации раствор альбумина сливали, планшет тщательно промывали холодной водой и забуференным физраствором с 0,05 твином (PBST), вносили культуральную среду по 50 мкл в лунку и инкубировали при 37 С. (Культуральную среду получали помещая гибридомные клетки по 5 . 10 в 5 мл среды RPMI-1640 с

10 ф еeтTаaлnьbнHоoй A сcы вaоoрpоoтTкKоoй, 2 мМ глутамина, 2 мМ пирувата, по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина на 3-4 дня в СОг— инкубатор), Через 60 мин все сливали, промывали холодной водой и PBST, добавляли по 50 мкл коньюгата антител к IgG мыши с пероксидазой (Sigma, США) в разведении

1;500 в растворе PBST. и инкубировали при

370С 60 мин. После тщательной промывки в лунки вносили субстрат — 2,2 -азино-ди-(3зтилбензтиазолинсульфонат/6/1 (ABTS) в

0,05 М цитратном буфере с добавлением перекиси водорода и инкубировали на шейкере при комнатной температуре (22 С) в течение 30 мин, после чего оценивали результат на спектрофотометре "Multiskan" (Flow, Великобритания) при длине волны

405 нм.

5 Получены следующие данные, выраженные в процентах от максимальной зкстинкции (0,9-100 ): мелиттин 100, фосфолипаза 0%, бычий сывороточный альбумин O .

10 Таким образом, было показано, что гибридома M2F9 продуцирует моноклональные антитела, взаимодействующие с мелиттином.

Пример 2. Двойную радиальную

15 иммунодиффузию по Оухтерлони проводили в 1,3 агаровом геле, приготовленном на

0,001 M фосфатном буфере. рН 7,2, Показано, что моноклональные антитела, продуцируемые гибридомой M2F9 (концентрация в

20 опыте 2 мг/мл), дают полосу преципитации с мелиттином (концентрация в опыте 0,4 мг/мл), но не дают с фосфолипазой из яда пчелы и бычьим сывороточным альбумином в тех же концентрациях, 25 (56) 1. Демченко А.П., Костр>кевская Е.Г. Мелиттин: структура, свойства, взаимодействие с мембраной. Украинский биохимический журнал. 1986. т. 58, Nã 5, с.

30 92-103.

2. Laine R.O„Morgan В.P., asser А.F.

Comparison between complement and

melittln hemolysis: anti-mellttin antibodies

Inhibit complement lysis. Biochemistry, 1988, 35 -ч. 27, р. 5308-5314, 3. King Т,P„Kochoumian L., Joslyn А.

МеИц!п-specific monoclonal and polyclonal

lgE and IgG antibodies from mice. J.

ImmunoI., 1984, v, 133, Мг 5, р. 2668-2673.