Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l., используемый для получения моноклональных антител к @ - цепям ig человека

 

Использование: биотехнология, клиническая диагностика состояний человека, связанных с моноклональной протеинемией и протеинуркей Сущность изобретения: получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus Ц продуцирующего моноклинальные антитела (МКА) к легким к -цепям Ig человека, обладающих преципитирующими свойствами Штамм получают гибридизацией имунных спленоцитов мышей линии Balb/c с клетками миеломы Sp 2/0 Ag14 MKA ЗН2Д2 относятся к подклассу Ig Gi. Они взаимодействуют со свободными и в составе целых иммуноглобулинов к - цепями Ig человека, а также преципитируют IgG человека, содержащие легкие цепи к. -типа. 1 табл.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 5021б72/13 (22) 10.01.92 (46)-30.1193 Бюл. Мя 43 — 44 (71) Крымский медицинский институт (72) Князева ОА; Ефетов КА; Тэтин С.Ю.; Троицкий

Г.8. (73) Крымский медицинский институт (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕ—

МЫХ YJlETOK ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS L, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ М0Н0КЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К к -ЦЕПЯМ lG ЧЕЛОВЕКА (57) Использование: биотехнология, клиническая диагностика состояний человека, связанных с мо(is) RU (11) 2ОО3681С1 (БЦ Я С 12Д 5/00 С I ZP 2! 08 ноклонапьной протеинемией и протеинурией, Сущ— ность изобретения: получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus и-овси1ыв l„ продуцирующего моноклональные антитела (MKA) к легким к -цепям lg человека, обладающих преци— питирующими свойствами. Штамм получают гибри— дизацией имунных спленоцито в мышей линии

Balb/ñ с клетками миеломы Sp 2/О Ag14. MKA

ЗН2Д2 относятся к подклассу lg Gi. Они взаимодействуют со свободными и в составе целых иммуногпобулинов к — цепями lg человека, а также пре- ципитируют lgG человека, содержащие легкие цепи к -типа. 1 табл.

2003681

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для структурных и функциональных исследований иммуноглобулинов человека и клинической диагностики ряда патологических состояний, связанных с монокланальной протеинемией и протеинурией.

Известны штаммы гибридомных клеток, продуцирующие моноклональные антитела (МКА) к легким к-цепям fg человека /!/.

Однако преципитирующие свойства известных антител не описаны, Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток

Mus muscuius („продуцирующего МКА, способные преципитировать IgG человека, в состав которых входят легкие цепи tc-типа.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии BALB/с иммунизируют внутрибрюшинным введением 100 мкг IgG (выделенного иэ сыворотки крови больного миеломой путем переосаждения сернокислым аммонием с последующей ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе) в забуференном физрастворе с полным адъювантом Фрейнда. Иммунизацию повторяют через 4 недели без адъюванта, Через месяц после второй иммунизации мышей бустируют путем внутривенного введения 100 мкг lgG в забуференном физрастворе, Через 3 дня у животных определяют титр антител к

IgG методом иммуноферментного анализа.

Мышь с лучшим иммунным ответом используют для получения гибридомы. Для этого

10 спленоцитов иммунной мыши гибридизуют с 4 10 клеток миеломы $р2/О Ag 14 (не продуцирующей Ig èëè их цепи) в присутствии 50 -ного раствора полиэтиленгликоля с мл. мас. 4000. После гибридизации клетки высевают в 96-луночные планшеты по 10 клеток на лунку. В качестве питающе5 го слоя используют перитонеальные макрофаги мыши, которые высевают пл 10 клеток а на лунку эа сутки до гибридизации, Гибридизацию клонируют 2 раза методом лимитирующих разведений (иэ расчета 1 клетка на

3 лунки), высевая клетки на слой перитонеальных макрофагов. После второго клонирования более 90 полученных субклонов продуцируют MKA к легким- а цепям tg человека. Наиболее продуктивный клон выводят в массовую культуру и обозначают

3Н202. Штамм 3Н202 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Тип роста штамма — суспензионный, клетки округлой формы, сгруппированы в кластеры, Культуральные признаки, условия выращивания и ростовые свойства. Среда для культивирования RPMT-1640 с добавлением

10 фетальной бычьей сыворотки, 2 MM глу5 тамина, 2 MM пирувата, по 100 ед./мл пенициллина и стрептомицина, В первые 3 недели после гибридизации в среду добавляют 10 М гипоксантина, 4 10 M тимидина, так как клетки миеломы $р2/О Ag14

"0 дефектны по ферменту гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазе. Посевная доза

10 клеток в 1 мл, Клетки выращивают в пластиковых флаконах при 37 С в атмосфере 5 -ного С02, пересевая один раз в 2-3

"5 дня, кратность рассева 1:5.

Культивирование гибридомы в организме животного, Для выращивания гибридом в асцитной форме клетки (по 107) вводят в брюшную полость мышей BALB/c, предва20 рительно (эа 7-10 суток) иньекцированных пристаном. Смешанные асцитные и солидные опухоли развиваются через 10-14 дней.

Характеристика полезного продукта.

МКА, продуцируемые штаммом 3Н302, относятся к подклассу lgGI. Они взаимодействуют со свободными и в составе целых иммуноглобулинов к -цепями Ig человека и преципитируют IgG человека.

Продуктивность штамма, стабильность

30 биосинтеза антител. Секреция МКА через

2-3 дня культивирования In vitro составляла 5-10 мкг/мл, а асцитной жидкости — 5 мгlмл. Контроль продуктивности осуществляют с помощью твердофазного иммуно35 ферментного анализа. Продукция антител сохраняется в течение 30 пассажей в культуре и 25 пассажей на животных.

Способ криоконсервирования. Для длительного хранения клетки штамма замора40 живают в фетальной бычьей сыворотке с добавлением 10 диметилсульфоксида. Режим замораживания: сутки при -70 С, затем ампулы с клетками переносят в жидкий азот.

Размораживают клетки. перенося ампулу из жидкого азота в водяную баню на 37 С.

Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 70-80 (по окрашиванию трипановым синим).

Контроль контаминации. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микроплазмой не обнаружено при окрашивании красителями на ДНК.

Пример 1, Гибридомные клетки помещают в пластиковый флакон площадью 25 см в 5 мл среды RPMI-1640 с 10 феталь2 ной бычьей сывороткой, 2 мМ глутамина, 2 мМ пирувата, по 100 ед/мл пенициллина и

2003681 стрептомицина. Клетки культивируют 2-3 дня при 37 С в атмосфере. содержащей 5%

С02. Культуральную среду собирают, центрифугируют 10 ми при 800 об/ мин. Супернатант, содержащий МКА к легким- к цепям

Ig человека, используют в иммуноферментном анализе. В качестве антигенов вносят белки Бенс-Джонса (выделенные из мочи больных миеломной болезнью методами переосаждения сернокислым аммонием c последующей ионообмен ной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе): Ели il, Чер Я, Ден к, Ива к, Кри к, Род K и моноклональные сывороточные иммуноглобулины человека:

IgGI Раз к, IgGI Pow А, tgGI Гол к, lgGI

Усак, IgGI Бог А, IgG2 Боб к, IgG4 Бер к, IgG4 б/н к, IgM к, tgAil. Эти иммуно|лобулины выделяют из сыворотки крови больных миеломной болезнью путем высаливания сернокислым аммонием с последующей ионообмен ной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе (lgG, (9А), а также из сыворотки крови больного болезнью Вальденетрема методом переосаждения бидистиллированной водой с последующей гель-фильтрацией на Ультанеле АсА 22 (IgM). Антигены разводят до концентрации

10 мкг/мл в 90,05 M Na- карбонатном буфере, рН 9,2 и вносят по 50 мкл в лунку 96-луночных пластиковых планшетов.

- Инкубируют в течение 60 мин. при 37 С, затем раствор сливают и вносят по 100 мкл на лунку 1%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина (60 мин при 37 С), После окончания инкубации раствор альбумина сливают, планшет промывают холодной водой и 0,.005 М фосфатным буфером, рН 7,4, с 0,15М NaCI и 0,05% таином (PBST), вносят супернатант культуральной среды по 50 мкл в лунку и инкубируют при 37 С. Через 60 мин раствор сливают, промывают лунки холодной водой и PBST, добавляют по 50 мкл конъюгата кроличьих антител против IgG мыши с пероксидазой в разведении 1:500 в растворе PBST и инкубируют при 37 С 60 мин. После тщательной промывки в лунки вносят 0,4 MM раствор субстрата -2,2 -азино-ди-(3-зтилбензтиазолинсульфонат /6/) (ABTS) в 0,05 M Na-цитратном бефере рН 4,0 с добавлением перекиси водорода до конечной концентрации 0,01% и инкубируют на шейкере при комнатной температуре (20 С) в течение 30 мин. Затем оценивают резульштамма 3H2D2 вносят в центральную лунку.

35 В боковые лунки вносят tgGI Рош, lgG4 Бер.

50

ЗО таты реакции на спектрофотометре при длине волны 405 нм, Полученные результаты. выраженные в процентах от максимальной экстинкции, представлены в таблице, Данные таблицы свидетельствуют о том, что гибридный штамм 3H2DA прдуцирует МКА, взаимодействующие со свободными и входящими в состав целых молекул

K-цепями иммуноглобулинов человека.

Пример 2.Используют два препарата моноклональных человеческих igG, выделенных из сыворотки крови больных миеломной болезнью. Определение типа легкой цепи проводят путем твердофаэного иммуноферментного анализа, как описано выше.

Получа от следующие результаты (каждый опыт продублирован):

Антиген Экстинкция

IgG4 Жел 1,27; 1,20

IgG2 Рыб 0,05; 0,04

Альбумин 0,04; 0,03

Таким образом, с помощью полученных

МКА определяют, что igG4 Жел содержит легкие цепи к-типа, Ig62 Рыб — л.-типа. Это подтверждает возможность использования антител ЗН20А для определения типа легких цепей Ig еловека.

Пример 3. На стеклянную пластину наливают 1,3%-íûé раствор агара B 0,005 M фосфатном буфере, рН 7.1, с 0,15 М NaCI.

Пробойником формируют лунки на расстоянии 0,6 см друг от друга. Асцитную жидкость

Через 24 ч при взаимодействии IgG4 Бер с антителами ЗН2Г2 формируются полосы преципитации, с tgGl Рош полосы не образуются.

Таким образом, полученные MKA nt-,eципитируют tgG человека, в состав которых входят легкие к -цепи. Это свойство поэволяет использовать МКА 3H2D2 для определения типа легкой цепи tgG человека методом двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони и другими методами преципитации, что имеет определенные перспективы для иммунодиагностики миеломной болезни, аутоиммугпfblx заболеваний и других патологических состяний, (56) 1. Авторское свидетельство СССР

N. 1402617, кл. С 12 N 5/00 1908.

2003681

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых кле-. ток животных Mus musculus 1 ВСКК(П) Составитель М.Серова

Техред M.Ìîðãåíòàë

O.Ãóñòè

Корректор

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Редактор Л.Павлова

Заказ 3308

N567, используемый для получения моноклональных антител к легким к - цепям 19 человека.