Способ определения антител к индивидуальным белкам ретровирусов человека

 

Использование: медицина, иммунная биотехнология и лабораторная диагностика. Целью изобретения является повышение эффективности и удешевление способа. Сущность изобретения: при определении антител к индивидуальным белкам ретровирусов человека в качестве антигенного компонента иммунодиагностических тест-систем используют набор из нескольких, иммобилизованных по отдельности синтетических пептидов, соответствующих разным антигенным детерминантам нескольких диагностически значимых белков ретровирусов человека, включая синтетические пептиды белков, кодируемых геном env. Последнее повышает диагностическую чувствительность способа и удешевляет его стоимость. 6 з.п.ф-лы, 4 табл.

Изобретение относится к иммунной биотехнологии и лабораторной диагностике и может быть применено при конструировании диагностических тест-систем, предназначенных для определения антител к индивидуальным белкам ретровирусов человека.

Лабораторная диагностика инфекций, вызываемых ретровирусами человека (Т-лимфотропным вирусом человека I типа (НТLV-I), Т-лимфотропным вирусом человека II типа (НТLV-II), вирусом иммунодефицита человека 1 типа (НIV-1) и вирусом иммунодефицита человека 2 типа (НIV-2) основывается на использовании различных подходов, среди которых превалируют методы серологической иммунодиагностики.

В соответствии официальными и международно принятыми рекомендациями, серологическое тестирование на наличие антител к ретровирусам человека НТLV-I, НТLV-II, HIV-1 и HIV-2 включает двухэтапную процедуру. На первом этапе проводится обследование образцов крови с использованием скринирующих тест-систем, предназначенных для суммарного обнаружения специфических антител. На втором этапе обследования выявленные при скрининге позитивные образцы подвергают подтверждающему контролю, заключающемуся в комплексной интерпретации "спектрального" состава антител к индивидуальным вирусным белкам. Для этой цели в настоящее время используют тест-системы белкового иммуноблоттинга (ИБ) и радиоиммунопреципитационного анализа (РИПА).

В 1990 г. ВОЗ опубликованы новые критерии для интерпретации результатов тестов, подтверждающих серопозитивность по антителам к ретровирусам человека (World Health Organization. Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). Proposed WHO criteria for interpreting results from Western blot assays for HIV-1, HIV-2, and HTLV-1/HTLV-II // Weekly Epidem. Rec. 1990, vol.65, p. 281-283). Согласно новым пересмотренным критериям, образец сыворотки или плазмы крови является положительным по антителам к: НТLV-I/НТLV-II, если он демонстрирует иммунореактивность, по меньшей мере с одним белковым продуктом гена env (предшественником gp62/68 или надмембранным гликопротеином gp46/gp46) и одним белковым продуктом гена gag (кор-белком р24/р24 или матрикс-белком р19/р21); НIV-1/HIV-2, если он демонстрирует иммунореактивность, по-меньшей мере, с двумя белковыми продуктами гена env (предшественником gp160/gp140, надмембранным гликопротеином gp120/gp125 или трансмембранным гликопротеином gp41/gp36).

Образец сыворотки или плазмы крови является отрицательным по антителам к ретровирусам при отсутствии реактивности с ретровирус-специфическими белками. Образец сыворотки или плазмы крови является неопределенным по антителам к ретровирусам при реактивности, не рассматриваемой как положительная или отрицательная.

При оценке диагностических показателей подтверждающих тест-систем ИБ установлено, что при применении данного метода эффективно выявляются антитела направленные к белкам, кодируемым геном gag и с меньшей чувствительностью обнаруживаются антитела к env-белкам ретровирусов (Т.М.Hartley et al.//J. Clin. Microbiol. 1990, vol. 28, p. 646-650). Кроме того, культивирование ретровирусов в продуцирующих клетках является инфекционно опасным, дорогостоящим и трудоемким, а получение вирусного лизата не обеспечивает стандартности антигенов.

Перечисленные недостатки определения антител к индивидуальным ретровирусным белкам в ИБ на основе вирусных антигенов могут быть преодолены созданием антигенов искусственного происхождения пептидов, синтезированных химическими способами. Известно, что синтетические пептиды, соответствующие аминокислотной последовательности антигенов вирусных белков, могут быть использованы для выявления противовирусных антител (Применение синтетических антигенов для диагностики инфекционных болезней / Доклад Научной группы ВОЗ. Женева: 1991, с. 75). Синтетические пептиды обеспечивают инфекционную безопасность как при производстве, так и при применении; высокую диагностическую чувствительность, специфичность и стандартность в результате доступности структуры для контроля; стабильность неопределено долгое время; низкую себестоимость антигенного компонента.

Использование для определения антител к индивидуальным белкам ретровирусов человека иммунореактивных синтетических пептидов из белков, рекомендуемых для подтверждения серопозитивности, может представить эффективную альтернативу методам ИБ и РИПА на основе вирусных антигенов.

Наиболее близким аналогом изобретения является способ определения антител к индивидуальным белкам в иммуноблоттинге, основанном на использовании вирусных белков НIV-1, иммобилизованных на нитроцеллюлозную мембрану (Huisman J. G. Immunoblotting: an amerging technique in immunohematology // Vox Sang. 1986, vol.59, p. 129-136).

Целью изобретения является повышение эффективности и удешевление способа.

Технический результат выражается в повышении диагностической чувствительности иммунодиагностических тест-систем (определяющих антитела к индивидуальным белкам ретровирусов человека) к антителам, направленным к ретровирусным белкам, кодируемым геном env, а также в снижении стоимости антигенного компонента тест-систем. Технический результат достигается тем, что в качестве антигенного компонента иммунодиагностических тест-систем используют набор из нескольких, иммобилизованных по отдельности, синтетических пептидов, соответствующих разным антигенным детерминантам нескольких диагностически значимых белков ретровирусов человека, включая синтетические пептиды белков, кодируемых геном env. Это позволяет проводить комплексную оценку реактивности исследуемых образцов биологической жидкости с индивидуальными синтетическими пептидами белков ретровирусов человека, в том числе с синтетическими пептидами белков, кодируемых геном env. Таким образом, происходит индивидуальное определение антител ко всем, необходимым для подтверждения противоретровирусной серопозитивности, ретровирусным белкам.

Отличительным от наиболее близкого аналога признаком являются использование в иммунодиагностических тест-системах для определения антител к индивидуальным белкам ретровирусов человека в качестве антигенов синтетических пептидов белков ретровирусов человека.

Предпочтительным является использование в иммунодиагностических тест-системах (ИБ, РИПА, иммуноферментный анализ, радиоиммунный анализ, реакции агглютинации и др.) для определения антител к индивидуальным белкам ретровирусов человека в качестве антигенов синтетических пептидов белков ретровирусов человека, в диапазоне концентраций при иммобилизации от 0,001 мкг/мл до 1000 мкг/мл.

Более предпочтительным является использование в твердофазной иммуноферментной (ИФА) тест-системе для определения антител к индивидуальным белкам ретровирусов человека в качестве антигенов синтетических пептидов (в диапазоне концентраций при иммобилизации от 0,1 мкг/мл до 100 мкг/мл) ретровирусных белков gp46 env НТLV-I, p24 gag НТLV-I, p19 gag НТLV-I, gp46 env НТLV-II, p24 gag НТLV-II, p21 gag НТLV-II, gp120 env HIV-1, gp41 env HIV-1, gp125 env HIV-2, gp36 env HIV-2, наличие антител к которым является необходимым для подтверждения противоретровирусной серопозитивности.

П р и м е р 1. При конструировании диагностической ИФА тест-системы, предназначенной для определения антител к индивидуальным белкам НIV-1, в качестве антигенного компонента применяют набор из четырех, иммобилизованных по отдельности в разные лунки планшета, синтетических пептидов, обладающих специфичностью антигенных детерминант белков р24 gag, gp120 env и gp41 env HIV-1 (формулы и принадлежность пептидов приведены в табл. 1).

По результатам испытания контрольных сывороток, содержащих и не содержащих антитела к НIV-1, проводят сравнение диагностической чувствительности тест-систем: а) предлагаемого ИФА с использованием синтетических пептидов белков НIV-1; б) ранее известного коммерческого ИБ фирмы Du Pont "HIV Western Blot" с использованием вирусных белков.

Испытание сывороток в ИФА проводят по следующей схеме.

Пептиды синтезируют твердофазным методом по стандартной методике (Andreev S.M. et al. // Biomed. Sci. 1991. vol.2. p. 271-278).

Пептиды формулы (I), (II), (III) и (IV) сорбируют по отдельности по 100 мкл в лунки 96-луночного полистиролового планшета "Greiner" (Германия) в концентрациях по 20 мкг/мл в 0,01 М карбонатном буфере (рН 9,6) в течение 12-16 ч при 4^оС. По истечении указанного времени сорбции пептидов, лунки планшета четырехкратно отмывают 0,01 М фосфатносолевым буфером, содержащим 0,05% Твина-20 (ФСБ-Т).

Свободные сайты твердой фазы забивают путем сорбции 3%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) в ФСБ-Т по 100 мкл в лунку при 37^оС в течение 1 ч, после чего лунки двукратно отмывают раствором ФСБ-Т.

Сыворотки в разведении 1:20 в ФСБ-Т, содержащем 0,5% БСА, вносят по 100 мкл в лунки планшета с иммобилизованными пептидами и инкубируют при 37^оС 0,5 ч, после чего лунки четырехкратно отмывают раствором ФСБ-Т.

В лунки вносят по 100 мкл протеина А St. aureus в рабочем разведении в ФСБ-Т, содержащем 0,5% БСА, и инкубируют 0,5 ч при 37^оС, после чего лунки четырехкратно отмывают ФСБ-Т.

В лунки вносят по 100 мкл хромогенного энзим-субстрата, содержащего 0,032% ортофенилендиамина в 0,1 М цитратно-фосфатном буфере (рН 5,0) и 0,012% Н₂О₂, и инкубируют 10 мин в темноте при комнатной температуре. Ферментативную реакцию останавливают добавлением в каждую лунку по 50 мкл 3 М раствора Н₂SO₄.

Величину экстинкции определяют с помощью фотометра при длине волны 492 нм.

Интерпретацию результатов осуществляют следующим образом.

Вычисляют величину контрольного уровня (КY) по формуле КY Mx2, где М среднее значение экстинкции, полученное при испытании контрольных сывороток, не содержащих антитела к вирусу НIV-1. Результат испытания считают положительным, если уровень экстинкции, полученный для испытуемого образца, находится в пределах +/-5% КY (результат "+/-) или более, чем на 5% превышает KY (результат "+", "++", "+++"). Результат испытания считают отрицательным, если уровень экстинкции, полученный для испытуемого образца, более, чем на 5% ниже КY (результат "-").

Испытание сывороток в коммерческом ИБ фирмы Du Pont проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации тест-системы.

Результаты испытания контрольных сывороток, содержащих антитела к вирусу НIV-1, представлены в табл. 2.

Представленные результаты свидетельствуют о том, что в предлагаемой пептидной тест-системе ИФА для всех контрольных положительных сывороток, заведомо содержащих антитела к НIV-1, была установлена иммунореактивность с синтетическими пептидами, по меньшей мере двух белковых продуктов гена env НIV-1 gp120 и gp41, что отвечает официальным критериям подтвержденной анти-НIV-1 серопозитивности. Диагностическая чувствительность предлагаемого пептидного ИФА к антителам против белков НIV-1, кодируемых геном env, превысила этот показатель для сравниваемого ИБ, который в ряде сывороток не определял антитела к gp120 и gp41 env.

П р и м е р 2. При конструировании диагностической ИФА тест-системы, предназначенной для определения антител к индивидуальным белкам НТLV-I, в качестве антигенного компонента применяют набор из трех, иммобилизованных по отдельности в разные лунки планшета, синтетических пептидов, обладающих специфичностью антигенных детерминант белков р19 gag, gp46 env и gp21 env НТLV-I (формулы, принадлежность и концентрации пептидов при сорбции приведены в табл. 3).

По результатам испытания контрольных сывороток, содержащих и не содержащих антитела к НТLV-I, проводят сравнение диагностической чувствительности тест-систем: а) предлагаемого ИФА с использованием синтетических пептидов белков НТLV-I; б) ранее известного ИБ с использованием вирусных белков из лизата НТLV-I-продуцирующих клеток МТ-2 и С91/РL.

Испытание сывороток в ИФА и интерпретацию результатов проводят аналогично примеру 1.

Реакцию ИБ проводят следующим образом. На слоты 0,5 см полиакриламидного геля толщиной в 1 мм наслаивают количество лизата эквивалентное 10-15 мкг белка. Электрофорез с последующим электропереносом проводят по стандартной методике (М.Sauter, Mueller-Lantzsch // Virus Res. 1987, vol.8, p.141-152.). Для детекции белковых полос в ИБ используют компоненты фирмы "Dakopatts", а в качестве блокировочного раствора 10% сухое обезжиренное молоко в фосфатном буфере (ФБ). Сыворотки считают позитивными, если они дают специфические полосы с лизатами клеток МТ-2 и С91/РL, соответствующие структурным вирусным белкам НТLV-I, и не дают соответствующих полос с лизатами негативных клеток МОLT-4.

Результаты испытания контрольных сывороток, содержащих и не содержащих антитела к вирусу НТLV-I, представлены в табл. 4.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что в предлагаемой пептидной тест-системе ИФА для всех контрольных положительных сывороток, заведомо содержащих антитела к НТLV-I, было установлена иммунореактивность как с одним или двумя синтетическими пептидами белковых продуктов гена env (надмембранного гликопротеина gp46 env или трансмембранного гликопротеина gp21), так и с синтетическим пептидом матрикс-белка p19 gag, что отвечает официальным критериям подтвержденной анти-НТLV-I серопозитивности. Диагностическая чувствительность предлагаемого пептидного ИФА к антителам против гликопротеинов НТLV-I, кодируемых геном еnv, превысила этот показатель для сравниваемого ИБ, который в ряде сывороток не определял env-специфические антитела.

Предлагаемый способ определения антител к индивидуальным белкам ретровирусов человека позволяет повысить диагностическую чувствительность иммунодиагностических тест-систем к env-специфическим антителам, необходимым для подтверждения противоретровирусной серопозитивности, а также снизить стоимость антигенного компонента тест-систем за счет использования недорогостоящих синтетических пептидных антигенов.

Формула изобретения

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ИНДИВИДУАЛЬНЫМ БЕЛКАМ РЕТРОВИРУСОВ ЧЕЛОВЕКА, включающий контактирование исследуемого образца биологической жидкости с набором, состоящим из нескольких, иммобилизованных по отдельности антигенов белков ретровирусов человека, с последующей регистрацией результатов иммунологической реакции, отличающийся тем, что исследуемый образец контактируют с набором синтетических пептидов, соответствующих разным антигенным детерминантам нескольких диагностически значимых белков ретровирусов человека, включая синтетические пептиды белков, кодируемых геном env.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что определяют антитела к индивидуальным белкам ретровирусов: вируса иммунодефицита человека 1 типа (HTV-I) и Т-лимфотропного вируса человека 1 типа (HTLV-I).

3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что исследуемый образец контактируют с синтетическими пептидами, соответствующими антигенным детерминантам белков, кодируемых генеами env ретровирусов человека : gp46 env HTLV-I, gp21 env HTLV-I, gp120 env HIV-i, gp41 env HIV-i.

4. Способ по пп. 1 - 3, отличающийся тем, что исследуемый образец контактируют с набором синтетических пептидов, соответсвующих антигенным детерминантам белков p24 gag, gp120 env и gp41 env HIV-I.

5. Способ по пп. 1 - 4, отличающийся тем, что исследуемый образец контактируют с набором синтетических пептидов, соответсвующих антигенным детерминантам белков p19 gag, gp46 env и gp 21 env HTLV-I.

6. Способ по пп. 1 - 5, отличающийся тем, что синтетические пептиды используют в диапазоне концентраций при иммобилизации от 0,1 до 100 мкг/мл.

7. Способ по пп. 1-6, отличающийся тем, что синтетические пептиды имобилизуют в лунках планшетов для иммуноферментного анализа.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4