Штамм гибридных культивируемых клеток мыши mus musculus l., используемый для получения моноклональных антител к тиреотропному гормону человека

 

Использование: медицинская биотехнология, разработка методов диагностики заболеваний, связанных с нарушениями функций гипофиза и щитовидной железы. Сущность изобретения: получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши, продуцирующего высокоаффинные моноклональные антитела (МКА) к тиреотропному гормону (ТТГ) человека. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии Ba lb/с с клетками миеломы X 63 Аg. 653. МКА относится к изотипу IgGi, их концентрация в культуральной жидкости составляет 15-20 мкг/мл, в асцитной жидкости 5-10 мг/л. Разработанная на основе полученных МКА тест-система позволяет определять ТТГ в биологических жидкостях человека в диапазоне концентраций 2,4-50,0 мк МЕ/мл. 2 ил., 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения моноклональных антител (МкАт) к тиреотропному гормону (ТТГ) человека.

Для правильной и своевременной диагностики заболеваний, связанных с нарушениями функций гипофиза и щитовидной железы, а также для контроля за эффективностью лечения необходима оценка уровня ТТГ в крови человека. Современные методы иммуноанализа (иммуноферментный, иммунофлюоресцентный, иммунорадиометрический) основаны на использовании моноклональных антител.

В ряде лабораторий за рубежом были получены моноклональные антитела к ТТГ, константы связывания которых составляли от 10⁸ до 10¹¹ М^-1 M.M.Benkirane, D. Bon, S. Costagliola, F. Paolucci, B.Darbouret, P.Prince, P.Carayon//Endocrinology. 1987. V. 121, N 3. 1171-1177; J.M.Braun, G.Charreire//J. Immumol. Meth. 1990. 132, N 2. 197-203; М.Soos, K.Siddle//J.Immunol.Meth. 1982. V. 51, N 1 57-64).

Известный отечественный штамм гибридных культивируемых клеток Т-32 (А.С. СССР N 1742324, кл. С 12 N 5/00, 1992) целесообразно рассматривать как наиболее близкий аналог предлагаемого нами технического решения по ряду признаков.

Предложенный нами штамм аналогичен прототипу по способу получения (гибридизация спленоцитов мышей линии Balb/c с клетками мышиной миеломы Х63 Ag. 653). Также общим качеством является высокая специфичность к тиреотропному гормону человека (ТТГ), отсутствие перекрестных реакций с родственными гликопротеидными гормонами гипофиза и плаценты (ЛГ, ФСГ, ХГЧ).

Аффинность антител, продуцируемых штаммом Т-32, достаточна для создания иммуноферментной тест-системы, позволяющей определять уровень ТТГ в биологических жидкостях человека в диапазоне концентраций от 2,4 до 50,0 мкМЕ/мл. Однако, нормальные значения концентрации ТТГ в сыворотке крови колеблются от 0,30 до 5,00 мкМЕ/мл. Следовательно, такая тест-система позволит проводить только грубый скрининг и выявлять пациентов с повышенными значениями ТТГ (соответствует гипотиреозу). При этом большая часть нормальных значений и пониженные концентрации ТТГ не смогут быть определены по причине недостаточной чувствительности.

Целью предлагаемого технологического решения было получение стабильных гибридных культивируемых клеток мыши линии BALB/c, продуцирующих высокоаффинные МкАт к ТТГ человека, не дающие перрекрестных реакций со структурно подобными гликопротеидными гормонами (лютеинизирующим, фолликулостимулирующим и хорионическим гонадотропным).

Аффинность предлагаемых моноклональных антител делает их пригодными для разработки иммунометрических тест-систем для определения ТТГ в биологических жидкостях с чувствительностью не более 0,15 мкМЕ/мл. Такая чувствительность позволяет проводить дифференциальную диагностику нормальных, пониженных и повышенных концентраций ТТГ в биологических жидкостях (соответствует эу-, гипер- и гипотереозу).

Для получения гибридомных клеток, продуцирующих МкАТ, клетки мышиной миеломной линии Х63. Аg8.653 гибридизовали с помощью 50% полиэтиленгликоля 4000 со спленоцитами мыши линии BALB/с, иммунизированной ТТГ.

Самок мышей линии BALB/с иммунизировали в течение 4 месяцев тиреотропным гормоном человека. Для иммунизации использовали гормон с иммунологической активностью не менее 6 МЕ/мг.

После гибридизации клетки ресуспендировали в среде RPMI 1640, содержащей компоненты селективной среды (гипоксантин, аминоптерин, тимидин). Супернатанты анилизировали иммунометрическим методом. Специфичность моноклональных антител оценивали в конкурентном ИФА. Положительные клоны реклонировали и наращивали в виде асцитной опухоли в мышах линии BALB/с, которым за 10-12 дней до введения клеток вводили пристан. Антитела из асцитных жидкостей выделяли осаждением сульфатом аммония с последующей ионнообменной хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе. Полученные МкАт были использованы в иммуноферментном двусайтовом методе определения ТТГ.

Получение штамма: 1. Иммунизация.

Самок линии BALB/с иммунизировали внутрибрюшинно в течение 4 месяцев, вводя каждые 2 недели по 30 мкг препарата ТТГ в 0,5 мл эмульсии PBS с полным (первая инъекция) либо с неполным (последующие инъекции) адъювантом Фрейнда. За 4 дня до гибридизации вводили внутривенно 20 мкг ТТГ в PBS. Для иммунизации использовали препарат ТТГ, который, согласно данным анализа, проведенного с помощью тест-системы фирмы Вio-Merieux, имел иммунологическую активность не менее 6 МЕ/мг.

2. Получение гибридом.

Гибридизацию спленоцитов иммунизированных животных проводили с клетками миеломной линии Х63.Ag8.653 в соотношении клеток 2:1 по методу Келера-Мильштейна с использованием ПЭГ 4000. После гибридизации клетки ресуспендировали в среде RPMI 1640 с двойной концентрацией компонентов селективной среды (гипоксантина, аминоптерина, тимидина), и рассеивали по 100 мкл в 96-луночные планшеты, содержащие по 100 мкл фидерного слоя макрофагов. Культуральная среда на всех этапах выращивания гибридом содержала 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 4 мМ глутамина. Гибридомы клонировали не менее 2 раз методом лимитирующих разведений. Наличие положительных клонов определяли методом иммуноферментного анализа.

3. Скрининг первичных клонов.

Тестирование культуральной жидкости на наличие антител к ТТГ проводили иммунометрическим двухсайтовым методом. В качестве твердой фазы использовали полистироловые планшеты с максимальной сорбирующей способностью фирмы "Нунк".

Планшеты сенсибилизировали иммуноглобулиновой фракцией кроличьей антисыворотки к ТТГ (Кооператив "Гормон"). Антитела сорбировали из раствора с концентрацией 10 мкг/мл в PBS в течение ночи при 4^оС или 1,5 ч при 37^оС. Все последующие инкубации проводили 1 ч при 37^оС. Между инкубациями несвязавшиеся компоненты отмывали PBS с 0,05% твин-20.

После блокирования оставшихся свободными участков связывания на пластике 0,5% раствором желатина в PBS вносили ТТГ в концентрации 10 нг/мл. Затем вносили культуральные супернатанты. Связавшиеся с антигеном антитела определяли с помощью пероксидазного коньюгата кроличьих антител к IgG мыши. В качестве хромогена использовали ортофенилендиамин. Оптическое поглощение измеряли на плашечном спектрофотометре "Мультискан".

4. Производство моноклональных антител в виде асцита.

Положительные моноклоны наращивали в виде асцитной опухоли в мышах линии BALB/c, которым за 7-10 дней до введения клеток вводили по 0,5 мл пристана. После развития у мышей асцитной опухоли животных забивали цервикальной дислокацией, асцитную жидкость собирали, клетки удаляли центрифугированием.

Асцитную жидкость, содержащую 5-10 мг/мл антител, замораживали при -20^оС.

5. Очистка моноклональных антител.

Антитела из асцитной жидкости выделяли осаждением иммуноглобулиновой фракции 50% от насыщения сульфатом аммония с последующим обессоливанием на колонке с сефадексом G-25 и ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе. Антитела связывали с целлюлозой, уравновешенной 5 мМ натрий-фосфатным буфером, рН 8,0; элюцию проводили в градиенте ионной силы от 0,01 до 0,30 М, создаваемом хлоридом натрия.

Чистоту проверяли электрофорезом в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Примеси составили не более 5% Определение подкласса полученных антител в культуральном супернананте проводили с использованием моноспецифических антител к изотипам мышиных иммуноглобулинов согласно рекомендациям фирмы-поставщика. Антитела, синтезируемые клоном 625D, относятся к подклассу IgG1.

6. Определение специфичности моноклональных антител.

Специфичность оценивали конкурентным ИФА. Для этого в лунки полистироловых планшетов вносили раствор ТТГ в концентрации 400 нг/мл (2 мМЕ/мл) в PBS и инкубировали в течение ночи при 4^оС или 1,5 ч при 37^оС. Для блокирования неспецифического связывания использовали 0,5% раствор желатина в PBS. Затем одновременно инкубировали исследуемые антитела в избыточной концентрации (5 мкг/мл) и гормоны: ЛГ, ФСГ, ХГЧ, бета-субъединица ТТГ и ТТГ в диапазоне концентраций от 10 до 1000 нг/мл, что соответствует 0,07-7,00 МЕ/мл для ЛГ и ФСГ; 0,14-14,00 МЕ/мл для ХГЧ и 0,07-7,00 мкМЕ/мл для ТТГ. Связавшиеся с иммобилизованным тиротропином моноклональные антитела проявляли пероксидазным конъюгатом кроличьих антител к IgG мыши. Процент ингибирования связывания моноклональных антител с ТТГ, иммобилизованным на фазе, при добавлении конкурирующих гормонов в раствор, определяли по формуле (Во/B) х 100% где Во концентрация ТТГ, иммобилизованного на фазе, В концентрации ЛГ, ФСГ, ХГЧ и бета-субъединицы ТТГ в растворе, при которых достигается 50% ингибирования связывания ТТГ, иммобилизованного на фазе, с данными антителами.

Полученные антитела В2Т взаимодействуют с антигенной детерминантой, экспонированной на бета-субъединице в составе интактного ТТГ. При этом процент перекрестных реакций с ЛГ, ФСГ и ХГЧ составил не более 0,06% а со свободной бета-субъединицей ТТГ 1,60% Полученный штамм гибридных культивируемых клеток депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур под номером 625D.

Штамм характеризуется следующими признаками: Стандартные условия выращивания: 37^оС, 5% СО₂, среда RPMI 1640, содержащая 20% ЭТС.

Культуральные свойства: клетки культивируются в монослое в концентрации 5 ˙ 10⁵ 1 ˙ 10⁶ кл/мл, время субкультивирования составляет около 48 ч.

Характеристика культивирования гибридомы в организме животного: гибридома культивируется в организме мышей линии BALB/с, при перевивке используется доза 5 ˙ 10⁶ клеток на мышь, сенсибилизация животных проводится за 7-10 дней путем в/б инъекции 0,5 мл пристана, асциты обpазуются через 7-14 дней.

Характеристика биосинтеза моноклональных антител: выход моноклональных антител в культуральной жидкости составляет 15-20 мкг/мл, в асцитной жидкости 5-10 мг/мл.

Стабильность продуцирования антител сохраняется на протяжении не менее 20 пассажей в культуре и 3 пассажей на животных.

Характеристика моноклональных антител, продуцируемых гибридомой 625D: гибридома продуцирует моноклональные антитела класса IgG1 к тиротропину человека. Активность моноклональных антител определяется методом гетерогенного иммуноферментного анализа. В качестве антигена используется тиротропин. Специфичность антител оценивали в конкурентном иммуноферментном анализе, используя в качестве конкуpиpующих лютеинизирующий, фоликулостимулирующий гормоны и хорионический гонадотропин. Процент перекрестной реактивности полученных антител с указанными гормонами составил не более 0,07% по молярному соотношению.

Способ криоконсервации гибридомы: криоконсервация гибридомы 625D проводится в ЭТС, содержащей 15% ДМСО. Первые трое суток ампулы с клетками хранятся при -70^оС, затем переносятся в жидкий азот. Жизнеспособность гибридомы оценивали с помощью 0,5% раствора трипанового синего. Жизнеспособность составляет около 80% Использование штамма иллюстрируется следующим примером: П р и м е р 1. Получение конъюгата моноклональных антетил 625D с пероксидазой хрена.

Антитела в концентрации 10 мг/мл в 0,2 М карбонатном буфере, рН 9,6 смешивали с активированной 0,01 М периодатом натрия ПХ в весовом соотношении 1-1,5 1, что соответствует молярному соотношению 1 2,5-3,5. Инкубацию проводили в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего следовал диализ против тысечекратного объема РBS. Конъюгат хранили в 50% глицерине при -20^оС. Рабочее разведение приготовленного таким образом конъюгата составляет не менее 1:1000.

Полученный коньюгат использовали в твердофазном иммунометрическом анализе тиротропина.

П р и м е р 2. Твердофазный иммунометрический анализ тиротропина.

В лунках планшетов для иммуноферментного анализа сорбировали моноклональные антитела 624D в концентрации 10 мкг/мл в 100 мкл PBS в течение 1,5 ч при 37^оС. Последующие инкубации проводили в течение 1 ч при 37^оС. Между инкубациями несвязавшиеся компоненты отмывали PBS, содержащим 0,05% твин-20. Неспецифическое связывание блокировали 0,5% раствором бычьего сывороточного альбумина в PBS. Затем вносили 100 мкл пробы с неизвестной концентрацией ТТГ или стандартного раствора ТТГ. После инкубации и отмывки добавляли 100 мкл пероксидазного конъюгата моноклональных антител 625D к тиротропину.

В качестве хромогена использовали ортофенилендиамин (для приготовления 10 мл субстратного раствора брали 6 мг ортофенилендиамина и 5 мкл 30% перекиси водорода в 0,15 М цитрат-фосфатном буфере, рН 5,0). После развития окраски реакцию останавливали добавлением в планшеты по 100 мкл 4,9% серной кислоты и измеряли оптическое поглощение при 492 нм.

Концентрацию тиротропина в пробе рассчитывали по калибровочной кривой. Для построения этой кривой по приведенной нами в примере схеме в лунки планшетов, заблокированные бычьим сывороточным альбумином, вносили по 100 мкл стандартных проб ТТГ со значениями концентраций: 0,0, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 7,5, 15,0 мкМЕ/мл в параллелях. Определение оптической плотности при 492 нм, образующейся в результате остановки ферментативной реакции серной кислоты, проводили с помощью плашечного спектрофотометра Titertec Multiscan MCC/340.

На фиг. 1 показан образец типичной калибровочной кривой зависимости оптической плотности при 492 нм от концентрации ТТГ в пробе, полученная в результате проведения анализа с помощью 3 различных серий реагентов. Цифровой материал по каждой серии реагентов с указанием стандартных отклонений, рассчитанных на основании 4 параллельных определений, приведен в табл. 1.

Стандартные пробы, использованные для построения калибровочной кривой, были отстандартизованы относительно II Международного стандартного препарата тиротропина человека 80/558. Чувствительность анализа определялась как (х ± 2s), где х среднее значение концентрации, полученное при анализе контрольной пробы, не содержащей тиротропин, s стандартное отклонение.

Предлагаемый нами метод был апробирован также на сыворотках здоровых (эутиреоидных) доноров и пациентов с заболеваниями щитовидной железы (с гипер- и гипотиреозом). Была проведена корреляция результатов, полученных нашим методом со значениями, полученными при тестировании этих же образцов в иммуноферментной тест-системе "TSH-EIA" ("ТТГ-ИФА") производства фирмы Hoffman la Roche (цифровые данные приведены в табл. 2). При этом коэффициент корреляции, рассчитанный на основании сравнения 25 проб, составил 0,995 (фиг. 2).

Таким образом, предлагаемое техническое решение может быть использовано для создания твердофазной иммуноферментной тест-системы для количественного определения тиреотропного гормона в сыворотке крови человека в диапазоне 0,30-15,00 мкМЕ/мл с чувствительностью не более 0,15 мкМЕ/мл. Она может быть применяться в клиническом анализе пациентов для дифференцирования гипо-, гипер-, и эутиреоидных состояний.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток мыши Mus musculus L. ВСКК(П)N 625Д, используемый для получения моноклональных антител к тиреотропному гормону человека.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4

PC4A - Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение

Номер и год публикации бюллетеня: 15-2001

(73) Патентообладатель:
ЗАО "ДИАплюс" (RU)

Договор № 12209 зарегистрирован 28.03.2001

Извещение опубликовано: 27.05.2001        

MM4A - Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 12.06.2006

Извещение опубликовано: 10.06.2007        БИ: 16/2007

---