Способ определения генерации супероксидного анион-радикала клетками в биологическом материале

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения генерации супероксидного анион-радикала (САР) клетками в биологическом материале. Цель изобретения - разработка метода определения генерации CAP суммарно паренхиматозными и интерстициальными (соединительнотканными) клетками внутренних органов. У обследуемого человека или животного получают микробиоптаты при эндоскопии полостных органов (желудка, кишечника, бронхов и др.) или путем забора кусочков тканей неполостных органов (печени, почки и др. ) с помощью биопсийных игл, отмывают их буферной смесью рН 7.35, высушивают фильтровальной бумагой, взвешивают биоптаты с высокой точностью (до 10^-5 г. ), измельчают их глазными ножницами, инкубируют с 0,2% водно-спиртовым раствором тритона Х-100, после чего отмывают измельченные биоптаты от следов тритона, инкубируют их в опыте с супероксид-дисмутазой (СОД),а в контроле - с альбумином, опытные и контрольные измельченные биоптаты инкубируют с восстановленным никотинамидадениндинуклеотидфосфатом (NАДPН), стимулирующим генерацию CAP клетками, и нитросиним тетразолием, выявляющим CAP в виде формазанов, при 36,9-37,0^oС 40-60 минут. Останавливают реакцию добавлением 5М соляной кислоты, затем проводят центрифугирование и осадок формазанов экстрагируют смесью диметилсульфоксида и хлороформа, взятых в соотношении 2: 1, при 55,0-59,0^oС с последующим определением супероксидного анион-радикала спектрофотометрически.

Полученные спектрофотометрические данные оптической плотности пересчитывают на 1 мг биоптата. Разность значений между контрольной и опытной пробой показывает концентрацию CAP по оптической плотности продуктов реакции взаимодействия CAP и нитросинего тетразолия - формазанов. Прототип не пригоден для определения генерации CAP суммарно паренхиматозными и интерстициальными клетками тканей внутренних органов.

Изобретение относится к медицине, в частности к патофизиологии, гастроэнтерологии и биохимии.

Известен способ определения генерации супероксидного анион-радикала (CAP-O^-₂) лейкоцитами крови при фагоцитозе, включающий забор крови, выделение лейкоцитов, инкубацию их с опсонизированными частицами зимозана и нитросиним тетрозолием при 38,5 39,0^o С, остановка реакции добавлением 5М соляной кислоты, экстракцию продукта реакции взаимодействия супероксидного анион-радикала и НСТ-формазанов смесью диметилсульфоксида (ДМСО) и хлороформа в соотношении 2: 1 при 55,0 59,0^oС и спектрофотометрическое измерение концентрации формазанов по оптической плотности, по которой и судят об интенсивности генерации (образования) супероксидного анион-радикала (см. Коган А.Х. и др. Авторское свидетельство N 1735784 от 22.01.1992. Бюллетень изобретений N 19 (46) 23.05.1992). Недостатком способа является невозможность его применения для определения генерации CAP суммарно паренхиматозными и интерстициальными клетками внутренних органов.

Целью предложения является разработка метода определения генерации CAP суммарно паренхиматозными и интерстициальными клетками внутренних органов. Указанная цель достигается путем получения микробиоптатов у человека и животных при эндоскопии полостных органов или путем забора кусочков ткани не полостных органов (печени, почек, мышц и др.) с помощью специальных биопсийных игл, и, отмыванием их от крови, взвешиванием с высокой точностью (до 10^-5 г) тканевых кусочков, измельчением их, инкубацией с 0,2% водно-спиртовым раствором тритона Х-100, повторным отмыванием измельченных кусочков от следов тритона, инкубацией с СОД (в контроле с альбумином), добавлением восстановленного никотинамидадениндинуклиотидфосфата (NАДPН), стимулирующего генерацию CAP, добавлением НСТ, остановной реакции введением 5М соляной кислоты, экстракцией продукта реакции взаимодействия CAP и НСТ формазанов и спектрофотометрическим определением их концентрации.

Предложенный способ осуществляется следующим образом: у пациента (человека или животного) при эндоскопическом исследовании полостных органов (желудка, кишечника и др.) иссекают кусочек слизистой d l,6 2,5 мм. При исследовании не полостных органов (печени, мышц и др.) у человека производят забор кусочка ткани специальной пункционной иглой, а у животных род анастезией обычно резорцируют нужный кусочек ткани, отмывают его буферной смесью (БС: 2,5 мл фосфатно-щелочного буфера + 7,5 мл 0,9% р-ра натрия хлорида) pH= 7,35; высушивают фильтровальной бумагой и разрезают глазными ножницами на две примерно одинаковые части (впредь они именуются биоптатами), каждый биоптат взвешивают на аналитических весах с точностью до 10^-5 г. Биоптаты вносят в отдельные пробирки с d l см и L 5-6 см, добавляют к ним по 0,2-0,3 мл БС, измельчают их глазными ножницами на кусочки с d 0,15-0,25 мм, добавляют к ним по 0,5-1 мл 0,2 водно-спиртового р-ра тритона Х-100 для разрыхления мембран и проведения внутрь клеток реагентов необходимых для реакции определения CAP (СОД). Продолжительность инкубации измельченных биоптатов с тритоном в случае исследования слизистой желудка 30 сек, а при исследовании тканей других органов (печени, мозга, сердца, скелетных мышц) 3-5 мин. Центрифугируют (R 17 см) при 1000 об/мин 5-7 мин, удаляют супернатант, отмывают ткано-клеточный осадок в каждой из двух пробирок, трехкратно от остатков тритона поочередным добавлением 2-3 мл БС и с последующим центрифугированием при 1000 об/мин 5-7 мин. Добавляют к каждому ткано-клеточному осадку 0,3 мл БС, после чего к одному из них (условно опытному, соответствующая пробирка тоже опытная) добавляют 250 млг СОД, растворенного в 0,2мл БС, а к другому (контрольному, соответствующая пробирка тоже контрольная) добавляют взамен СОД альбумин в равном кол-ве и в равном объеме БС, инкубируют опытную и контрольную смеси при 36,9-37,0^oС 20 мин; в каждую вводят 0,1 мл 3% NАДPН, растворенного в БC + 0,2 мл 0,2% НСТ в БС.

Приготовленные смеси инкубируют в термостате при 36,9-37,0^oС 40-60 мин, после чего останавливают реакцию добавлением 0,5 мл 5М соляной кислоты. Смеси центрифугируют при 3000 об/мин 10 мин, сливают супернатант из опытных и контрольных пробирок и проводят экстракцию продукта реакции взаимодействия CAP и НСТ формазанов. После этого спектрофотометрически при длине волны 560 нм измеряют концентрацию продукта реакции (взаимодействия O^-₂ и НСТ) фармазанов по оптической плотности в каждом экстракте; измерения проводили против смеси ДМСО + хлороформ (2:1). Результаты измерений 2-х экстрактов суммируются раздельно в опыте с инкубацией с СОД и в контроле с инкубацией с альбумином. Полученные данные оптической плотности пересчитывают на 1 мг биоптата. Разность (дельта) между контрольной и опытной пробой показывает концентрацию CAP(O^-₂) по оптической плотности продуктов реакции взаимодействия CAP с НСТ формазанов в единицах оптической плотности (ЕОП).

Пример.

У исследуемого пациента во время гастроскопии резицируют кусочек слизистой желудка диаметром 1,6-2,5 мм, отмывают его от крови и слизи последовательным погружением в 4-5 стаканчиков с буферной смесью (БС: 2,5 мл фосфатно-щелочного буфера + 7,5 мл физиологического 0,9% раствора NaCl) ph 7,35, после чего биоптат высушивают фильтровальной бумагой; разрезают его глазными ножницами на две, примерно, равные части (которые впредь будут именоваться биоптатами), взвешивают их на аналитических весах с точностью до 10^-5 г. Оба биоптата переносятся в отдельные пробирки с d 1 cм и l 6-7 cм, добавляют по 0,3 мл БС, измельчают глазными ножницами на мелкие кусочки с d 0,15-0,2 мм, центрифугируют при 1000 об/мин 5 мин, супернатант удаляют; к осадку в каждой пробирке добавляют 0,5мл 0,2% водно-спиртового раствора тритона Х-100, инкубируют 30 сек, центрифугируют при 1000 об/мин 5 мин, удаляют супернатант (тритон), осадок трижды отмывают от остатков тритона поочередным добавлением 2-3 мл БС и последующим центрифугированием при 1000 об/мин 5 мин; снова добавляют 0,3 мл БС к каждому биоптату, после чего к одному биоптату (опытному) вводят 250 мкг СОД растворенного в 0,2 мл БС, а ко второму биоптату (контрольному) вводят равное количество альбумина в равном объеме БС; инкубируют опытную и контрольную пробу при 36,9-37,0^oС 20 мин (это время, необходимое для проникновения СОД внутрь клеток, установлено эмпирически). К каждому биоптату в пробирке добавляют 0,1 мл З% раствора NАДPН в БС и 0,2 мл 0,2% раствора нитросинего тетрозолия в БС. Полученные пробы - опытную и контрольную инкубируют в термостате при 37,0^oС 50мин. После этого для остановки реакции в каждую пробирку добавляют 0,5 мл 5М раствора соляной кислоты. Сразу же дважды экстрагировали раздельно гранулы образовавшегося в опытной и контрольной пробе осадка формазанов смесью диметилсульфоксида (ДМСО) с хлороформом в соотношении 2:1 при 55,0^oС; каждый раз по 15мин. Затем проводили спектрофотометрию каждого экстракта при длине волны 560 нм. Спектрофотометрию экстрактов проводили против смеси ДМСО + хлороформ (2:1). Данные спектрофотометрических измерений в опытной и контрольной пробе, раздельно суммировались и пересчитывались на 1 мг биоптата. Разность между контрольной пробой (с альбумином) и опытной (СОД) показывала концентрацию CAP по оптической плотности продуктов реакции взаимодействия CAP и НСТ формазанов в единицах оптической плотности (ЕОП) на 1 мг биоптатов, образовавшихся в клетках ткани исследуемого органа.

Формула изобретения

Способ определения генерации супероксидного анион-радикала клетками в биологическом материале, включающий инкубацию с нитросиним тетразолием, остановку реакции соляной кислотой, экстракцию органическим растворителем продукта реакции взаимодействия супероксидного анион-радикала и нитросинего тетразолия-формазанов, спектрофотометрическое определение их концентрации по оптической плотности, отличающийся тем, что получают тканевый биоптат, отмывают его буферной смесью рН 7,35, инкубируют последовательно с тритоном, затем супероксид-дисмутазой и восстановленным никотинамидадениндинуклеотидфосфатом (НАДФН), на завершающем этапе рассчитывают концентрацию продукта реакции формазанов по оптической плотности на 1 мг биоптата, по которой оценивают интенсивность образования супероксидного анион-радикала суммарно паренхиматозными и интерстициальными клетками.