Способ определения генерации супероксидного анион-радикала фагоцитами в биологическом материале

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения генерации супероксидного анион-радикала ( CAP) фагоцитами.

Цель изобретения - разработка способа определения генерации супероксидного анион-радикала фагоцитами ( макрофагами и эмигрировавшими из крови лейкоцитами тканей внутренних органов ). У обследуемого человека или животного получают микробиоптаты при эндоскопии полостных органов (желудка, кишечника, бронхов и др.) или путем забора кусочков тканей неполостных органов (печени, почки и др.) с помощью биопсийных игл, отмывают их буферной смесью рН=7,35, высушивают фильтровальной бумагой, взвешивают биоптаты с высокой точностью (до 10^-5 г) измельчают их глазными ножницами, инкубируют с 0,2 % водно-спиртовым раствором тритона X-I00, после чего отмывают измельченные биоптаты от следов тритона, инкубируют их в опыте с супероксид-дисмутазой, а в контроле - с альбумином. Опытный и контрольный измельченные биоптаты инкубируют с опсонизированной плазмой крови 4-й группы зимозаном и нитросиним тетразолием при 36,7-37,0^oС 40-60 минут. Останавливают реакцию добавлением 5М соляной кислоты, затем проводят центрифугирование и осадок экстрагируют смесью диметилсульфоксида и хлороформа, взятых в соотношении 2: 1, при 55,0-59,0^oС с последующим спектрофотометрическим определением супероксидного анион-радикала по продукту реакции в экстракте. Полученные спектрофотометрические данные оптической плотности пересчитывают на 1 мг биоптата. Разность между значениями контрольной и опытной проб показывает концентрацию CAP по оптической плотности экстрагированных продуктов реакции взаимодействия CAP и нитросинего тетразолия - формазанов в единицах оптической плотности. Прототип не пригоден для определения генерации CAP фагоцитами тканей внутренних органов.

Изобретение относится к медицине в частности патофизиологии и биохимии. Известен способ определения генерации супероксидного анион радикала (САР - O^-₂) лейкоцитами крови при фагоцитозе включающий забор крови, выделение лейкоцитов, инкубацию их с опсонизированными частицами зимозана и нитросиним тетразолием при 38,5-39,0^oC, остановку реакции добавлением 5М соляной кислоты, экстракцию продукта реакции взаимодействия супероксидного анион - радикала и НСТ формазанов смесью диметилсульфоксида (ДМСО) и хлороформа в соотношении 2:1 при 55,0-59,0^oС и спектрофотометрическое измерение концентрации формазанов по оптической плотности, по которой и судят об интенсивности генерации ( образования ) супероксидного анион радикала, (а.с. N 1735784 от 22.01.1992. Бюллетень изобретений N 19, (46) 23. 05. 92). Недостатком способа является невозможность его применения для определения генерации CAP фагоцитами (макрофагами и лейкоцитами), находящимися в тканях внутренних органов.

Целью предложения является разработка метода определения генерации CAP фагоцитами, находящимися в мягких тканях, внутренних органов у человека и животных и повысить объективность исследований. Указанная цель достигается путем получения микробиоптов у человека и животных при эндоскопии полостных органов (желудка, кишечника, бронхов, мочевого пузыря) или путем забора кусочков ткани не полостных органов с помощью специальных биопсийных игл, приготовлением, взвешиванием с относительно высокой точностью (до 10^-5г) тканевых кусочков, измельчением их, инкубацией с 0,2 водно-спиртовым раствором тритона Х-100, повторным отмыванием измельченных кусочков от следов тритона, инкубацией с СОД (в контроле с альбумином) дополнительной инкубацией с зимозаном, добавлением НСТ, остановкой реакции добавлением 5М соляной кислоты, экстракцией продукта реакции CAP и НСТ фармазонов и спектрофотометрическим определением их концентрации.

Предложенный способ осуществляется следующим образом. У пациента (человека или животного) при эндоскопическом исследовании полостных органов (желудка, кишечника и др.) иссекают кусочек слизистой d 1,6 2,5 мм. При исследовании не полостных органов (печени, мышц и др.) у человека производят забор кусочка ткани специальной пункционной иглой, а у животных под анастезией резецируют нужный кусочек ткани, отмывают его буферной смесью (БС: 2,5 мл фосфатнощелочного буфера + 7,5 мл 0,9% р-ра натрия хлорида) pH=7,35; высушивают фильтровальной бумагой и разрезают глазными ножницами на две, примерно, одинаковые части ( впредь они именуются биоптатами), каждый биоптат взвешивают на аналитических весах с точностью до 10^-5г. Биоптаты вносят в отдельные пробирки с d=1 см и L=5-6 см, добавляют к ним по 0,2-0,3 мл БС, измельчают их глазными ножницами на кусочки с d=0,15-0,25 мм добавляют к ним по 0,5-1 мл 0,2% водно-спиртового р-ра тритона Х-100 для разрыхления мембран и проведения внутрь клеток (СОД см. ниже). Продолжительность инкубации измельченных биоптатов с тритоном Х-100 в случае исследования слизистой желудка 30 сек. а при исследовании тканей других органов (печени, мозга, сердца, скелетных мышц)- 3-5 мин. Центрифугируют при 1000 об/мин. 5-7 мин. удаляют супернатант, отмывают ткане-клеточный осадок в каждой из двух пробирок трехкратно от остатков тритона, поочередным добавлением 2-3 мл БС и с последующим центрифугированием при 1000 об/мин, (R 17 см) 5-7 мин. Добавляют к каждому ткане-клеточному осадку 0,3 мл БС, после чего к одному из них (условно опытному, соответствующая пробирка тоже опытная) добавляют 250 мкг СОД, растворенного в 0,2 мл БС, а к другому (контрольному, соответствующая пробирка тоже контрольная) добавляют взамен СОД альбумин в равном кол-ве и в равном объеме БС. Инкубируют опытную и контрольную смеси при 36,9-37,0^oC 20 мин. в каждую пробирку вводят 0,2 мл опсонизированного (плазмой IV группы крови не содержащей агглютининов против А и В антигенов) зимозана. Исходная концентрация зимозана при приготовлении взвеси из него: 500 мг в 50 мл БС; добавляют 0,3 мл 0,2% раствора НСТ в БС.

Приготовленные системы инкубируют в термостате при 36,9-37,0^oС 40-60 мин, после чего останавливают реакцию добавлением 0,5 мл 5М соляной кислоты. Смеси центрифугируют при 3000 об/мин. 10 мин. супернатанты удаляют; полученные осадки экстрагируют 3-мя мл смеси диметилсульфоксида (ДМСО) и хлороформа в соотношении 2:1 при 55-59^oС 15 мин, центрифугируют при 3000 об/мин 10 мин, сливают супернатант из опытных и контрольных пробирок и экстракцию повторяют. После этого спектрофотометрически при длине волны 560 нм измеряют, концентрацию продукта реакции взаимодействия CAP(O^-₂) и НСТ-формазанов в каждом экстракте. Измерения проводились против смеси ДМСО + хлороформ (2:1). Результаты измерений 2-х экстрактов суммируются раздельно в опыте с СОД и в контроле с инкубацией с альбумином. Полученные данные оптической плотности пересчитывают на 1мг биоптата. Разность (дельта) между контрольной и опытной пробой показывает концентрацию CAP(O^-₂) по оптической плотности продуктов реакции взаимодействия CAP с НСТформазанов в единицах оптической плотности (ЕОП).

П р и м е р. У исследуемого пациента во время гастроскопии резицируют кусочек слизистой желудка диаметром 1,6-2,5 мм. отмывают его от крови и слизи последовательным погружением в 4-5 стаканчиков с буферной смесью (БС: 2,5мл фосфатно-щелочного буфера + 7,5мл физиологического 0,9% раствора NaCI) pН=7,35, после чего биоптат высушивают фильтровальной бумагой; разрезают его малыми глазными ножницами на две, примерно, равные части (которые впредь будут именоваться биоптатами), взвешивают их на аналитических весах с точностью до 10^-5г. Оба биоптата переносятся в отдельные пробирки с d=1cм и l= 6-7cм, добавляют по 0,3 мл БС, измельчают глазными ножницами на мелкие кусочки с d= 0,15-0,2мм, центрифугируют при 1000 об/мин 5 мин, супернатант удаляют; к осадку в каждой пробирке добавляют 0,5мл 0,2% водно-спиртового раствора тритона Х-100, инкубируют 30 сек, центрифугируют при 1000 об/мин 5 мин, удаляют супернатант (тритон), осадок трижды отмывают от остатков тритона поочередным добавлением 2-3мл БС и последующим центрифугированием при 1000 об/мин 5 мин; снова добавляют 0,2-0,3 мл БС к каждому биоптату, после чего к одному биоптату (опытному) вводят 250 мкг СОД растворенного в 0,2 мл БС, а ко второму биоптату (контрольному, вводят равное количество альбумина в ровном объеме БС; инкубируют опытную и контрольную пробу при 36,9-37,0^oС 20 мин (это время необходимое для проникновения СОД внутрь клеток установлено эмпирически). К каждому биоптату в пробирке добавляют 0,2мл опсонизированного зимозана (с помощью плазмы IV группы крови технику опсонизацию см. в книге "Исследование фагоцитоза в клинической практике" под редакцией С.Д. Дуглас и П.Г. Куи, перевод с английского М. 1983, с.78-90), + 0,3 мл 0,2 раствора НСТ в буферной смеси. Полученные пробы опытную и контрольную инкубируют в термостате при 36,9 37,0^oС 50 мин. После этого для остановки реакции в каждую пробирку добавляют 0,5 мл 5М раствора соляной кислоты; центрифугируют при 1000 об/мин 5 мин, супернатант удаляют. Сразу же дважды экстрагируют раздельно гранулы образовавшегося в опытной и контрольной пробе осадка формазанов смесью диметилсульфаксида (ДМОО) с хлороформом в соотношении 2:1 при 55,0^oС; каждый раз по 15мин. Затем проводят спектрофотометрию каждого экстракта при длине волны 560 нм. Спектрофотометрию экстрактов проводили против смеси ДМСО + хлороформ (2:1). Данные спектрофотометрических измерений в опытной и контрольной пробе, раздельно суммировались и пересчитывались на 1 мг биоптата. Разность между контрольной пробой ( с альбумином) и опытной СОД показывает концентрацию CAP по оптической плотности продуктов реакции взаимодействия CAP и НСТ формазанов в единицах оптической плотности (ЕОП)-на 1 мг биоптата, образовавшихся в фатоцитах ткани исследуемого органа.

Формула изобретения

Способ определения генерации супероксидного анион-радикала фагоцитами в биологическом материале, включающий инкубацию с опсонизированным зимозаном и нитросиним тетразолием, остановку реакции соляной кислотой, экстракцию органическим растворителем продукта реакции взаимодействия супероксидного анион-радикала и нитросинего тетразолия формазанов, спектрофотометрическое определение его концентрации по оптической плотности, отличающийся тем, что получают тканевый биоптат, отмывают его буферной смесью рН 7,35, инкубируют последовательно с тритоном, супероксид-дисмутазой и на завершающем этапе рассчитывают концентрацию продукта реакции формазанов по оптической плотности на 1 мг биоптата, по которой оценивают интенсивность образования супероксидного анион-радикала.