Способ подготовки планшета для повторного использования в иммунологическом анализе

 

Использование: биология, иммунология, медицина, иммуноферментный анализ. Сущность изобретения: планшеты после процедуры ИФА обрабатывают или 0,01-3,0% раствором карбоцепного эластомера в легколетучем растворителе, или легколетучим растворителем и затем - 0,01-3,0% раствором карбоцепного эластомера в легколетучем растворителе с последующим удалением растворителя. Цель - регенерация планшет. 6 табл.

Изобретение относится к гетерогенному иммуноферментному анализу на полимерном носителе, в частности к гетерогенному иммуноферментному анализу, осуществляемому на полистирольных планшетах.

Известно (см.ред. Н.Нго "Иммуноферментный анализ" сб. статей, М. 1988), что твердофазные носители, в частности полистирольные планшеты, используют в иммуноферментном анализе однократно, и после осуществления анализа их не регенерируют, прежде всего из-за того, что антигены и антитела сорбируются на поверхности полистирола исключительно прочно.

Наряду с этим известно (см. Я.Туркова "Аффинная хроматография", М. 1980, с. 258-281), что с поверхности любого иммуносорбента (а по сути своей полистирольный планшет является твердофазным иммуносорбентом) возможна десорбция антигенов (антител) и, следовательно, регенерация иммуносорбента. Однако, десорбция возможна лишь при низких значениях pН, либо в присутствии хаотропных ионов: трихлорацетата, трифторацетата. Попытки реализации установки в применении к полистирольным прозрачным планшетам приводят наряду с десорбцией и необратимому помутнению поверхности лунок и, следовательно, к невозможности последующего осуществления ИФА.

Целью изобретения является разработка способа регенерация иммунологических твердофазных носителей.

Цель достигается тем, что после осуществления гетерогенного иммуноферментного анализа твердофазный носитель обрабатывают или 0,01 3% раствором карбоцепного эластомера в легколетучем растворителе, или легколетучим растворителем и затем 0,01 3% раствором карбоцепного эластомера в легколетучем растворителе с последующим удалением растворителя.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного применения.

Пример 1. Планшеты, бывшие в иммуноферментном анализе, после промывки водой и просушивания, заливают растворами синтетического изопренового каучука типа СКИ-3 (см. Энциклопедия полимеров т.1, с.819) в петролейном эфире. После заливки всех лунок планшетов растворами эластомера осуществляют вытряхивание и высушивание на воздухе. В качестве агента сенсибилизации используют человеческий γ-глобулин в концентрации 10 мкг/мл, при времени инкубации 30 минут и температуре 37^oC. В качестве эталона сравнения используют планшет, также бывший в иммуноферментном анализе и обработанный смесью соляной и трихлоруксусной кислот при pН 1,0 и времени обработки 10 минут. Результаты эксперимента приведены в таблице 1.

Таким образом, при осуществлении способа по прототипу имеет место помутнение лунок планшета и сама постановка ИФА становится невозможной, в случае же предлагаемого технического решения имеет место улучшение величины сорбционной активности. Осуществление дозирования эластомера для растворения в петролейном эфире 0,005% становится технически весьма затруднительным, при дозировании его более 3,0% не отмечается ухудшения показателя сорбционной активности, однако вязкость раствора эластомера становится чрезвычайно большой, в силу этого дозирование его в лунки планшет технически затруднено, растекание его по дну лунки становится неравномерным, что в свою очередь может привести к невоспроизводимости единичного ИФА.

Пример 2. Планшеты, использовавшиеся в примере 1, обрабатывают петролейным эфиром, а затем обрабатывают растворами карбоцепного эластомера СКИ-3 в концентрациях в петролейном эфире и по методике, изложенной в примере 1. В качестве агента сенсибилизации используют рекомбинантные белки ВИЧ р24 и др41 производства МНИИ вирусных препаратов, в качестве положительной - кроличью сыворотку от животных, иммунизированных названными рекомбинантными белками. В качестве эталонов сравнения используют планшет, бывший в ИФА и обработанный смесью соляной и трифторуксусной кислот (pН 1,8) и времени обработки 5 минут, а также планшет, не бывший в ИФА, от той же серии, что и планшеты, используемые в экспериментах.

Результаты эксперимента представлены в таблице 2.

Таким образом, регенерированные планшеты обеспечивают детекцию слабоположительной донорской сыворотки к антителам против ВИЧ, чего не обеспечивает использование планшета, не бывшего в употреблении и не модифицированного по предлагаемому способу: при обеспечении во всех случаях примера 2 контроля конъюгата не более 0,15 показатель оптической плотности в случае слабоположительной сыворотки должен превышать показатель оптической плотности в случае отрицательной контрольной сыворотки не менее, чем в три раза (см. "Инструкция по применению тест-системы иммуноферментной для определения антител к вирусу иммунодефицита человека", Новосибирск, НПО "Вектор", 1989 г. ), что и имеет место в данном случае. Выход за пределы аналогичен такому, как в примере 1.

Пример 3. Планшеты, использовавшиеся в примере 1 и затем в примере 2, обеззараживают в спиртовом растворе (70^oC, 2 часа), в растворе хлорамина (1 час), высушивают, после чего обрабатывают смесью петролейного эфира 85% и м-ксилола 15% а затем обрабатывают растворами синтетического бутадиенового каучука типа СКД (см. Энциклопедия полимеров т.1, с.323). Покрытие осуществляют аналогично примерам 1 и 2. В качестве антигена используют в разведении 1: 100 коклюшный липополисахарид, сыворотки больных детей. В качестве эталонов сравнения используют планшет, бывший в ИФА, аналогично примера 2, а также планшет, не бывший в ИФА, от той же серии, что и планшеты, используемые в эксперименте.

Результаты эксперимента представлены в таблице 3.

Выход за пределы здесь аналогичен таким, как в примерах 1 и 2.

Пример 4. Для контроля возможных сроков гарантийного хранения регенерированных по предлагаемому способу иммунологических планшет, планшеты, использовавшиеся в примерах 1 3, обеззараживают в растворе хлорамина, высушивают, после чего обрабатывают петролейным эфиром, а затем раствором каучука СКИ-3 в концентрации 1% аналогично примера 1. В качестве эталона сравнения используют планшет, бывший в употреблении и регенеpированный по способу, аналогичному примеру 1. Далее сорбируют на планшеты тейхоевые кислоты из St.aureus, сорбированные планшеты подвергают процедуре хранения в течение 4-х месяцев при +4^oС. Каждый месяц осуществляют постановку реакции ИФА. Результаты эксперимента представлены в таблице 4.

Из приведенных сведений явствует, что регенерированные планшеты обеспечивают стабильность сохранения на них сорбированного антигена (тейхоевых кислот из коклюшного микроба) в течение 4-х месяцев.

В табл.5 приведены данные испытаний регенерированных и серийных планшет в тест-системе определения антител к вирусу СПИД.

Процедура отмывки стандартизирована для 96-канальных пипеток. ТТТ1

Формула изобретения

Способ подготовки планшетов для повторного использования в иммунологическом анализе, включающий обработку планшета 0,01 3,0%-ным раствором синтетического каучука типа СКД или синтетического изопренового каучука типа СКИ-3 в петролейном эфире с последующим удалением растворителя.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3