Способ получения мутантной протеазы

 

Изобретение относится к генетической инженерии в частности к получению мутантных протеаз в клетках Bacillus. Сущность изобретения состоит в том, что получают ген, кодирующий протеазу, имеющую аминокислотную последовательность, характеризующуюся по крайней мере 70 % гомологией с аминокислотной последовательностью сериновой протеазы РВ82 и содержащую замены аминокислот в положениях 32 и/или 33, и/или 48, и/или 49, и/или 50, и/или 51, и/или 52 и/или 53 и/или 54, и/или 58, и/или 59-62, и/или 94-107, и/или 116-118, и/или 123-134, и/или 150, и/или 152-156, и/или 158-161, и/или 164, и/или 166, и/или 169, и/или 175-186, и/или 197, и/или 198, и/или 203-216, и/или 235, и/или 243, и/или 259 на более устойчивую к окислению нейтральную или анионную аминокислоту, клонирование гена в вектор экспрессии, трансформацию полученными рекомбинантными ДНК штаммов-реципиентов Bacillus отбор клонов, выделение и очистку целевого продукта. 10 з.п. ф-лы, 8 ил., 15 табл.

Изобретение относится к новым протеолитическим ферментам с улучшенными свойствами, предназначенным для применения в моющих средствах (детергентах). Эти свойства включают улучшенную способность композиции к удалению пятен при стирке в прачечных, улучшенную стабильность при хранении с детергентами для стирки в прачечных, а также улучшенную устойчивость в мыльной воде, содержащей детергент.

Известно использование ферментативных добавок, в частности протеолитических ферментов в моющих композициях, позволяющих удалять загрязнения на основе белков (заявки на Европейские патенты 0220921 и 0232269, патенты США N 4480037 и Re 30602).

Моющие композиции могут представлять собой порошок, жидкость или пасту. Они включают одно или несколько анионных, неионных, цвиттерионных, катионных или амфотерных соединений, в качестве активного моющего материала. Кроме того, эти композиции могут включать пассиваторы, стабилизаторы, душистые вещества, в некоторых случаях окислители, обычно называемые отбеливателями. Моющие композиции применяют для очистки твердых поверхностей, мойки ванн, мойки посуды (автоматически или вручную) и стирки в прачечных.

Стиральные моющие средства, как правило, подразделяют на два основных типа: жидкие и порошкообразные. Жидкие стиральные детергенты содержат в большой концентрации поверхностно-активные вещества, имеют нейтральное или умеренное щелочное значение рН и обычно не содержат отбеливателей. Порошкообразные детергенты по большей части обладают высокой щелочностью (рН 9-11), в их состав входят пассиваторы, такие как триполифосфат натрия и в зависимости от принятой практики стирки, в тех странах, где они продаются, могут содержать или не содержать отбеливатели.

Используемые в настоящее время в моющих композициях ферменты добавляют в виде жидких суспензий, золя и гранулята. Например, в порошкообразных детергентах протеолитические ферменты обычно присутствуют в виде капсул, таких как гранулы (например, Максатазы^R и Максакаля^R) или гранулятов (например, Савиназы^R и Алькалазы^R). Максатаза и Максакаль производятся фирмой Интернейшнл Био-Синтетикс В.V: (Риджсвиджк, Нидерланды). Савинааз и Алькалаза фирмой NOVO Индастри A/S (Багваэрд, Дания). В жидких стиральных детергентах ферменты по большей части присутствуют в виде раствора.

Протеолитические ферменты, как правило, с трудом совмещаются с моющими композициями. Ферменты должны быть устойчивы и активны в ходе их применения, например, при удалении белковых пятен в ходе стирки при темтературе от 10 до выше 60^oC. Кроме того, они должны сохранять стабильность в течение продолжительных периодов времени при их хранении в моющем продукте. Соответственно, ферменты должны быть стабильны и функциональны в присутствии пассиваторов, поверхностно-активных веществ, высокой щелочности, а в некоторых случаях и в присутствии отбеливателей, а также повышенной температуры. Поскольку не существует универсальных стиральных детергентов, как не существует универсальных условий стирки (рН, температура, концентрация раствора, жесткость воды) по всему миру, требования к ферментам могут меняться в зависимости от типа детергента, в котором их используют, а также от условий стирки.

Условия, влияющие на стабильность ферментов в порошковых детергентах, как правило, не являются оптимальными. Например, при хранении ферментных препаратов в порошковых детергентах, несмотря на кажущееся физическое разделение фермента и компонентов детергента за счет капсулирования фермента, окислители детергента действуют на протеазу со снижением ее активности. Другая причина неустойчивости фермента в порошковом детергенте заключается в его автоусвоении при хранении, особенно при высокой относительной влажности.

Кроме того, часто присутствующие в порошковых детергентах окислители обладают существенным недостатком, влияющим на эффективность удаления пятен при стирке в прачечных, заключающемся в фиксации белковых пятен на текстильном материале. Кроме того, окислители и другие компоненты детергента, такие как пассиваторы понижают эффективность протеазы по удалению пятен также и в ходе отмывания.

Для жидких детергентов приходится сталкиваться с такой острой проблемой как быстрая дезактивация ферментов, особенно при повышенных температурах. Поскольку ферменты присутствуют в таких детергентов в виде раствора, дезактивация происходит уже при обычных условиях хранения детергента, в результате чего активность фермента значительно снижается еще до применения детергента. Анионные поверхностно-активные вещества, такие как алкилсульфаты в сочетании с водой и другими компонентами особенно склонны необратимо денатурировать фермент, делая его неактивным или неспособным проводить протеолитическое расщепление.

Частичное решение проблемы, связанной с устойчивостью ферментов в жидких моющих составах, заключается в модификации состава, например, введением стабилизаторов, снижающих дезактивацию фермента (заявки на Европейские патенты N 0126505 и 0199405, патент США N 4318818, заявка на патент Великобритании N 2178055А).

Известен другой подход к достижению стабильности ферментов в жидких детергентах (заявка на Европейский патент 0238216), где физическое разделение молекул фермента и жидкой агрессивной матрицы детергента достигается особой технологией приготовления состава. Для порошковых детергентов предложены альтернативные виды капсул (заявка на Европейский патент 0170360).

Вышеизложенным суммированы условия, которые должны существовать для оптимального функционирования протеолитического фермента детергента, а также ограничения для применяемых в настоящее время ферментов, используемых в моющих композициях. Несмотря на все попытки обеспечить в моющих композициях устойчивость фермента, тем не менее наблюдается значительная потеря его активности в обычных условиях хранения и использования.

Идентификация и выделение новых ферментов, предназначенных для применения в определенных областях, например в детергентах, может быть осуществлена несколькими способами. Один из способов заключается в подборе организмов или микроорганизмов, проявляющих желаемую ферментивную активность, выделения и очистке фермента из (микро)организма или жидкой части культуры (микро)организма, определении биохимических свойств фермента и проверки того, будут ли эти биохимические свойства отвечать требованиям использования. При невозможности получения фермента из продуцирующего его организма может быть применена технология генной инженерии с выделением гена, кодирующего фермент, экспрессией гена в другом организме, выделением и очисткой экспрессированного фермента и его испытанием на возможность применения в намеченной области.

Другой способ получения новых ферментов, предназначенных для применения в намеченной области, заключается в модификации существующих ферментов, что может быть достигнуто химическими методами (3). Как правило, такие методы совсем неспецифичны, что проявляется в модификации всех доступных остатков с обычными боковыми цепями или в том, что модификация зависит от присутствия приемлемых для модификации аминокислот, и часто модификацией невозможно изменить труднодоступные аминокислоты без раскрытия молекулы фермента. Таким образом, способ модификации фермента путем мутагенеза кодирующего гена является более прогрессивным.

Мутагенез может быть достигнут либо случайным мутагенезом, либо сайт-направленным мутагенезом. Случайный мутагенез при обработке всего микроорганизма химическим мутагеном или действии облучения, разумеется, может привести к модификации ферментов. В этом случае должен существовать очень эффективный метод отбора с целью выявления чрезвычайно редких мутантов с целевыми свойствами. Высокая вероятность выделения мутантных ферментов при случайном мутагенезе может быть достигнута после клонирования кодирующего гена, его мутагенезом in vitro или in vivo и экспрессии кодированного фермента повторным клонированием мутантного гена в приемлемой клетке-хозяине. И в этом случае должны быть доступны приемлемые способы биологического отбора с целью выбора целевых мутантных ферментов (Международная заявка на патент WO 87/05050). Эти способы биологического отбора не обязательно приводят к выбору ферментов, пригодных для использования в детергентах.

Более специфичным способом получения модифицированных ферментов является сайт-направленный мутагенез, позволяющий проводить специфичное замещение одной или нескольких аминокислот любой другой целевой аминокислотой. Известна технология с целью получения генов мутантной протеазы (заявка на Европейский патент 0130756), которая может быть экспрессирована с получением модифицированных протеолитических ферментов.

Недавно потенциал передаваемого олигонулеотидом сайтнаправленного мутагенеза продемонстрирован использованием мутагенных синтетических олигонуклеотидов, содержащих разные основания в нескольких положениях целевой последовательности, что обеспечивало получение различных мутаций, которые вводились в специфичную часть ДНК-последовательности с помощью одного синтетического олигонуклеотида (4-9).

Обнаружено, что метионин в положении 221 субтизисина Карлсберга окисляется обработкой Н₂O₂ в сульфоксид метионина и ответственен за значительное снижение активности (10).

С помощью способов случайного и сайт направленного мутагенеза были получены модифицированные ферменты из сериловые протеазы, Bacillus amyloliquefaciens, также называемой "ВРN' субтизисином". Известен мутант субтизисина ВРN' с повышенной термической стабильностью (WO 87/05050). Известно, что сайт-направленный мутагенез метионина в положении 222 ВРN субтилизина на все 19 возможных аминокислот с использованием так называемого метода "кассетного мутагенеза" может привести к ферментам, устойчивым к окислению обработкой Н₂O₂ (заявка на Европейский патент 0130756). Однако в последнем случае большинство мутантов обладает низкой протеолитической активностью. Найдено, что самыми лучшими мутантами являются М222А и М222, удельная активность которых составляет соответственно 53 и 35% активности природного субтилизина ВРN' (11).

Предшествующей работой по созданию модифицированных протеаз показано, что можно получить мутанты ВРN' субтилизина с измененной стабильностью и измененными кинетическими свойствами (12-18). Однако ни одна из приведенных ссылок не обеспечила промышленное производство протеолитических ферментов с улучшенной моющей способностью и стабильностью в стиральных детергентах. Ни для одной из модифицированных протез не показана промышленная ценность и превосходство над применяемыми в настоящее время ферментами детергентами в соответствующих условиях использования.

Одним из объектов изобретения являются новые мутантные протеолитические ферменты, полученные экспрессией генов, кодирующих эти ферменты с аминокислотными последовательностями, отличающимися по меньшей мере одной аминокислотой от соответствующих ферментов дикого типа. Эти мутантные ферменты обладают улучшенными свойствами для их применения в детергентах, в особенности стиральных детергентах. Рекомендуемое воплощение изобретения заключается в мутантах РВ92 сериловой протеазы.

Другим объектом изобретения являются новые ферментные детергенты, включающие протеолитический ферментивный продукт. содержащий по меньшей мере один из таких новых мутантных протеолитических ферментов.

Еще одним объектом изобретения является способ эффективного отбора мутантных протеолитических ферментов с улучшенными свойствами для их применения в стиральных детергентах из целой дюжины ферментов. Такие ферменты получают экспрессией генов кодирующих мутантные протеазы.

Эти и другие аспекты изобретения подробно поясняются нижеследующим описанием.

На фиг. 1 представлена конструкция вектора, включающего РВ92 ген протеазы; на фиг. 2 применяемая методика мутагенеза; на фиг. 3 векторы экспрессии, включающий мутантный ген РВ92 протеазы; на фиг. 4 6 моющая способность (относительно удельной протеолитической активности) различных мутантов РВ92 протеазы в различных условиях мойки; на фиг. 7 и 8 структура аминокислотной последовательности сериновой протеазы РВ92.

Под выражением "обладающие улучшенными свойствами", используемом в настоящем описании в связи с "мутантными протеолитическими ферментами" подразумеваются протеолитические ферменты с улучшенной моющей способностью для улучшенной стабильностью при сохранении моющей способности в сравнении с соответствующей протеазой дикого типа.

Термин "моющая способность" для мутантных протеолитических ферментов определяется в настоящем описании как вклад мутантного протеолитического фермента в процесс очистки стиркой дополнительно к действию моющей композиции без фермента в соответствующих условиях стирки.

Выражение "соответствующие условия стирки" применяется для указания условий, в частности температуры стирки, времени, механизмов для стирки, концентрации раствора, типа детергента и жесткости воды, используемых на деле в домашнем хозяйстве при использовании промышленных детергентов.

Термин "улучшенная моющая способность" используется для обозначения того, что достигается лучший конечный результат для удаления пятен в "соответствиях условиях стирки" или что требуется меньше мутантного протеолитического фермента в пересчете на его массу для достижения того же конечного результата, что и в случае соответствующего фермента дикого типа.

Выражение "сохраненная моющая способность" используется для указания того, что моющая способность мутантного протеолитического фермента в пересчете на его массу составляет по меньшей мере 80 относительно соответствующей протеазы дикого типа в "соответствующих условиях стирки".

Термин "улучшенная стабильность" использован для указания на лучшую стабильность мутантных протеолитических ферментов в стиральных детергентах при их хранении и/или их стабильность в пене, и это понятие включает стабильность к окислителям, пассиваторам, автолизису, поверхностно-активным веществам и высокой щелочности по сравнению с соответствующим ферментом дикого типа.

Биохимические свойства, определяемые в хорошо апробированных лабораторных условиях, являются не слишком надежными показателями для предсказания поведения конкретной протеазы детергента в целевых и установленных условиях использования. Эти показатели включают кинетические данные, определенные на четко определенных субстратах, таких как белок, например казеин, диметилказеин и гемоглобин или замещенные олигонуклеотидные субстраты, например, SAAPEpNA (сукцинил-L-аланил-L-аланил-L-пролил-L-фенилаланил-пара-нитро-анилид). Видимо другие признаки протеаз определяют их эффективность в качестве стиральных детергентов.

Изобретение основано на открытие того, что хотя и существуют методы модификации аминокислот в белках, которые могут вызвать существенные изменения в их биохимических показателях, тем не менее предсказание влияния специфичной мутации в реальных условиях применения все еще остается очень слабым, если вообще возможным.

В соответствии с изобретением после интенсивных исследований и опытов найден способ, в котором сочетается получение мутантных протеаз с эффективной методикой отбора этих протеаз по их действию. Сравнительно большое число ферментов может быть отобрано по их действию этим путем.

Тест-система изобретения основана на удалении чувствительных к протеазе пятен с образчиков ткани в природе для определения прочности тканей к стирке или терготометре, имитирующем соответствующие условия стирки. Приемлемыми испытуемыми образчиками тканей могут служить продажная ЕМРА (фирма Eidqenossische Material Prufung and Versuch Anstalt, Сан Галлен, Швейцария), искусственно запачканные белковыми пятнами. Другие пятна, наносимые на образчики тканей для испытания протеаз, включают пятна крови, травы, шоколада и т.п.

Кроме того, в такой тест-системе другие соответствующие факторы, такие как состав детергента, концентрация раствора, жесткость воды, стиральные механизмы, время, рН и температура должны регулироваться таким образом, чтобы воссоздавались условия, типичные для домашнего хозяйства в определенной рыночной сфере.

Моющую способность протеаз обычно определяют по их способности удалять определенные характерные пятна в соответствующих условиях испытания. Эта способность может быть определена измерением отражательной способности испытуемой ткани после ее стирки в присутствии или отсутствии фермента в приборе для определения прочности тканей к стирке или терготометре. Лабораторная тест-система изобретения представительно отражает возможности применения в домашнем хозяйстве при ее использования протеолитических ферментов, модифицированных путем мутагенеза ДНК.

Изобретение позволяет проводить тестирование большого числа различных ферментов и отбор тех ферментов, которые особенно приемлемы для каждого типа применяемого детергента. Таким путем могут быть отобраны "изготовленные по особому заказу" ферменты, предназначенные для использования в особых условиях.

Некоторые бактериальные сериновые протеазы называют субтилизинами. Субтилизины включают сериновые протеазы Bacillus subtilis, Bacillus amyloliqnefaciens, ("ВРN' субтилизин") и Bacillus licheniformis ("субтилизин Карлсберга") (19).

Штаммы Bacillus, такие как алкалофильные штаммы Bacillus продуцируют другие протеазы. К примерам последней категории бактерий относятся сириновые протеазы Максакаля, далее обозначаемые также как РВ92 протеазы (из нового вида РВ92 Bacillus) и Савиназы, о которых речь шла выше.

Аминокислотная последовательность ВР92 протеазы приведена на фиг. 4. Зрелая протеаза состоит из 269 аминокислот, ее молекулярная масса около 27000 Д и ее изоэлектрическая точка соответствует высокому значению щелочности. Активность РВ92 протеазы к белковому субстрату выражают в единицах щелочности Дельфта (ЕШД). Активность в ЕШД определяют по методике, приведенной в описании патента Великобритании N 1353317, за исключением того, что вместо рН 8,5 применяют рН 10. Активность очищенной РВ92 протеазы 21000 ЕШД на мг. Показатель производительности (К_cat), измеренный на казеине, 90 с^-1.

Удельная активность очищенных препаратов субтилизина Карлсберга (10) составляет 10000 ЕШД/мг, удельная активность ВРN' субтилизина (21) составляет до 7000 ЕШД/мг. Помимо вышеприведенных показателей, таких как удельная активность и показатель производительности (К_cat) РВ92 протеаза отличается сама по себе от протеаз, подобных субтилизину Карлсберга, ВРN' субстилизину и другим протеазам, вводимых в состав детергентов (например, Макстазы и Алькалазы), тем, что обладает высоким положительным зарядом, что может быть визуально определено гель-электрофорезом природного белка (см. Экспериментальный раздел 4).

Поскольку РВ92 протеаза активна к удалению пятен при щелочных значениях рН, ее обычно применяют в качестве добавки к детергенту вместе с другими компонентами детергента, такими как поверхностно-активные вещества, структурообразователи и окислители. Последние компоненты в основном применяют в виде порошков. РВ92 протеаза обладает высокой эффективностью к удалению пятен по сравнению с другими протеазами, типа вышеупомянутых субтилизинов. Это означает, что РВ92 протеаза требуется в меньших количествах для получения того же моющего эффекта.

Чувствительность к окислению является важным недостатком РВ92 протеазы, как и всех других известных сериновых протеаз, применяемых в составе детергента (22). Окисление РВ92 протеазы либо Н₂O₂, либо надкислотами, образуемыми системой активатора, включающей тетрагидрат пербората и ТАЕD, приводит к ферменту с удельной активностью соответственно 50 и 10 (в ЕШД/мг) от неокисленной РВ92 протеазы (см. Экспериментальный раздел 7 и пример 1).

Способ изобретения пригоден для получения и отбора мутантных протеолитических ферментов, происходящих из продуцируемых в естественных условиях бактериями сериновых протеаз. К таким мутантам относятся, например, мутанты, кодируемые геном, полученным из гена дикого типа алкалофильного штамма Bacillus, предпочтительно РВ92. Кроме того, приемлемы мутанты, полученные из алкалофильной протеазы серина Савиназы (Bacillus). Помимо этого способ может быть с успехом использован для отбора модифицированных протеаз, полученных из протеаз, отличных от сериновых протеаз из алкалофильных штаммов Bacillus РВ92. Известны гены, кодирующие сериновые протеазы -B.subtilis, B. licheniformis u B.amylolique-faciens, и они могут быть использованы в качестве объекте мутагенеза. Очевидно, что для проведения эффективной мутации в гене протеазы может быть осуществлен как сайт-направленный мутагенез с участием олигонуклеотида или направленный на целую область случайный мутагенез, так и любой другой способ мутагенеза.

Способ отбора мутантных протеолитических ферментов изобретения (который включает получение и отсеивание) состоит из следующих стадий: мутагенез клонированного гена, кодирующего целевой протеолитический фермент, или его фрагмента: выделение мутантного полученного гена протеазы или генов; введение мутантного гена протеазы или генов, предпочтительно на приемлемом векторе в соответствующий штамм-хозяин с целью экспрессии и продуцирования; выделение полученной мутантной протеазы и идентификация полученной мутантной протеазы с улучшенными для применения в детергентах свойствами.

Приемлемые штаммы-хозяева для продуцирования мутантных протеаз включают поддающиеся трансформации микроорганизмы, в которых может быть достигнута экспрессия протеаз. В особенности пригодны штаммы-хозяева того же вида или рода, из которого получена протеаза, в том числе штаммы Bacillus предпочтительно алкалофильные штаммы Bacillus, но наиболее предпочтительно новый вид Bacillus РВ92 или его мутант, обладающий по существу теми же свойствами. К рекомендуемым штаммам также относятся B.subtilis, B.licheniformis и B.amyloliqneafaciens. Другие приемлемые и рекомендуемые штаммы-хозяева включают те штаммы, которые по существу неспособны продуцировать внеклеточные протеолитические ферменты до трансформации мутантным геном. Особенный интерес представляют штаммы-хозяева Bacillus с дефицитом протеазы, такие как новый вид Bacillus РВ92 c дефицитом протеазы. Экспрессия протеаз достигается использованием сигналов экспрессии, действующих в выбранном организме-хозяине. Сигналы экспрессии включают последовательности ДНК, регулирующие транскрипцию и трансляцию генов протеаз. Подходящие векторы способны к репликации при достаточно большом числе копий в выбранном штамме-хозяине или допускают устойчивое внедрение гена протеазы в штамм-хозяин путем хромосомной интеграции.

Мутантные протеолитические ферменты изобретения могут быть получены культивированием в соответствующих условиях трансформированного штамма-хозяина, содержащего целевой мутантный протеолитический ген или гены с последующим выделением полученных ферментов.

Рекомендуется, чтобы экспрессированные протеазы секретировались в культуральную среду, что облегчает их выделение, или в случае грам-отрицательных бактериальных штаммов-хозяев в периплазмическое пространство. Для секретирования применяют приемлемую аминоконцевую сигнальную последовательность, предпочтительно сигнальную последовательность, кодируемую исходным геном, если такой функционален в выбранном штамме-хозяине.

В соответствии с одним из аспектов изобретения могут быть созданы приемлемые методы испытания моющей способности, которые будут воспроизводить любые соответствующие условиях стирки в домашних условиях, отвечающие рыночному спросу. Например, создан способ испытания для предназначенного к применению в жестких условиях, предъявляемых Европейским рынком, порошкового детергента, в котором использованы порошковые компоненты и который может включать, а может и не включать отбеливатели, с концентраций в растворе 1 10 г детергента/л при 10 20^oGH (немецкие единицы жесткости воды) и температуре 25 80^oC. Более конкретно, использован детергент на основе порошковых компонентов, содержащий TAЕ D и перборат, при концентрации в растворе 4, 7 и 10 г детергента/л при 15^o GH и 40^oC.

Кроме того, даются методы испытаний, отражающие стирку жидкими детергентами. Такие детергенты обычно применяют при концентрации в растворе 1,5 5 г детергента/л при 5 15 GH и 15 40^oC. Более конкретно, использованы жидкие моющие композиции без отбеливателя с концентрацией в растворе 1,5 г детергента/л, 5^oGH и 25 40^oC, что отвечает условиям, предъявляемым к жидким детергентам в США, и с концентрацией в растворе 5 г детергента/л, 15^o GH при 40^oC, что отвечает требованиям, предъявляемым к жидким детергентам в Европе.

Могут быть созданы и другие испытания моющей способности, отвечающие и другим условиям, предъявляемым рынком. В испытаниях на характерную моющую способность применяют образчики ткани, более конкретно, образчики для испытаний ЕМРА 116 и 117, загрязненные чувствительными к протеазе пятнами, в частности, ткани, загрязненные пятнами крови, травы, шоколада и другими белковыми продуктами.

Свойства встречающихся в природе или подвергшихся мутации в естественных условиях моющих протеаз могут быть усилены введением ряда мутаций в ДНК, кодирующую фермент. По большей части мутации имеют заместительный характер, как консервативного, так и неконсервативного типа, однако, делеции и внедрения также могут найти применение.

Для консервативных замещений может быть использовано следующее: Алифатические нейтральные неполярные G, A, P L, I, V полярные C, M, S, T N, Q заряженные анионные D, E катионные K, R Ароматические F, H, W, Y где любая аминокислота может быть замещена любой другой аминокислотой той же категории, в частности, находящейся на той же строчке. Кроме того, полярные аминокислоты N, Q могут замещать или быть замещены заряженными аминокислотами. Для целей изобретения особый интерес представляют замещения, приводящие к усилению анионного характера протеазы, особенно в сайтах, не связанных непосредственно с активным сайтом.

Особый интерес для мутации представляют те аминокислоты, которые находятся в пределах области, расположенной на расстоянии в 4 от молекулы ингибитора (Эглин С), если Эглин С связан с активным сайтом.

Нижеследующая нумерация основана на РВ92 протеазе, но те же соображения справедливы и для других сериновых протеаз, обладающих гомологичным строением, в частности, для протеаз с гомологичностью выше 70 но особенно с гомологичностью выше 90 Этими положениями являются положения 32, 33, 48-54, 58-62, 94-107, 116, 123-133, 150, 152-156, 158-161, 164, 169, 175-186, 197, 198, 203-216, и основная часть указанных положений доступна для непосредственного взаимодействия с белковым субстратом. Обычно положения 32, 62, 153 и 215 не подвергают замещению, поскольку мутация в перечисленных сайтах имеет тенденцию к нарушению моющей способности.

Представляющие особый интерес для замещения положения включают 60, 62, 94, 97-102, 105, 116, 123-128, 150, 152, 153, 160, 183, 203, 211, 212 и 213-216. В некоторых положениях будет наблюдаться тенденция к замещению неустойчивой аминокислоты, например, метионина более устойчивой к окислению аминокислотой, например, треонином при сохранении в этом сайте общей конформации и объема аминокислоты. В других ситуациях, как найдено, замена природной аминокислоты практически любой другой аминокислотой может привести к улучшенным результатам, особенно замена гидроксилированных аминокислот S, T полярной или неполярной аминокислотой или даже ароматической аминокислотой.

Представляющие особый интерес замещения включают:
G116 I, V, L;
S126 любая аминокислота;
Р127 любая аминокислота;
S128 любая аминокислота;
S160 анионная или нейтральная аминокислота, или R;
А166 заряженная, особенно анионная аминокислота;
М169 нейтральная алифатическая, предпочтительно неполярная аминокислота;
N122 анионная аминокислота;
М126 алифатическая полярная аминокислота, особенно S, T, N, Q.

В то время как многие мутации приводят к понижению удобной активности протеазы по отношению к обычным субстратам, их моющая способность сравнима или выше по сравнению с природным ферментом, а во многих случаях повышается стабильность при хранении.

Моющая способность некоторых мутантов РВ92 протеазы, выраженная в виде обратной величины относительного количества фермента, необходимого для достижения того же эффекта, что и в случае природных протеаз х 100 повышается до 120 в некоторых случаях даже выше 180
Согласно еще одному аспекту изобретения даются мутанты РВ92 протеазы, обладающие улучшенной стабильностью при хранении по сравнению с природной РВ92 протеазой в порошковой моющей композиции, содержащей отбеливатель, с сохранением их моющей способности. Примерами таких мутантов являются М216S и M216Q, имеющие по меньшей мере одну из указанных мутаций помимо мутаций в других сайтах.

В соответствии с еще одним аспектом изобретения неожиданно обнаружено, что в жидкой стиральной композиции (без окислителя) мутанты РВ92 протеазы М216S, M216Q, S160D и N212D сохраняют свою активность лучше РВ92 протеазы. Из перечисленных мутантов М216S и М216Q сохраняют моющую способность, а S160D и N212D ее улучшают. Улучшения стабильности при хранении в испытанном жидком детергенте особенно заметны в случае мутантов S160D и M216Q.

Можно также сочетать несколько мутаций, повышающих стабильность протеазы в моющих композициях. Несколько мутаций, положительно влияющие на моющую способность одной и той же протеазы, могут объединиться в одном гене мутантной протеазы, что позволяет получать возможно еще более улучшенные протеазы, например, (S126M, P127A, S128G, S160D) и (G116V, S126N, P126S, S128A, S160D). Новые мутанты протеазы могут быть получены сочетанием в них хорошей моющей способности, например, за счет N212D и S160D со стабильностью, например, за счет М216S и М216Q. К примеру, мутант (S160D, M216S) обладает улучшенной моющей способностью и лучшей стабильностью при хранении.

Ценные мутанты могут быть получены сочетанием любой мутации или ряда мутаций, описанных в данном описании. Кроме того, можно сочетать уже описанные мутации с мутациями по другим сайтам, которые могут привести, а могут и не привести к существенным изменениям свойств фермента.

Рекомендуемые воплощения изобретения включают следующие мутанты РВ92 протеазы: (M216S), (M216Q), (N212D), (S160D), (S160G, N212D); (S160D, M216Q); (S160D, M216S), (A166D, M1691); (G116V, S126V, P127E, S128K), (G116V, S126G, P127Q, S1281), (G116V, S1261, P127N, S128V), (G116V, S1261, P127Q, S128A), (G116V, S126V, P127M), (G116V, S126H, P127Y), (G116V, S126R, P127S, S128P); (G116V, S126F, P127Q), (G116V, S126F, P171, S128T), (S126M, P127A, S128G), (S126M, P17A, S128G, S160D) и (G116V, S126N, P127S, S128A, S160D).

С целью иллюстрации важности подхода, примененного в изобретении для получения новых протеаз, пригодных к использованию в моющих детергентах, т. е. при использовании в типичных условиях испытаний на стирку как критерия первичного отбора. Результаты испытаний моющей способности мутантов РВ92 протеазы сравнивались с биохимическими показателями, обычно определяемыми при биохимических и энзимологических исследованиях белка. Результаты сравнения позволяют сделать вывод о том, что какая-либо связь между показателями, определяющими родство к заданным субстратам и кинетику протеолитических реакций и моющей способностью отсутствует (см. табл. 1).

Таким образом, можно объединить также два или более мутанта с различными свойствами в одном ферментном продукте или в одном и том же процессе мойки. Такое сочетание может оказать, а может и не оказать синергическое действие.

Изобретение также включает применение одного или нескольких мутантных протеолитических ферментов в моющей композиции или в процессе мойки.

Делеция или внедрение аминокислот в полипептидную цепь протеазы, созданные искусственно путем мутагенеза или произошедшие естественным путем в протеазах, гомологичных РВ92 протеазе, может изменить нумерацию аминокислот. Однако положения, гомологичные положениям в РВ92 протеазе, также охватываются объемом притязаний.

Нижеследующие примеры предлагаются для иллюстрации изобретения, но без его ограничения.

Экспериментальный раздел.

Конструкция мутантов РВ92 протеазы.

Базовый конструкт, с которым начаты работы по мутагенезу, обозначен как рМ58 и подробно описан в заявке на Европейский патент 0283075.

Использованная стратегия включает три следующих этапа:
а) Конструирование вектора М13М1 для проведения мутагенеза.

в) Проведение мутации.

с) Конструирование рМ58 δ Есо и субклонирование мутационного фрагмента ДНК в этом векторе.

1.a) Конструирование вектора М13М1 для проведения мутагенеза.

Базовый конструкт рМ58 гидролизуют с помощью ферментов рестрикции НраI и BaII. Фрагмент в 1400 п.о. включающий ген РВ92 протеазы, очищают на низкоплавкой агарозе (24).

Вектор М13МР11 гидролизуют с помощью (25). Вышеполученный фрагмент ДНК в 1400 п.о. лигируют в этот вектор и полученной рекомбинантной ДНК трансфектируют в Е.coli JM101 (26).

После размножения фага в E. coli JM101 выделяют ss ДНК (27), причем вставку и ее ориентацию в векторе контролируют с помощью фрагментов ДНК (28).

В результате получают пригодный для осуществления мутагенеза вектор, получивший обозначение М13М1. Вышеприведенная методика схематично отражена на фиг. 1.

1.в) Проведение мутации.

Мутагенез проводят на М13М1 с использованием ss ДНК указанного вектора и ds ДНК М13mp19 (29), причем последний вектор обрабатывают с помощью ферментов рестрикции EcoRI и Hind III с последующей очисткой большего фрагмента на низкоплавкой агарозе.

Осуществляют мутагенез для отбора мутантов вместо E.coli WКЗО-3 применяют E.coli JM105 (30).

Длина олигонуклеотидов, применяемых для создания специфичных мутаций, составляет 22 нуклеотида. Область специфичной мутации, используемой для создания нескольких мутаций одновременно в специфичной ДНК последовательности, получают применением препарата олигонуклеотида протяженностью в 40 нуклеотидов со всеми четырьмя нуклеотидами, неупорядоченно введенными в сайты, соответствующие намеченной для мутации аминокислоте(ам).

После мутагенеза потенциальные мутанты проверяют на соответствующую мутацию анализом последовательности с помощью дидидезокси-метода (см. выше). У однонитевого фрагмента (фиг. 2) определяют последовательность нуклеотидов с целью проверки отсутствия вторичных мутаций. Методика схематично отражена на фиг. 2.

Вышеприведенная методика применима для создания фрагментов ДНК с мутациями с 3'-части гена протеазы (аминокислоты 154-269).

Для создания фрагментов ДНК с мутациями в 5'-части гена протеазы в векторе Bacillus могут быть применены альтернативные ферменты рестрикции и могут быть сконструированы модифицированные гены РВ92 протеазы по методике, аналогичной методике, отраженной на фиг. 1.

1. с) Конструирование рМ58 d Есо и субклонирование фрагментов ДНК, содержащих мутации, в этом векторе.

Для конструирования рМ58 d Есо обрабатывают рМ58 с помощью фермента рестрикции ЕсоR1 и лигируют с помощью Т4 лигазы в разбавленных условиях. Полученную в результате лигации смесь используют для трансформации B.subtilis 1-А40 (Центр генетических образцов бацилл, шт. Огайо) (31).

Трансформированные клетки помещают на пластинки минимального размера, содержащими 20 мкг/мл неомицина, по методике примера 1 заявки на Европейский патент 0283075.

Выделяют плазмидные ДНК трансформантов (32) и анализируют с помощью ферментов рестрикции. Этим путем выделяют рМ58 d Есо (см.фиг. 3).

Для получения мутантного фермента ДНК-фрагменты М13М1, содержащие целевые мутации и полученные согласно разделу 1.с. субклонируют в рМ58 d Есо. dsДНК М13М1 (см. выше) гидролизуют с помощью ЕсоR1 и лигируют в ЕсоR1-сайт рМ58 d Есо. Полученную в результате лигирования смесь используют для трансформации B.subtils DB104 (33).

Клетки из трансформированной смеси помещают на пластинки минимального размера, содержащие 20 мкг/мл неомицина и 0,4 казеина (заявка на Европейский патент 0283075). Выделяют ДНК, которая кодирует протеазу и анализируют с помощью ферментов рестрикции.

2. Получение мутантных протеаз.

Трансформанты DB104, у которых определено наличие вектора с измененным геном протеазы, выращивают на среде, содержащей 10 мл триптонового осевого бульона (ТСБ), 20 мкг/мл неомицина, и инкубируют 24 ч при 37^oC. Образцы культуры (0,1 мл) помещают во встряхиваемых колбах на 500 мл с 100 мл среды для получения протеазы: 12,5 г/л дрожжевого экстракта (Difco), 0,97 г/л CaCl₂·6H₂O, 2,25 г/л MgCl₂·6H₂O, 20 мг/л MnSO₄·4H₂O, 1 мг/л СoCl₂·6H₂O, 0,5 г/л цитрата, 0,5 мл/л противопенной присадки 5693,6 мас./об. мальтозы, 0,2 М фосфатного буфера с рН 6,8 и 20 мкг/мл неомицина.

После инкубирования в течение 65 ч при постоянной аэрации определяют активность протеазы на диметилказеине в качестве субстракта (34). Для получения больших количеств РВ92 дикого типа и мутантных РВ92 протеаз те же штаммы также выращивают при 37^oC в аэрируемых ферментаторах на 10 л и более в той же продуцирующей среде, что в случае встряхиваемой колбы.

Полученные бульоны используют для очистки протеазы.

3. Очистка и концентрирование РВ92 протеазы дикого типа и ее мутантов.

Мутантную или дикого типа РВ92 протеазу, полученную из Bacillus subtilis DB104 во встряхиваемых колбах или ферметаторах на 10 л, очищают катионообменной хроматографией использованием дисков или патронов (PS-типа, LKB) Zeta-Prep^R. Ферментационный бульон центрифугируют (3000 g, 10 мин) и жидкую часть разбавляют 10-кратно 10 мМ натрий-фосфатным буфером (рН 5,5), после чего переносят на катионообменник. После промывания несколькими объемами фосфатного буфера протеазу элюируют включением в фосфатный буфер 0,4 М NaCl. Содержащие активную протеазу фракции объединяют и концентрируют ультрафильтрацией с использованием ячейки Amicon, снабженной фильтром РМ-10. Концентрацию NaCl снижают путем разбавления примерно до 50 мМ и осуществляют концентрирование раствора протеазы фосфатным буфером, после чего хранят при -80^oC при концентрации белка 1 10 мг/мл.

При выделении мутантной РВ92 протеазы из ферментационных бульонов большего объема добавляют CaCl₂ (1% мас./мас.) и ацетон (30% мас./мас.). После фильтрования с отделением клеточной массы, протеазу осаждают из полученного фильтрата добавлением 0,2 2% мас./мас. СаSO₄·2H₂O и дополнительным добавлением ацетона до окончательной его концентрации > 60% (мас./мас.). Осадок отфильтровывают, опрыскивают ацетоном и после высушивания получают сырой порошковый фермент (СПФ).

4. Техника анализа для проверки чистоты очищенных протеаз.

Протеазы считают чистыми, если при проведении электрофореза или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) получают одну полосу или пик.

Проводят электрофорез на полиакриламидном геле (ПАГЭ) в присутствии натрийдодецилсульфата (НДС) (35). Однако, денатурированию образцов протеазы НДС при 100^oC должна предшествовать дезактивация активной протеазы с целью избежать саморазрушения. Это может быть осуществлено инкубированием с фенилметилсульфонилфторидом (ФМСФ) (1 мМ, 30 мин, комнатная температура) или осаждением трихлоруксусной кислотой (ТХУ, 8% 30 мин, на льду). Нативный ПАГЭ проводят при рН 7,45 (буфер геля, состоящий из 20 мМ гистидина (Гис) и 50 мМ 3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты (МОПС) в 5% полиакриламидных гелях (отношение акриламид: бис-акриламид 20:1). Образцы белка наносят на верхнюю часть пластинки с гелем и направляют электрофорезом к катоду. Тот же Гис/МОПС буфер применяют и в качестве буфера при электрофорезе (в резервуаре), но при рН 6,3. После электрофореза (1,5-2 ч, 350 В) для фиксации белков в геле гель вымачивают в 8%-ной уксусной кислоте и затем окрашивают Кумассии бриллиантовым голубым Р250 и обеспечивают по стандартным методикам.

Проверку чистоты с помощью ВЭЖХ проводят на катионообменных колонках (Monos Pharmacia Fine Chemicals) и гельфильтрующих колонках (TSK 2000 SW-LKB). В первом случае применяют 10 мМ натрийфосфатный буфер с рН 5,5 и элюирование связанной протеазы достигают применением линейного градиента 10 - 30 мМ натрийфосфатного буфера (pH 5,5). В случае гельфильтрующих колонок применяют 0,25 М натрийацетат (pH 5,5).

5. Определение концентpации протеазы.

Для определения концентрации белка в очищенном растворе протеазы используют:
1) измерение затухания при 280 нм с привлечением рассчитанного коэффициента затухания S_M и
2) титрование активного сайта.

Коэффициент затухания рассчитывают на основании числа триптофанов (Σ_M 5600 М^-1·cм^-1) и тирозинов (Σ_M 1330 М^-1·см^-1) на молекулу протеазы. Для РВ92 протеазы E^1%_1см 26100 м^-1·см^-1 (3Trp, 7 Tyr остатков), что эквивалентно Σ_M, измеренному при 280 нм 9,7 (Мr 26729 Da). В случае мутантов с различным числом Trp и Tyr вносят соответствующие поправки.

Определение молекул активного фермента проводят титрованием активного сайта. Поскольку широко применяемый способ с N-трансциннамоилимидазолом не дает удовлетворительных результатов в случае РВ92 протеазы (30), создан способ с применением ПМСФ. Согласно этому способу раствор протеазы с установленной концентрацией (по поглощению при 280 нм) смешивают соответственно с 0,25, 0,5, 0,75, 1 и 1,25 эквивалентами ПМСФ и оставляют для реакции на один час при комнатной температуре в 10 мМ натрийфосфате (рН 6,5). Концентрация фермента должна быть по меньшей мере 50 мкМ.

Остаточную активность определяют спектрофотометрически с использованием в качестве субстрата сукцинил-L-аланил-L-аланил-L-пролил-L-фенилаланил-пара-нитроанилида (sAAPFpNa, см. ниже). Чистоту (а следовательно, и концентрацию) ПМСФ определяют ЯМР-спектроскопией и растворы для определения готовят в изопропаноле. Результаты, полученные при титровании активного сайта, находятся в согласии с результатами проверки чистоты ВЭЖХ.

6. Определение кинетических параметров дикого типа и мутантных протеаз.

1. Активность по белковым субстратам (казеин) измеряют при рН 10 в соответствии с описанием патента Великобритании 1353317 (выражают в единицах щелочности Дельфта ЕШД).

2. Показатель производительности с казеином в качестве субстрата из меряют в рН-стате. Реакционная камера рН-стата (Radiometer, Копенгаген) содержит 10 мл 0,1 М КСl с 50 мг казеина (Hammerstein, Mersk). Протоны, выделяемые при гидролизе казеина PB92 протеазой, титруют 10 мМ NaOH, поддерживая рН 10 (при 40^oC и в токе азота).

3. Активность к синтетическим пептидам измеряют применением sAAPFpNa. Образующийся (желтый) пара-нитроанилид (рNA) определяют спектрофотометрически при 410 нм: Σ_M 8480 м^-1·см^-1 (36) на спектрофотометре UVIKON (KONTRON), снабженном термостатированным шестипозиционным заменителем ячеек. Кинетические параметры и K_cat и K_m получают измерением начальной скорости при различных концентрациях субстрата (для РВ92 протеазы 0,1 6 мМ), подводя полученные данные к гиперболической функции применением нелинейной регрессии с итеративным методом многомерной секущей. Подсчитывают константу специфичности (K_cat/K_m). Измерения проводят при 25^oC в конечном объеме 1 мл, содержащем 0,1 М Трис-НСl+0,1 М NaCl, рН 8,6. Хлористый натрий необходим, поскольку в его отсутствие РВ92 протеаза дает нелинейное слияние линий кривых Бурка, что могло быть вызвано ингибированием субстрата. Субстрат вначале растворяют в ДМСО до концентрации 200 мМ и затем разбавляют 0,1 М Трис-НСl (рН 8,6) с получением раствора для определений в 20 мМ (определяют спектрофотометрически при 315 нм: Σ_M 14000 м^-1·см^-1. Никаких коррекций не проводят для изменяемых концентраций ДМСО (0,05 3 об./об.).

7. Окисление РВ92 протеазы.

Определяют чувствительность РВ92 протеаз к окислению Н₂O₂ за исключением того, что:
1) вместо 100 мМ Н₂O₂ применяют 20 мМ и
2) в качестве дополнительного окислителя применяют 20 мМ раствор пербората натрия в смеси с 10 мМ ТАЕD (37).

8. Испытание моющей способности.

Мутантные РВ92 протеазы испытывают в специально разработанном моечном испытании на образчиках ткани из хлопка и полиэфирхлопка, запачканных молоком, кровью и чернилами (5х5 см, получены от ЕМРА, Сан Галлен, Швейцария, обозначены номерами 116 и 117).

Моечные испытания проводят в приборе для определения прочности тканей к стирке LEF-FC фирмы Atlas, снабженными испытательными сосудами из нержавеющей стали, в каждом из которых содержится указанная моющая композиция плюс испытуемая протеаза (мутантные РВ92 протеазы и РВ92 протеаза). Если нет особых указаний испытание проводят 30 мин при целевой температуре. После мытья образчики ткани сушат воздухом и отражательную способность испытуемых тканей измеряют при 680 нм на фотометре Photovolt (Модель 577), снабженном зеленым фильтром. Данные по отражательной способности, полученные для испытуемых образчиков ткани, отмытых детергентами, содержащими соответствующие мутанты РВ92 протеазы, сравнивают с данными по отражательной способности для сравнимой серии измерений с детергентами, содержащими РВ92 протеазу. Значения моющей способности мутантных протеаз подсчитывают делением количества белка РВ92 протеазы (мг) на количество белка мутантной протеазы (мг), необходимое для достижения той же отражательной способности, х 100%
Пример 1.

А. Моющую способность различных мутантов РВ92 протеазы в Европейских порошковых детергентах определяют вышеприведенным способом.

В испытательные сосуды из нержавеющей стали, содержащие указанное количество порошкового детергента 1ЕС, растворенного в 250 мл воды (СН 15^o), и туда же загружают по два хлопковых и полиэфир-хлопковых образчика тканей. Порошковый детергент IEC имеет следующий состав:
Компонент мас.

Линейный натрийалкилбензолсульфонат (средняя длина алкановой цепи С 11,5) 6,4
Этоксилированный талловый спирт (14 ЭО) 2,3
Натриевое мыло 2,8
Натрийтриполифосфат (НТПФ) 35,0
Натрийсиликат 6,0
Магнийсиликат 1,5
Карбоксиметилцеллюлоза 1,0
Натрийсульфат 16,8
Тетрагидрат натрийпербората 18,5
TAED 1,5
Разное + вода До 100
В каждый сосуд добавляют мутантную РВ92 протеазу до концентрации 0 1,74 мг (очищенной) протеазы на литр воды с добавками. Один из сосудов используют для испытания таким же образом РВ92 протеазы с целью сравнения. Моечные испытания проводят при 40^oC. Полученные результаты приведены в табл. 1.

В. Испытание моющей способности повторяют при 25^oC c тем же детергентом, содержащим некоторые мутантные РВ92 протеазы. Для сравнения снова используют РВ92 протеазу. Другие условия испытаний те же, что и вышеприведенные. Полученные результаты приведены в табл. 2.

С. Моющую способность протеаз также определяют в нефосфатном отбеливателе, содержащем Европейский порошковый детергент. Испытания проводят в приборе для определения прочности тканей при стирке при 25 и 40^oC. И в этом случае для сравнения используют РВ92 протеазу. Другие условия испытаний соответствуют вышеприведенным. Полученные результаты приведены в табл. 3.

Пример 2. Мутантную М216S РВ92 протеазу испытывают на стабильность при хранении в порошковом детергенте IEC, описанном в примере 1. Стабильность при хранении исследуют на климатических стендах при 30^oC и относительной влажности (ОВ) 80
Протеазу для этих опытов капсулируют следующим образом.

Приготовляют смесь, содержащую (в мас./мас.): 2 очищенной протеазы; 50 неионного ПАВ (этоксилированный С₁₄-C₁₈-спирт с 50-80 звеньями ЭО), 5 TiO₂, 3 10 СаSO₄·2H₂O, NaSO₄ до 100 Смесь нагревают до 65 90^oC и охлаждают до комнатной температуры. Частички диаметром 0,5 1 мм просеивают и используют в испытаниях на хранение в детергентах.

Порошковый детергент IEC (3,5 г), содержащий мутантную М216S протеазу в концентрации 6140 ЕШД/г детергента, хранят в пузырьках на 18 мл. Для сравнения в тех же условиях хранят РВ92 протеазу. Спустя 2, 4, 5 и 6 нед определяют остаточную активность протеаз. Полученные результаты приведены в табл. 4.

Пример 3. РВ92 протеазу и различные мутантные РВ92 протеазы испытывают на стабильность при хранении в порошковом детергенте. В испытаниях на стабильность при хранении протеазы используют в виде капсул.

Продукты протеазы получают смешиванием при 80^oC следующих компонентов: Компонент мас.

AE (полиэтоксилированный С₁₄-C₁₈-спирт; спирт этоксилируют 50-80 группами этиленоксида (ЭО)) 50
TiO₂ 2
Протеаза (СПФ) 7
ПВП (поливинилпирролидон К17) 1,5
ВНТ (2,6-бис(трет.-бутил)-4-метилфенол) 1
Na₂SO₄ До 100
Полученную смесь капсулируют гранулированием отверждением (патент Великобритании N 1603640). Фракцию частиц размером 0,3 0,8 мм используют для определения стабильности при хранении протеаз. Капсулированную протеазу (140 мг) смешивают с базой ALL^R (6,4 г) и тетрагидратом натрийпербората (0,6 г). (АLL зарегистрированная фирменная марка Unilever N,V). Порошковая база ALL не содержит ферментов или отбеливателей.

Смесь фермент-детергент-тетрагидрат натрийпербората инкубируют при 30^oC и ОВ 80% В табл. 5 приведена остаточная активность после указанного срока хранения.

Пример 4. По методике примера 3 капсулируют РВ92 протеазу и различные мутанты РВ92 протеазы. Однако в настоящем примере 70 мг капсулированной протеазы с размером частиц 0,3 0,9 мм смешивают с 3,2 г ALL и 0,3 г тетрагидрата натрийпербората. Образцы хранят при 30^oC в пузырьках на 18 мл, помещенные в вакуумный эксикатор. В первые 3 дня хранения поддерживают вакуум в 25 мм Hg.

В вакууме скорость переноса водяных паров возрастает, вследствие чего система достигает равновесия при ОВ 80 быстрее, чем без вакуума. ОВ в 80 создают с помощью насыщенного раствора бромида калия.

В табл. 6 приведены значения остаточной активности после указанного периода хранения.

Пример 5. Получают следующую жидкую моющую композицию:
Компонент мас.

Линейная С₁₀-C₁₃-алкилбензолсульфокислота 12
Полиэтоксилированный С₁₃-спирт (8 ЭО) 13
Лауриновая кислота 8
Олеиновая кислота 4
Триэтаноламин 6
1,2-пропандиол 6
Этанол 5
Натрий цитрат 4
Диэтилентетраминпентауксусная кислота 0,3
Кальцийформат 0,12
Натрийформат 1
Боракс 1,9
NaOH, 25 (мас./мас.) раствор До рН 11,2
Вода До 100
РВ92 протеазу и различные мутантные РВ92 протеазы добавляют к вышеприведенной композиции в количестве, обеспечивающем начальную концентрацию протеазы 0,13 (мас./мас.).

Стабильность протеазы (в остаточной активности) определяют после хранения содержащей протеазу композиции при 37^oC в течение указанного числа дней. Полученные результаты приведены в табл. 7.

Пример 6. С участием РВ92 протеазы и некоторых мутантных протеаз получают составы, содержащие в каждом случае следующие компоненты:
Компонент мас.

Амилогум CIS 45
Сахароза 23
Сорбит 17
Глицерин 4
Парафиновое масло 3
NaH₂PO₄ 0,5
Протеаза (СЕР) 5
ПВП К17 1,5
TiO₂ 1
Из указанных смесей получают грануляты фактически по методике, приведенной в примере 5 патента США N 4242219 за исключением того, что смесь, указанную в примере, заменяют вышеприведенной смесью; применяют отверстия диаметром 0,7 мм, а не 1 мм; на гранулы не наносят покрытия.

Полученные гранулы (140 мг) смешивают с базой ALL (6,4 г) и тетрагидратом натрийпербората (0,6 г), после чего помещают в пузырьки на 36 мл.

Затем определяют стабильность протеазы (в остаточной активности) в результате хранения в пузырьках при 30^oC и ОВ 80 в течение указанного периода времени (недели). Полученные результаты приведены в табл. 8.

Пример 7. Гранулированные продукты РВ92 протеазы и мутантных протеаз получают и смешивают с детергентом и отбеливателем по методике примера 3.

Стабильность при хранении полученных образцов (в остаточной активности) определяют при 30^oC и ОВ 60/80 (попеременно: 12 ч при ОВ 60 и 12 ч при ОВ 80 ). Полученные результаты приведены в табл. 9.

Пример 8. Гранулы, содержащие РВ92 протеазу и мутантные протеазы, получают и смешивают с детергентом и отбеливателем так, как это описано в примере 6.

Стабильность при хранении полученных образцов (в остаточной активности) определяют после выдерживания в указанный период времени при 30^oC и ОВ, которую 12 ч поддерживают в 60 и 12 ч 80 Полученные результаты приведены в табл. 10.

Пример 9. РВ92 протеазу и мутантные протеазы испытывают на стабильность при хранении в содержащем отбеливатель порошковом детергенте при 30^oC и ОВ 80 В данном опыте протеазы применяют в виде капсул. Каждую протеазу капсулируют следующим образом.

При 80^oC приготовляют смесь, включающую следующую композицию:
Компонент мас.

Неионное ПАВ (полиэтоксилированный С₁₄-C₁₈-спирт (50-80 групп (ЭО)) 45
TiO₂ 2
Протеаза (СПФ) 10
Na₂SO₄ До 100
Полученную смесь охлаждают до комнатной температуры.

Затвердевшую смесь размалывают на мелкие частички. Отсеивают частицы размером 0,3 0,8 мм, которые используют в опытах хранение.

В опытах на хранение 140 мг каждой капсулированной протеазы смешивают с 6,4 г порошкового детергента ALL и 0,6 г тетрагидрата натрийпербората. Порошок базового ALL не содержит ни фермента, ни натрийпербората. Смеси базовый ALL (протеаза) тетрагидрат натрийпербората выдерживают при 30^oC и ОВ 80
После хранения в течение 0, 1, 2 или 4 нед определяют стабильность каждой протеазы (в остаточной активности).

Полученные результаты приведены в табл. 11.

Пример 10. Мутантные РВ92 протеазы испытывают в моечном испытании по существу в тез же условиях, что и в примере 1, но за исключением того, что в 250 мл воды (GH 5^o) в сосуде прибора для определения прочности тканей при стирке добавляют композицию следующего состава:
Компонент мас.

Лауриновая кислота 8
Олеиновая кислота 4
Линейная С₁₀-C₁₃-алкилбензолсульфокислота 12
Полиэтоксилированный С₁₃-спирт (9 ЭО) 13
Триэтаноламин 6
1,2-пропандиол 6
Этанол 5
Гидроксид натрия, 45 (мас./мас.) 4
Натрийцитрат 4
Вода До 100
(рН смеси 7,2)
Моющую способность различных протеаз определяют в таком жидком детергенте в приборе для определения прочности тканей при стирке при 25^oC в течение 30 мин. После стирки по методике примера 1 определяют отражающую способность испытуемых тканей. Моющую способность мутантных протеаз определяют так, как описано в примере 1. Полученные результаты приведены в табл. 12.

Моющая способность различных протеаз определена в жидких детергентах: Tide^R, Wisk^R и Ariel^R. Сосуды из нержавеющей стали содержат соответственно 0,375 г Tide в 250 мл воды (GH 5^o), либо 0,375 г Wisk в 250 мл воды (GH 5^o), либо 1,25 г Ariel в 250 мл воды (GH 15^o). Моющую способность определяют при 25 или 40^oC. Полученные результаты приведены в табл. 13.

Пример 11. Моющую способность мутантных РВ92 протеаз определяют в статистическом испытании в обычной стиральной машине по Т110. Делфт, Нидерланды (Исследовательский институт техники для чистки). Моющую способность мутантных протеаз сравнивают с моющей способностью РВ92 протеазы.

Все протеазы отвешивают в детергент IEC в пересчете на массу белка (0,007% мас. /мас. ). В пересчете на активность вводит следующие дозировки, ЕШД/г детергента
РВ92 протеаза 1460
М216S 679
M216Q 479
S160D 1080
N212D 1455
Для каждой композиции детергент-протеаза проведено 8 моечных испытаний при 40^oC в одинаковых стиральных двурежимных машинах АЕG Turnamat. В каждой стиральной машине применяют 170 г детергента. В ходе испытаний исследуемые детергенты используют таким образом, что каждый порошок протерпевает одинаковое число моечных циклов в каждой машине.

В ходе испытаний применяют обычную водопроводную воду, поступающую в город Делфт со следующими показателями:
Щелочность (М) 2,2 ммоль/л
Жесткость (Н) 1,6 ммоль/л (9^oGH)
Температура 20^oC
Удаление грязи и пятен с испытуемых тканей.

В каждой серии испытаний отмывают 6 образчиков тканей с тремя типами загрязнений на хлопке по ЕМРА (N 111, 116 и 117) вместе с загрязненным бельем.

Эффективность удаления пятен и грязи с искусственно загрязненных испытуемых тканей определяют пропусканием трехкомпонентного светло-голубого перпендикулярно испытуемой ткани. Измеряют количество света, отраженного от испытуемой ткани под углом 45^o. Согласно публикации IEC 456 значение ремиссии для окиси магния приравнивается к 100. Чем выше значение ремиссии, тем лучше моечный процесс для конкретного вида загрязнения.

Загрузка в стиральную машину.

Стиральную машину заполняют загрузкой в 4,75 кг, состоящей из испытуемых тканей и белья, ставшего грязным в ходе обычного домашнего употребления.

Белье включает: 6 кухонных полотенец, 4 штуки нижнего белья, 4 простыни, 4 наволочки.

При необходимости для достижения необходимой за грузки добавляются чистые простыни и наволочки.

Для каждого моечного процесса тщательно отбирают белье. Каждый кусок ткани, выбранный для загрузки в одну из машин, имеет в равной степени загрязненный аналог, отмываемый в одной из других стиральных машин. В результате этого нагрузка загрязнения в каждом процессе была равной.

Параметры моечного процесса приведены в табл. 13А.

Cредние значение ремиссии (V) и отношение (R) определяют после 8 моечных испытаний.

Результаты двух независимых опытов приведенных в табл. 14А и 14В.

В табл. 15 соотношения (R), полученные в статистических испытаниях в обычных стиральных машинах, делят на соответствующее отношение (R'), подсчитанные на основе значений моющей способности в сравнении с РВ92 протеазой, которые были получены в моечных испытаниях в приборе для определения прочности тканей при стирке в аналогичных условиях (10 г/л IEC, испытуемые ткани 116 и 117 по ЕМРА, время стирки 30 мин, температура 40^oC).

Значения Р/P' для мутантных протеаз, близкие к 1, указывают на корреляцию между испытаниями в обычных стиральных машинах и испытаниями в приборе для определения прочности тканей при стирке.

Пример 12. 4 и 5 отражают моющую способность в 4 г IEC/л различных мутантных РВ92 протеаз согласно испытаниям, описанным в примере 1, в сравнении с нативной РВ92 протеазой как функции их удельной активности. Цифры на диаграмме соответствуют следующим мутантным протеазам:
1 РВ92 протеаза
2 М216А
3 М216С
4 М216S
5 М216L
6 M216E
7 M216K
8 M216H
9 M216N
10 M216Q
11 M216P
12 M216T
13 M216W
14 M216I
15 M216G
16 M117L, H118D
17 M117L, M216Q
18 M117L, H118D, M216Q
19 M117L, M216S
20 M117L, H118D, M216S
21 M169S
22 M216Y
23 M169I, M216S
24 M216-ox
25 N212S
26 N212D
27 S160G, N212D
28 L211Y
29 L211Y, N212S
30 A166D, M169I
31 S259K
32 W235R
33 H243R
34 H243R, S259K
35 D175N
36 E134K
37 W236R, S259K
38 W235R, H243R
39 S259K
40 T207K
41 S160N
42 S160G
43 S160P
44 S160T
45 S160C
46 S160Q
47 S160D
48 S160K
49 S160R
50 S160A
51 S160I
52 S160G, M216G
53 S160G, M216Q
54 S160L
55 S160Y
56 S160D, M216S
57 G116V, S126V, P127E, S128K
58 G116V, S126L, P127N, S128V
59 G116V, S126L, P127Q, S128A
60 G116V, S126V, P127M
61 S126M, P127A, S128G
62 G116V, S126V, P127G, S128L
63 G116V, S126N, P127H, S128I
64 G116V, S126H, P127Y
65 G116V, S126R, P127S, S128P
66 G116V, S126F, P127Q
67 G116V, S126G, P127Q, S1281
68 G116V, S126F, P127L, S128T
69 G116V, S126Q, P127D.

Фиг. 6 отражает моющую способность в 7 г/л различных мутантных РВ92 протеаз согласно испытаниям, описанным в примере 1, в сравнении с нативной РВ92 протеазой как функцию их удельной активности. Цифры на диаграмме соответствуют тем же мутантным протеазам, что и на фиг. 4 и 5.

Литература
1. "Получение микробиологических ферментов" в изд. "Микробиологическая технология", т. I (1979), 28-311, Академик Пресс.

2. "Поверхностно-активные средства", т. II, Schwart, Perry and Berch, Interscience Press (1958).

3. Svendsen, Carlsberg Res. Comm. 44 (1976), 237-291.

4. Hui et al. E M B J. 3, (1984), 623-629.

5. Mattecci et al. Nucl. Acids Res. II, (1983), рр.3113-3121.

6. Murphy et al. Nucl. Acids Res. (1983), 7695-7700.

7. Wells et al. Gene 34 (1985), рр.315-323.

8. Hutchinon et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 (1986), рр.710-714.

9. F.M.Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, 1987-1988, Green Publishers Association and Willy Interscience 1987.

10. J.Biol. Chem. 244 (1968) 5333-5338.

11. Estell et al. J.Biol. Chem. 260 (1985), рр.6518-6521.

12. Nature 328 (1987), рр.551-554.

13. Bryan et al. Proteins I (1986), 326-334.

14. Cunningham and Wells, Protein Engineering, (1987), 319-325.

15. Russell et al. J.Mol. Biol. 193 (1987), 803-819.

16. Kat and Kossianoff, J.Biol. Chem. 261 (1986), рр.15480-15485.

17. Shaw Biochem. J. 246 (1987), рр.1-17.

18. Gait et al. Protein Engineering I (1987), 267-274.

19. Kland and Smith (1971) "Ферменты" (под ред. Boyer), Vol.3, рр.561-608, Academic Press, New York.

20. Debange and Smith, J.Biol. Chem. 243 (1968), р.2184.

21. Matsubara et al. J.Biol. Chem. 240 (1965), р.1125.

22. Satauffer et al. J.Biol. Chem. 244 (1969) рр.5333-5338.

23. Estell et al. J.Biol. Chem. 263, (1985), рр.6518-6521.

24. Maniotis, "Молекулярное клонирование", Лабораторное руководство, Коулд Спринг Харбор, 1982.

25. Messing et al. Nucl. Acids Res. 9 (1981), рр.303-321.

26. Cohen et al. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 69 (1972), рр.2110-2114.

27. Heidecker et al. Gene 10 (198 ), рр.69-73.

28. Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977), р.64.63.

29. Messing et al. Nucleic Acids Res. 9 (1988), рр.303-321.

30. Kramer et al. Nucleic Acids Res. 12 (1984), рр.9441-9456.

31. Spizizin et al. J.Bacteriol. 81 (1961), рр.741-746.

32. Birnboim and Doly, Nucleic Acids Res. 7 (1979), рр.1513-1523.

33. Doi. J.Bakteriol. 160 (1984), рр.442-444.

34. Lin et al. J.Biol. Chem. 244 (1969), рр.789-793.

35. Laemmli, Nature, 287 (1970), рр.680-685.

36. E.G.Delmar et al. Anal. Boichem. 94 (1979), рр.316-320.

37. Estell et al. J.Biol. Chem. 260 (1985), рр.6518-6521.

Формула изобретения

1.Способ получения мутантной протеазы, предусматривающий получение гена, кодирующего протеазу, имеющую аминокислотную последовательность, характеризующуюся по крайней мере 70% гомологией с аминокислотной последовательностью сериновой протеазы PB92 со структурой, клонирование гена в вектор экспрессии, трансформацию полученными рекомбинантными ДНК штаммов-реципиентов Bacillus, отбор клонов, выделение и очистку целевого продукта, отличающийся тем, что получают ген, кодирующий протеазу, с заменой аминокислот в положениях 32, и/или 33, и/или 48, и/или 49, и/или 50, и/или 51, и/или 52, и/или 53, и/или 54, и/или 58, и/или 59 62, и/или 94 107, и/или 116 118, и/или 123 134, и/или 150, и/или 152 156, и/или 158 161, и/или 164, и/или 166, и/или 169, и/или 175 186, и/или 197, и/или 198, и/или 203 - 216, и/или 235, и/или 243, и/или 259 на более устойчивую к окислению нейтральную или анионную аминокислоту.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве штамма-реципиента используют Bacillus subtilis ДВ104.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве штамма-реципиента используют штамм Bacillus, который неспособен продуцировать неклеточные протеазы.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что получают ген, кодирующий протеазу, содержащую в 116 положении неполярную алифатическую аминокислоту с более высокой молекулярной массой, чем у глицина.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что получают ген, кодирующий протеазу, содержащую в положении 128 вместо серина другую негидроксилированную аминокислоту.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что получают ген, кодирующий протеазу, содержащую в положении 216 вместо метионина любую другую серонесодержащую аминокислоту.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что получают ген, кодирующий протеазу, содержащую в положении 166 анионную аминокислоту.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что получают ген, кодирующий протеазу, содержащую в положении 169 любую неполярную алифатическую аминокислоту.

9. Способ по 1, отличающийся тем, что получают ген, кодирующий протеазу, содержащую в 116 вместо глицина валина, или изолейцин, или лейцин.

10.Способ по п.1, отличающийся тем, что получают ген, кодирующий протеазу со следующими заменами аминокислот (см.текст описания).

11.Способ по п.1, отличающийся тем, что получают ген, кодирующий протеазу, содержащую в положении 212 любую анионную аминокислоту.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14