Штамм бактерий rhizobium leguminosarum-продуцент рестриктазы rle 69i

 

Использование: биотехнология и генная инженерия Сущность изобретения использование штамма бактерий Rhizobium leguminosarum ВНИ- ИСХМ В-195 (69) - продуцента рестриктазы 69 1 позволяет в 3.3 раза повысить выход целевого фермента, тем самым снизить себестоимость продукции Штамм бактерий Rhizobium leguminosarum 69 продуцирует эндонуклеазу рестрикции, имеющую сайт узнавания GGTCTC „CCAGAG.. 4 ил

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 4946840/13 (22) 18.06.91 (46) 30.10.93 Бюп Na 39-40 (71) Научно-исследовательский конструкторскотехнологический институт биологически активных веществ Науао-производственного объединения

"Вектор"; Центральный Сибирский ботанический сад

СО РАН (72) Лебедев Л.P. Андреева И.С. Гордиенко НЯ„

Майстренко Г.Г„Репин В.Е; Пустошилова Н.M. (73) Научно-исследовательский конструкторскотехнологический институт биологически активных веществ Научно-производственного объединения (19) RU (11) 2001952 С1 (51) 12 01 9 14 С 12 N 1/2200

"Вектор" (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ (RHIZOBIUM

LEGUMINOSARUM>-ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ (RLE 691> (57) Использование: биотехнология и генная инженерия Сущность изобретения. использование штамма бактерий Rhizobium teguminosaium ВНИ—

ИСХМ В-195 (69) — продуцента рестриктазы Rte 69

1 позволяет в 3,3 раза повысить выход целевого фермента, тем самым снизить себестоимость продукции. Штамм бактерий Rhizobium teguminosarum

69 продуцирует эндонуклеазу рестрикции, имеющую сайт узнавания GGTCTC CCAGAG . 4 ил.

Изобретение относится к микробиологии и генной инженерии, в частности к получению эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать последовательность нуклеотидов ...GGTCTC„, ...CCAGAG...

Известен штамм Pseudomonaa

pauclmob1lls, продуцент эндонуклеаэы рестрикции Рра 1, способной узнавать последовательность нуклеотидов ...GGTCTC... ...CCAGAG.„.

Данные о продуктивности штамма отсутствуют.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является штамм Escherlchla

coll RFL 31, продуцент эндонуклеазы рестрикции, способный узнавать последовательность нуклеотидов ...GGTCTC... ...CCAGAG„, Недостатком штамма-прототипа является низкая продуктивность штамма, Выход фермента наблюдался около 9000 ед.акт./г клеток.

Целью изобретения является получение нового штамма-продуцента, не требовательного к питательным средам, обеспечивающего более высокий выход целевого фермента, способного узнавать последовательность ...GGTCTC... ...CCAGAG....

Это достигается получением и использованием штамма Rhizobium leguminosarum

69, продуцента эндонуклеазы рестрикции

Rie 69 1, Штамм R.leguminosarum 69 выделен иэ клубеньков Lathyrus tubегоsum в результате поиска штаммов — продуцентов эндонуклеаз рестрикции, Полученный штамм R,leguminosarum 69 хранится в коллекции НИКТИ БАВ под номером 320 и депонирован в коллекции культур микроорганизмов ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под регистрационным номером В-195. Продуцируемая им эндонуклеаза рестрикции названа Rle 69 1 согласно общепринятой номенклатуре Натана и

Смита.

Штамм R, leg uminosarum 69 характеризуется следующими морфологическими. культуральными и физиологическими признаками: клетки — полиморфные палочки, размером 0,5 — 0,8 х 1 — 3 мкм, грамотрицательные, подвижные. На агаризованной среде РПА (рыбно-пептонный агар) штамм образует слабо прозрачные, блестящие, гладкие, круглые колонии с ровным краем, пигмент среды и посевной черты не выражен; усваивает многие углеводы, индол, сероводород не выделяет, восстанавливает нитраты, использует цитрат, растет при эна5

55 чении рН 5,4, отрицэтелвн по цмстинэээ, уреээе, хорошо растет на обычных органических средах.

Штамм Rhlzoblum legumlnoaarum устойчив к тэким антибиотикам кэк пенициллин, оливидомицин, эритромицин, оксациллнм, ристомицин, эмпициллин, метициллии, pwфампицим, линкомицин, чувствителен к твтрациклиму, стрептомицину, мономмцину. неомицину, левомицетину, кэнамицину, карбенициллину. полимиксину, гетэмицину.

Продуцируемая предлагаемым штаммом рестриктаза Rle 69 1 характеризуется следующими свойствами: узнает последовательность нуклеотидов „,GGTCTC... ...CCAGAG„.; оптимальная температура действия фермента 37 С; значение рН 7,5-8,0, для проявлания активности рестриктаэы требуются ионы Mg + в концентрации

5 — 10 мМ.

Для поддержания штамма leguminosarum

69 используется LB-агар, Для культивирования и ферментации R.legumlnosarum 69 применяют питательную среду следующего состава, г/л воды: пептон 10; дрожжевой экстракт 5; NBC15; глюкоза 10. Культивирование проводят при температуре 30 С с аэрацией (180-200 об/мин) на качалке в течение 18 ч.

В ыход биомассы: 6 — 8 г/л культуральной среды. Выход высоко- очищенного фермента: 3000 ед.акт./г клеток.

Определяющим отличием предлагаемого штамма R.legumlnosarum 69 по сравнению с прототипом является в 3,3 раза более высокая продуктивность штамма.

Поскольку данный штамм получен впервые и для получения рестриктазы, узнающей последовательность нуклеотидов ...GGTCTC... ...CCAGAG... ранее никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "существенные отличия".

На фиг. 1 изображена электрофореграмма гидролиза ДНК фага А рестриктазами

Hind 111 u Rle 69 1, дорожки: à — обработка

Hind lII, Д вЂ” совместный гидролиз Hind lll u

Rle 69 1; на фиг. 2 — электрофореграмма гидролиза ДНК фага А рестриктазэми Mlu 1

u Rle 69 1, дорожки: А — совместный гидролиз Mlu + Rle 69 1, Б — гидролиз Rle 69 1, В— гидролиз Miu 1; на фиг. 3 — построение рестрикционной карты ДНК фага 1 с использованием ферментов Hind 111. Mlu I u Rle 69

1; на фиг, 4 — электрофореграммэ гидролизэ

2001952

ДНК плаэмиды pBR 322 рестриктазами Rsa

1, Rle 69 1 u Hind III, дорожки: А — обработка

Rsa 1, Б — обработка Rle 69 1,  — совместный гидролиз Rle 69 1 u Hind III, цифрами указано количество пар нуклеотидов в ферментах ДНК, Il р и м е р 1. Культивирование штамма и получение биомассы.

Культуру R.legumlnosarum выращивают на питательном бульоне следующего состава, г/л: пептон 10; дрожжевой экстракт 5; хлористый натрий 5; глюкоза 10 (! -бульон), Для получения инокулята суточную культуру с плотной среды засевают петлей в пробирки с косячками L-агара, инкубируют в термостате при температуре 30 С в течение 18 — 24 ч. Выращенную таким образом культуру смывают физиологическим раствором (или L-бульоном) и засевают полученной суспензией клеток качалочные колбы с объемом среды 250 мл, предназначенные для ферментации, иэ расчета:смыв с одного косячка — на две колбы, Инкубируют на качалке (200 — 220 об/мин), 24 ч при температуре 30 С. После охлаждения клетки собирают центрифугированием при 6000 об/мин. Выход биомассы составляет в среднем 6 г влажных клеток на 1 л среды.

Пример 2. Очистка фермента, 2 г клеток суспендируют в 4 мл буфера экстракции, содержащего 0,1 М трис-HCI, рН 8,0; 10 мМ 2-меркаптоэтанол и 0,1 -ный тритон Х-100 до гомогенного состояния.

Смесь обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе УЗДН-2т три раза по 20 с с перерывами по 40 с для охлаждения в ледяной бане. К суспензии добавляют 10 мл раствора, содержащего полиэтиленгликоль

ПЭГ-6000, декстран Т-500 и NaCI до конечных концентраций в суспенэии соответственно 7ф»; 1% и 0,35 M. Смесь тщательно перемешивают 20 мин при 0 С, затем центрифугируют 15 мин при 5000 об/мин, Супернатант (около 13,5 мл) отбирают и наносят на колонку (6 мл) с гепарин-сефарозой. Колонку промывают 10 мл буфера А, содерж, щего 10 мМ калийфосфат, рН 7,4 и 10 мМ

2-меркаптоэтанол, Белки элюируют линейным градиентом хлористого натрия от 0 до

1 М в буфере А, Рестриктаза Rle 69 1 обычно элюируется с колонки при концентрации

NaCI около 0,8 М, Фракции, содержащие активность рестриктазы, объединяют и наносят на колонку (1,5 мл) с гидроксилапатитом, Колонку промывают 3 мл буфера А и белки элюируют линейным градиентом калийфосфата от 0,01 до 1 М в растворе 10 мМ

2-меркаптоэтанола. Рестриктаза Rle 69 1 обычно элюируется при концентрации ка5

55 лийфосфата около 9,5 М. Фракции, содержащие целевой фермент, объединяют и диалиэуют против 100 мл буфера Б, содержащего

10 мМ трис-HCI, рН 7,4, 50 MM KCI, 10 MM

2-меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА и 50 -ный глицерин. Полученный фермент н ы и и репарат хранят при минус 20 С. Выход рестриктазы 30000 ед.акт. из 1 кг клеток.

Активность фермента определяют в 20 мкл рестрикционной смеси, содержащей 10

MM тоис-НС! рН 8,0, 10 мМ MgClz, 10 мМ

2-меркаптоэтанол, 20 мМ NaCI и 1 мкг ДНК фага 1. при 37 С. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного специфического расщепления 1 мкг ДНК за 1 ч при

37 С. Ферментный препарат свободен от значительных количеств примесей неспецифических нуклеаз и фосфатаз и пригоден для генноинженерных работ.

Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Rle

69 1, проводят картирование мест расщепления на ДНК с известной первичной последовательностью, в частности на ДНК фага

А и ДНК pBR 322. Для этого проводят параллельный и совместный гидролиз этих ДНК рестриктазой Rle 69 1 и рестриктазами с известной специфичностью. Для картирования мест гидролиза на ДНК фага Аиспользовали рестриктазы Hind III (фиг. 1) и Mlu 1 (фиг. 2), Установлено, что рестриктаза Rle 69

1 гидролизует ДНК в двух местах, а именно в районе участков 11400 -100 п.н. и 4270 + 100 п,н. (фиг. 3). При совместном гидроли3е ДНК pBR 322 рестриктазой Rle 69 1 и рестриктазами Rsa 1 и Hind III (фиг. 4) место гидролиза для Rie 69 1 локализовано в районе 3430 +-20 п.н. от EcoR 1 сайта. Сопоставляя все эти данные и исходя из первичных структур ДНК, устанавливают. что единственным сайтом узнавания рестриктазы Rle

69 1 является последовательность нуклеотидов ...GGTCTC...

„,CCAGAG„., Полученный штамм по сравнению с прототипом обеспечивает повышенный выход целевого продукта, составляющий 30000 ед.акт,/г биомассы (в 3 раза больше, чем в и р от от и и е).

Поскольку рестриктаза Rle 69 1 имеет сайт узнавания ..,GGTCTC..„èäeíòè÷íûé сайту узнавания рестриктазы Есо 31, 1, она может заменить эту рестриктазу во всех генно-инженерных работах. (56) Roberts R.J.— Restriction enzymes and

their isoschlzomers,-Nucl. Acid Res.. 1987, ч.

15, Supplement р r189-r217

2001952

А

Hind AT

ЯЕР б9Х

Г д

25VO— 1170б

5 Ц вЂ” ПФЙ б557 Я!б

Ф3б1 — — 5137

Цб1

2322 2322

2g27 2027 — 4гб

Ю г.1

5 8

Rle б9Т Р77 2.

RZe 691

Л2У/ гв 55 — гбгбг tt92 — 2O

Д б  — 2М

2209

12Π— 859

12бВ—

РЯ

Фиг z

Butkus V., Bitinaite J., Kersulyte О., Janulaitls

А.— А new restriction endonuclease Eco 31 1

Формула изобретения

Штамм бактерий Rhlzoblum

5В 7К

57В7—

ИМ

ЯФ7Д

220б

reccgnlzlng а пол-palindromic sequence.—

B loch, B iophys, Acta. 1985, ч. 826, р, 208-212.

legumlnosarum ВНИИСХМ В-195 — продуцент рестриктазы Rle 69 I.

2001952

15372

41

ffi.ndgF

А" 5" "g"

EsaI ИебИ Рй бд

Н014 Я

A б 8

45б2 —,Ябб — Ыб

Составитель Л. Лебедев

Техред М.Моргентал Корректор Е, Папп

Редактор Л, Павлова

Заказ 3156

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

21l8—

15á5

07@ g

Р2г бЯ?

®л ФД.

++87P ß1