Штамм бактерий bacillus sp., используемый в качестве тест- культуры для определения бактериологической стойкости стальных сплавов

 

Использование: биотехнология, техническая бактериология. Сущность изобретения: новый штамм бактерий Bacillus species ВКМВ-1780Д, используемый в качестве тест-культуры для определения бактериологической стойкости стальных сплавов, применяемых в тропическом климате. Предлагаемый штамм является более агрессивным и способен деструктировать большее количество сплавов, чем известный штамм того же назначения. При применении предлагаемого штамма повышается достоверность результатов во время испытаний стальных сплавов, используемых в условиях тропиков. Изобретение может представлять интерес при создании стальных сплавов, стойких к воздействию тропических штаммов бактерий. 3 табл.

Изобретение относится к области технической бактериологии и представляет собой новый штамм бактерии, используемый для оценки бактериостойкости сталей, применяемых в тропическом климате, в лабораторных условиях.

Известна группа бактерий Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus coagulans, используемых при лабораторных методах испытаний масел и смазок на устойчивость к воздействию бактерий [1] Недостатком этой группы бактерий является незначительная активность к стальным сплавам, применяемым в условиях тропиков.

Известен штамм бактерии Bacillus subtilis продуцент β- амилазы [2] Недостатком этого штамма является отсутствие его активности по отношению к металлам. Он используется для производства ферментных препаратов b - амилазы в пищевой промышленности.

В качестве прототипа, наиболее близкого к предлагаемому штамму по назначению, является штамм Bacillus subtitlis ВКМВ-1647Д, используемый в качестве тест-культуры для испытания алюминиевых сплавов на бактериостойкость [3] Недостатком этого штамма является незначительно высокая его активность по отношению к сталям, экспортируемым в страны с тропическим климатом.

Цель изобретения получение агрессивного изолята бактерий-деструктора сталей, применяемых в условиях тропического климата, безопасного для здоровья людей.

Для получения штамма Bacillus sp. была исследована микрофлора продуктов коррозии сталей как не защищенных, так и защищенных консервационными смазочными материалами, проходившими натурные испытания 16 месяцев в разных климатических зонах Республики Куба. Из различных 180 образцов сталей, прокорродировавших в результате натурных испытаний в тропиках, были выделены разнообразные бактерии. Причем было отмечено, что видовой состав бактерий, обнаруженных в продуктах коррозии металлов, защищенных консервационными смазочными материалами, идентичен видовому составу бактерий, содержащихся в продуктах коррозии металлов, не защищенных смазочными материалами. Наиболее часто на пораженных коррозией стальных сплавах встречались бактерии рода Bacillus. Наиболее жизнеспособным и агрессивным по отношению к различным маркам сталей типа Ст. 3, Ст. 45, ШХ15 оказался предлагаемый штамм Bacillus sp. который депонирован в коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН под номером ВКМВ-1780Д. Новый штамм Bacillus sp. ВКМВ-1780Д выделен из продуктов коррозии сплава Ст. 3, защищенного составом ВК-4, проходившем испытания 16 месяцев на морской станции Республики Куба.

Характеристика штамма Культуральные признаки. Колонии на агаре Хиттингера слегка желтоватые, плоские, центральная часть приподнята, шероховатые, край неровный. Через 16 18 ч при температуре 37^oC штамм образует колонии диаметром 2-3 мм. Рост по штриху перистый. В жидкой питательной среде образует пленку, слабую муть и тонкий осадок. Хорошо растет на средах МПА и БСА (сусло-агар + МПА в соотношении 1:1).

Морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидной формы, 0,8-0,9 х 3,0-5,0 мкм, подвижные с латеральными жгутиками, грамположительные, образуют термоустойчивые эндоспоры овальной формы с центральным расположением в клетке, спорангий не расширен.

Физиолого-биохимические признаки. По отношению к кислороду аэроб. Оптимальная температура роста 37^oC, пределы роста 10-50^oC. Растет на средах с pH от 5,5 до 9,0, оптимум pH 7,0. Азот утилизирует в виде нитратов, мочевины. Дает положительную реакцию на каталазу и оксидазу. Образует ацетилметилкарбинол и индол. Не расщепляет аргинин, тирозин, эскулин. Не дезаминирует фенилаланин. Отсутствует лецитиназная активность. Гидролизует казеин, желатин, крахмал. Расщепляет с образованием кислоты углеводы: глюкозу, маннит, ксилозу, арабинозу, сахарозу, мальтозу, сорбит, целлобиозу. Не утилизирует лактозу, дульцит, салицин, рамнозу, трегалозу и галактозу. Растет на средах, содержащих 0,001% лизоцима, 0,02% азида натрия, 10% хлорида натрия, а также на среде Сабуро и на синтетической среде М-9. Высокочувствителен к антибиотикам: неомицину, эритромицину. Чувствителен к олеандомицину, ампициллину, канамицину. Малочувствителен к ристомицину, линкомицину, стрептомицину, левомицетину, пенициллину.

При испытании культуры на токсичность и патогенность по методике Госфармакопеи Х штамм не проявляет патогенных или токсигенных свойств.

Хранение штамма. В лиофильно высушенном состоянии в обезжиренном молоке, а также в пробирках с агаром Хоттингера, МПА, БСА, в обводненном масле МК-8 или МС-8РК, в минеральной среде состава, NaNO₃ 0,2-0,35; MgSO₄ 0,35-0,6; KH₂PO₄ 0,07-0,15; KCl 0,15-0,25; вода остальное, с вышеуказанными маслами в соотношении масло среда 2:5.

Примеры практического использования предлагаемого штамма.

Пример 1. Выделение штамма. С пораженных коррозией металлических образцов из стального сплава Ст. 3, защищенного составом ВК-4, проходившим натурные испытания 16 месяцев на морской станции тропического климата Республики Куба, соскабливали стерильным шпателем 0,1 г продуктов коррозии бурого цвета, переносили с соблюдением стерильности в ступку, затем измельчали и переносили в чашку Петри с застывшей средой МПА. Помещенные на поверхность питательной среды продукты коррозии стали тщательно растирали стерильным шпателем по всей поверхности среды сначала в первой чашке, а затем этим же шпателем протирали поверхность среды последовательно во 2-й, 3-й, 4-й и 5-й чашках. Чашки закрывали крышками и инкубировали в термостате при температуре 37^oC в течение 3-5 суток. По истечении времени инкубирования в первой чашке наблюдался рост смеси бактерий, а в последней преимущественно уже изолированные колонии Bacillus sp. из которых небольшое количество спор перевивочной иглой переносили в чашки Петри с застывшей средой МПА и также инкубировали при температуре 37^oC в течение 3-5 суток. Чистую культуру бактерии проверяли на чистоту, переносили в пробирки на скошенную питательную среду МПА, инкубировали, а затем хранили в холодильнике. Полученную чистую культуру бактерии применяли для испытания стальных сплавов на бактериостойкость.

Пример 2. Испытание стальных сплавов на бактериостойкость. Для испытания стальных сплавов на устойчивость к штамму бактерии Bacillus sp. ВКМВ-1780Д вначале подготавливали образцы из Ст. 5, Ст. 45 и ШХ15. При этом нарезали из этих сплавов образцы размером 10 х 20 х 2 мм, шлифовали до класса ▿^0,4 чистоты поверхности. Затем образцы обезжиривали бензином Б-70, протирая мягкой ветошью, смоченной в бензине, по поверхности металлической пластины. Аналогичным образом проводили обезжиривание в ацетоне. После обезжиривания образцы взвешивали на весах Sartoius, заворачивали в крафт-бумагу и стерилизовали 2 ч в сушильном шкафу HS61A при температуре 165^oC. Подготовленные таким образом образцы стальных сплавов подвергали исследованию на бактериостойкость контактным методом, сущность которого заключается в выдерживании образцов из стальных сплавов на поверхности газона Bacillus sp. выросшего на питательной среде БСА (сусло-агар + МПА в соотношении 1:1) в чашках Петри.

На поверхность питательной среды БСА в чашках Петри помещали одну бактериологическую петлю спор бактерии и растирали равномерно шпателем по всей поверхности питательной среды. Затем чашки Петри ставили в термостат при температуре 37^oС. После термостатирования, когда на поверхности среды наблюдался сплошной рост бактериальной культуры, на его поверхность стерильным пинцетом размещали простерилизованные образцы из предварительно подготовленных к испытаниям сплавов Ст. 3, Ст. 45 и ШХ15. Количество испытанных образцов каждого сплава равнялось 5 шт. Контролем служили такие же образцы металлов, но помещенные на поверхность стерильной питательной среды БСА, не засеянной тест-культурой.

Подготовленные к испытаниям чашки Петри с металлическими образцами помещали в эксикатор, на дно которого наливали стерильную дистиллированную воду, за счет чего в эксикаторе поддерживали влажность 96-98% Эксикаторы располагали в термостатной комнате при температуре 40^oC. Продолжительность экспозиции опытных и контрольных образцов 6 месяцев.

Аналогичные испытания проводили со штаммом Bacillus subtilis ВКМВ-1647, который использовали в качестве прототипа.

После окончания испытаний чашки Петри с металлическими образцами подвергали стерилизации 2 ч в автоклаве ВК-75 при давлении 2 атм и температуре 120^o. Затем образцы из стальных сплавов очищали от мицелия, питательной среды и продуктов коррозии с помощью скальпеля. Окончательно продукты коррозии стальных сплавов удаляли в растворе состава: Кислота соляная (пл. 1,19) 500 см³/дм³ Ингибитор ПБ-5 10 г/дм³ Температура 18 25^oC При удалении продуктов коррозии образцы пинцетом в вертикальном положении опускали в раствор, налитый в стакан, и выдерживали 10 мин. Далее образцы вынимали из раствора, промывали сначала в воде, затем в ацетоне, просушивали и взвешивали.

Потерю массы образцов определяли по формуле

где Δm потеря массы испытуемого образца, г, равная
Δm = m_o-m,
где m_о масса образца до испытаний, г;
m масса образца после испытаний и удаления продуктов коррозии, г.

Площадь коррозионных поражений определяли наложением на оцениваемую поверхность металлического образца пластины из прозрачного материала с нанесенной на нее сеткой. По результатам измерения площади коррозионных очагов (количество клеток на пластине) вычисляли процент коррозионного поражения образцов из стальных сплавов по формуле

где S₁ площадь коррозионного очага на лицевой стороне образца, клетки;
S₂ площадь коррозионного очага на оборотной стороне образца, клетки;
S_оцен площадь оцениваемой поверхности всего образца, клетки.

Глубину коррозионных поражений стальных сплавов замеряли с помощью глубиномера-индикатора часового типа со съемной иглой с ценой деления 1/100 мм. Незначительную глубину язв измеряли с помощью профилометра-профилографа Талисерф-10.

Результаты сравнительных испытаний на бактериостойкость образцов из стальных сплавов с использованием в качестве тест-культур штаммов бактерий Bacillus sp. ВКМВ-1780Д и Bacillus subtilis ВКМВ-1647Д представлены в табл. 1-3.

Из представленных в табл. 1 результатов исследований видно, что бактериостойкость сплавов Ст. 3, Ст. 45 и ШХ15 обратно пропорциональна площади пораженной поверхности образцов. Испытания показали, что при использовании в качестве тест-культуры предлагаемого штамма бактерии площадь пораженной поверхности образцов за тот же промежуток времени для всех стальных сплавов возросла в 2 раза после 6 месяцев испытаний по сравнению с прототипом.

При визуальном осмотре во времени было обнаружено, что первые очаги коррозии на стальных сплавах Ст. 3 и Ст. 45 появились на 20 суток, а на сплаве ШХ15 на 15 суток раньше при непосредственном их контакте с предлагаемым штаммом бактерии, чем при непосредственном контакте с бактериальным штаммом, используемым в качестве прототипа.

Из табл. 2 следует, что убыль массы металла из стальных сплавов Ст. 3, Ст. 45 и ШХ15 под действием предлагаемого штамма бактерии в 2 раза превышает убыль массы под действием штамма бактерии, используемого в качестве прототипа. Это свидетельствует о более высокой коррозионной активности штамма Bacillus sp. ВКМВ-1780 по сравнению со штаммом Bacillus subtilis ВКМВ-1647Д.

Из табл. 3 видно, что глубина коррозионных поражений стальных сплавов под действием предлагаемого штамма в 2 раза и более превышает глубину коррозионных поражений образцов по сравнению с известным штаммом-прототипом.

Из представленных результатов экспериментальных исследований видно, что использование предлагаемого штамма бактерии в качестве тест-культуры позволяет повысить достоверность результатов при испытании стальных сплавов, применяемых в условиях тропиков, на бактериостойкость.

Следовательно, штамм Bacillus sp. BKMB-1780Д может быть применен организациями, создающими стальные сплавы, стойкие к воздействию тропических штаммов бактерий, с целью применения этих сплавов в странах с тропическим климатом.

С помощью этого штамма можно проверять стойкость других стальных сплавов к воздействию бактерий при необходимости поставки изделий из стальных сплавов в страны с тропическим климатом.

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus sp. ВКМВ-1780 Д, используемый в качестве тест-культуры для определения биологической стойкости стальных сплавов.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2