Питательный агар для кровяных сред
Использование: микробиология, питательная среда, стрептококк, пневмококк , гемофильная палочка. Сущность изобретения: питательная основа имеет следующее соотношение компонентов, г на 1 л среды: ферментативный гидролизат мясо-костного фарша тюленя 18-204, хлорид натрия 4,,5, дрожжевой экстракт 4,5-5,5;агар-агар 12-13; вода дистиллированная - остальное, ph 7,4i ±0,2. Среда позволит повысить частоту выделения микроорганизмов от больных неспецифическими заболеваниями легг ких. 5 табл.
() С 12 1 1/20, С 12 (} 1/02 (21) 4873638/13 . (22) 27. 07. 90 (46) 30.11.92. Бюл. Р 44 (71) Научно-исследовательская лабораторил биологически активных веществ гидробионтов (72) Н.В.t:îçëîâà, Е.С.Гиршович и Т.С.Спирина (56) The Oxoid lianual of Culture Media, 1902, Blood Agar. Base 2, р, В.
Авторское свидетельство СССР
Г 1402616, кл. С 12 N 1/70, 1986.
Вишнякова Л.А.,и др. - Лаб. дело, 1981, Г 1, с. 38-41.
СОЮЗ С(..}БЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для приготовления кровяного и шоколадного агаров при выделении высокотребовательных микроорганизмов из патологического материала, таких как стрептококки, пневмококки и гемофильные палочки.
Известны сухие питательные основы для кровяного и шоколадного агаров производства зарубежных фирм - В1оой
Agar Base фирмы "Gibco",, Blood Agar
Base Л2 фирмы "Oxoid", специальные основы для выделения гемофильных палочек ("Oxoid", "IIerck"), а также отечественные питательные основы, выпускаемые в жидком виде (Институт эпидемиологии и микробиологии им.Гамалеи AHH СССР).
Однако перечисленные среды сложны по составу, так как содержат как ми.. Ж „1778181 A l (54) ПИТАТЕЛЬНЫЙ АГАР ДЛЯ КРОВЯНЫХ
СРЕД
"{57) Использование: микробиология, питательная среда, стрептококк, пневмококк, гемофильная палочка. Сущность изобретения: питательная основа имеет следующее соотношение кбмпонентов, г на 1 л среды: ферментативный гидролизат мясо-костного фариа тюленя 18-20; хлорид натрия 4,5-5,5; дрожжевой экстракт 4,5-5,5;агар-агар 12-13; вода дистиллированная — остальное, рН 7,4+
+ 0,2. Среда позволи1 повысить частоту выделения микроорганизмов от больных неспецифическими заболеваниями легких. 5 — àáë. нимум два ферментативных белковых гидролизата, например мяса и печени ("ОхоЫ"), мяса и бычьих сердец (ос- д, нова ВНИИП), а также ингредиенты, усложняющие рецегтуру (никотиновая кислота, растворимый крахмал, глюкоза, бактериологический активированный ©© уголь специальной очистки). ,а
Прототипом является среда ВНИИП, О© имеющая следующий состав на 100 мл среды: агар-агар - 1,8-2,0 г, гидролизат по Хоттингеру или гидролизат казеина {180-200 мг. ь аминного азота) — 70-75 мл, гидролизат бычьих сердец (140-160 мг.3 аминного азота)20-25 мл. дефибринированная кровь лошади - 4-5 мл, экстракт пекарских дрожжей - О, 5-0, 7 мл. К недостат кам среды следует отнести наличие в ее составе двух ферментативных гидролизатов, нестандартность исходного сы1778101 рья и, следовательно, нестандартность голучаемых готовых сред более низкая по сравнению с предлагаемой основой, чувствительность среды в отношении выделяемых из патологического материала высокотребовательных микроорганизмов — стрептококков, пневмококков и гемофильных палочек. ! (ель изобретения - упрощение сос тава, повышение чувствительности и дифференциально-диагностических, свойств среды. Поставленная цель достигается тем, что предлагаемый питательный агар для кровяных сред содержит питательную основу, представляющую собой ферментативный гидролизат мясо-костного фарша тюленя, а также хлорид натрия, лрожжевой экстракт, агар-агар при следующих соотношениях О компонентов, r на 1 л среды: ферментативный гидролизат мясо-костного фарша тюленя 18-20
Xnîðèä натрия 4,5-5,5
Дрожжевой экстракт 4,5-5,5
Агар-агар 12-13
Вода дистиллированная Остальное рн 7,4+0,2
Предложение соответствует критериюЗО
"существенные отличия", т.к. не обнаружены технические решения, содержащие признаки, сходные с отличительными признаками предложенного объекта.
С целью выявления оптимального со- gg отношения компонентов при конструировании питательной среды были опробованы различные ее варианты. Оптимальными концентрациями хлорида натрия и дрожн<евого экстракта оказались кон- 40 центрации, принятые в аналогичных -г., прописях. Количество в прописи питательной основы существенно влияло на ростовые свойства тест-штаммов Str.
haer fluenzae. Данные приведены в табл. 1 и 2. Основным критерием оценки качества среды являлась ее чувствительность в отношении -тест-штаммов при посеве методом разведений. Принимая во внимание даннные табл, 1 и 2„можно сказать, что оптимальной концентрацией гидролизата мясо-костного фарша тюленя является концентрация.18-20 г/л среды, обес55 печивающая содержание в среде 80100 мг.4 аминного азота, так как при этих концентрациях достигается максимальная чувствительность в отношении тест-итаммов Str haemolyticus u Str. pneunoniae При повышении концентрации аминного азота от 100 до 130 мг.3 чувствительность среды снижается (табл. 1), однако при дальнейшем повышении концентрации аминного азота (140-180 мг.3) чувствительность среды в отношении тест-штаммов Str.йэепо1уticus u Str.pneumoniae вновь повышается и становится такой же, как при 80-100 мг.3 аминного азота. Оптимальной концентрацией аминного азота в среде при культивировании тест-штамма Н.influenzae является концентрация 80-110 мг.",, что также обеспечивается содержанием 18-20 г основы в литре среды (табл. 2). При этих концентрациях достигается максимальная чувст-. вительность (10 ) плотной среды и вырастает наибольшее количество колоний при посеве 100 микробных клеток (23,6-25). При дальнейшем повышении колицества сухой основы - фермента" тивного гидролизата мясо-костного фарша тюленя, наблюдается снижение чувствительности среды. и уменьшение колицества колоний, вырастающих при посеве 100 микробных клеток. При концентрациях аминного азота 180 200 мг.3 тест-штамм Н.influenzae npu разведениях 10 не дает видимых колоний. При изучении качества предлагаемого питательного агара для кровяных сред по выделению патогенной флоры из мокроты больных неспецифическими заболеваниями легких применяли метод колицественного посева (10 -10 ). Контрольными средами в этих опытах были кровяной и шоколадный агары на гидролизате Хоттингера производства Института эпидемиологии и микробиологии им.Гаиалеи. В качестве селективного агента при выделении гемофильной флоры был использован антибиотик бацитрацин, который добавлялся к готовому шоколадному агару при температуре 50-60 С в количестве 10 мг на 1 литр среды. Идентификацию выросших микроорганизмов проводили по культуральным и морфологическим свойствам, чувствительности к оптохину и лизису желчью для пневмококка. Идентификацию гемофильных палочек, выраставших на селективном шоколадном агаре, осуществляли на основании культуральных, Г 17 норфол: >«и «с к х: б>3>охил>и час ки х свойств (каталазнал, оксидазн 3я, уреаaHa>3, нитpaтредуктазная с>ктивнос! ь ферментация углеводов) . Результаты выделения патогенной флоры от больнь>х представлены в табп. 3 и 4. Как видно из таблиц, предлагаемая среда по сравнению со средой-прототипом является более чувствительной, так как на ней вырастает в большем числе случаев и большее число колоний Str.ðnåumîniàå и Н.influenzae npu посеве этиологически значимых разведений патологического материала. Предлагаемая среда является более простой по составу, Hd ней а большей степени выражены дифференциально-диагностические свойства микроорганизмов. Предлагаемая основа для кровяных сред стандартна, что доказано авт.св. Г 1402616, тогда как в прототипе используется нестандартная среда из мяса сельскохозяйственных животных, Упрощение достигается тем, что вместо двух мясных гидролизатов (мяса и бычьих сердец) используется один гидролизат мясо-костного фарша, Кроме того, предлагаемый агар для кровяных сред более экономичен, так как содержит 80- 100 мг.3 аминного азота вместо испопьзуемых в средепрототипе 180-200 мг.3, что уменьшает себестоимость предлагаемой основь!. Использование предлагаемой основы, вь3сокочувстаитег>ьнай а отношении Str.pneumoniae и Б.influenzae а сре- дах для кровяного и шоколадного агаров позволяет повысить частоту выделения этих микроорганизмов из мокроты больных неспецифическими заболеваниями легких, как это видно,из табл. 5. Предлагаемая основа удобна в хра" нении и транспортировке, так как может выпускаться в сухом виде. П р и и е р 1. Для приготовления 1000 мл питательного агара навеску 18 г ферментативного гидролизата мясо-костного фарша тюленя, 4,5 г дрожжевого экстракта, 4,5 г хлорида натрия и 12 г агар-агара растворяют в небольшом количестве. горячей дистиллированной воды, доводят объем дистиллированной водой до 1 л, кипятят 1-2 мин, не допуская пригорания агара, йильтруют через ватно-марлевый 7818 (3 Ф 1л ьт р ч ) ста > ..> вливают рН 7 э (> c помощью 20"., . рaствс ра едког î иа Tða и разл3>ва>зт а стерильные флаконы г>о 300. 350 >>л стерилизуют аатоклааированием при 121 С в течение 30 л3инут. Для приготовления KpoBAHol или шоколадного агара к охлажденной до 50" С среде добавляют соответственно 5> или 103 цитратной донорской крови, выдерживают при температуре 80 С в течение 5 мин в случае приготовления шоколадного агара, перемешивают и разливают в чашки Петри.. Чувствительность срелы определяют, высевал по 0,1 мл приготовленной суспензии тест-штамл3ов Str.haemelyticus, Stl-.pneuMoniae, Н.lnf1.uenzae из разведений 10 > — 10 8 стандарта мутности щ 10 ед. параллельно на кровяной агар Хоттингера (среду-прототип} и предлагаемую среду. >-!ерез 48 часов инкубации подсчитывают и описывают выросшие колонии, готовят мазки, окрашивают по р5 Граму, а случае пневмококка и гемофильной палочки дополнительно окрашивают по Гинсу, ставят биохимические реакции. На кровяном агаре с преллагаел3ой! основой 3-«- ° 1 е".зо ус3с>>а рос а аиде блестящих "»Зелких (1-1,5 мм в диаметре) полупрозрачных колоний, сохраняя свои тинкториальные свойства и морфологию. Колонии Str .haemoly t icu s на кровяном агаре с предлагаемой осног! аои давали более выраженные и ольшего диаметра зоны гемолиза, ч на среде-прототипе. Str.haemnlat cus, выращенный на питательной среде с предлагаемой основой, сохранял свои @» ферме нтати аные с войс таа; ра сщеплял салицин, сахарозу и лактозу, рос на бульоне с кислым значением рН »t,85, обладал фибринолитической активностью. I .îëîíèè тест-штамма Я «.pneumeniae на кровяном агаре с предлагаемой основой вырастали более крупным > с более выраженными зонами зеленящего лизиса. Тест-штал м Н. inf1иеп ае íà и!околадном агаре с предлагаемой основой рос в виде крупных слизистых колоний с характерным запахом. Размер выраставших колоний. (2-3 мм) был значи55 тельно больше, чем на контрольной среде с гидролизатом Хоттингера (среда-прототип). Пример 2. Для приготовлен>>я 1000 мл питательного кровяного аг"".ра l 778 20 " ферментативногб гидролизата мясо-костного фарша тюленя, 5,5 г дрожжевого экстракта, 5,5 г хлористого натрия и l3 г агар-агара растворяют в небольшом количестве горячей дис5 тиллированной воды, доводят об ьем среды до 1 л дистиллированной водой, кипятят 1-2 мин, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают 1 рН 7,6 с помощью 203 раствора едкого.. натра и разливают в стерильные флаконы по 300-350 мл, стерилизуют авто клавированием при 121 C в течение 30 мин. К охлажденной до 50 С среде добавляют 53 цитратной донорской крови, перемешивают и разливают в чашки Петри. Полученный кровяной агар использовали для посева мокроты больных неспецифическими заболеваниями легких. Как видно из данных, представленных в табл. 3, при количественном засеве патологического материала {0,1 мл из 10 -10 + разведений мокроты), 25 предлагаемая среда является более чувствительной по сравнению со средой-прототипом, так как на íей вырас-, тает на 1-2 порядка больше Str.pneumoniae. ЗО 35 ( формула изобретения Пример 3. Для приготовления. 1000 мл селектипного шоколадного агара 19 г ферментативногб гидролизата мясо-костного фарша тюленя, 5, г дрожже вого экстракта, 5 г хлрристого на трия и 12,4 г агар-агара растворяют в небольшом количестве горячей дистиллированной воды, доводят объем среды до 1 л дистиллированной водой, кипя-. тят 1-2 минуты до полного растворения агара, фильтруют через ватно,",марлевый фильтр, устанавливают рН 7,6 с помощью 20 .; раствора едкого натра и разливают в стерильные флаконы по 300-350 мл, стерилизуют автоклавированием при 121 С в течение 30 мин. V. охлажденной до 60 С среде добавляют 101 цитратной донорской крови, выдерживают при температуре 80 С в течение о 5 мин при постоянном помешиBBHèè охо У лаждают до 60 С, добавляют 10 мг бацитрацина и разливают в чашки Петри, Полученный шоколадный селективный агар использовали для выделения представителей рода ЦаегаорЬх1пя из мокроI Th! бол ь ных неспецифи нес ки ми за Голе ва . ниями легких, Как видно из табл. при количественном засеве патологического материала {0,1 мл 10 - l0 разведений исходной мокроты), предлагаемая среда является более чувствительной по сравнению со средой-прототипом, так как на ней в большем числе случаев и на 1-2 порядка больше вырастает. представителей рода Haemophi— lus.; Как видно из приведенных примеров, предлагаемый питательный агар дпя кровяных сред является более чувствительным и более. простым по составу, обладает улучшенными дифференциальнодиагностическими свойствами и экономически более выгоден, так как содержание аминного азота в среде с использованием преллагаемой основы может быть уменьшено в 2 раза. Для ее приготовления используется непищевое стандартное сырье - отходы зверобойного промысла. Использование предлагаемого пита, тельного агара для кровяных сред позволяет повысить частоту выделения от больных неспецифическими заболеваниями легких с гер1ососспз рпеппюп1ае на 16,233 и Haemophilus 1пйluenzae на 32,353, он более удобен в хранении и транспортировке, так как может выпускаться в сухом виде. Питательный агар для кровяных сред, содержащий белковый гидролизат, хлорид натрия, дрожжевой экстракт, агар-агар и дистиллированную воду, .отличающийся тем, что, с целью упрощения состава и повышения чувствительности и дифференциально- . диагностических свойств среды, из белковых гидролизатов он содержит ферментативный. гидролизат мясокостного фарша тюленя при следующем соотношении компонентов, г/л: ферментативный гидролизат мясокостного фарша тюленя 18-20 Хлорид натрия 4,5-5,5 Дрожжевой экстракт 4,5-5,5 Агар-агар 12-13 Дистиллированная вода Остальное рН средь, -7 2 -У 6 9 Табли ца 1 Чувствительность плотной среды в отношенИИ тест-штаммов Str.hàåmîióticus u Str.pneumoniae в зависимости от содержания аминного азота в среде 1778181 Продолжение табл. 2 10-6 1О 140 17,0 12,6 10,6 ",3 Чувствительность среды в отношении Содержание аминного азота, мг.. 160 Str.haemoly- Str.pneumat ticus niea 180 190 10- 1(Г 10 25 10- 200 100 Табли ца 3 Сравнительные результаты роста Str. pneumoniae на экспериментальной и контрольной средах при посеве мокроты больных неспецифическими заболеваниями легких 110 120 140 количество выросших колоний Анализ 180 на предлагаемой среде на контрольной среде 228 301 Та бли ца 2 Рост тест-штамма H. influenzae 8143 на плотной среде в зависимости от содержания аминного азота 312 326 40 338 353 -- 363 371 373 376 406 422 446 55 450 0-7 1О 60 нет роста нет роста нет роста нет роста нет роста 100 110 120 1 0-6 2,8 4,3 15,0 25,0 24,0 24,0 23,6 21,6 3,0 ° 10 1,2 10 3,5 10 4,6 10 3,0 10 2,4 10 2,4 10 1,О 10 2,0 ° 10 2 5 10 5,0 "10 1,0 10 1,5 10 2,0 10 1,0 ° 10 1 7 10 5,0 10 4,8 10 6,0 ° 10 1,2 ° 10 3,2.10 5,8 10 2,5 ° 10 2,8 10 4,9 10 1778181 1 о Таблица 4 Сравнительные результаты роста представителей рода Ilaemophi1us на экспериментальной и контрольной средах при посеве мокроты больных неспецифическими заболеваниями легких Количество выросших колоний лнализ на предлагаемой среде на контрольной среде 2,0 10 6,0 10 7,0 10 1,0 109 2,0 10 1,0 10 1,0 10 1,5.108 1,0 10 5,6 10 2,1 10 8,0" 108 1,7 10 2,0 10 нет роста 1005 101 I 1017 1090 нет роста 5,0 10т 1112 нет роста нет роста нет роста нет роста 1124 1176 1182 1200 нет роста 1206 2,0 1212 нет роста 10 l 246 1,2 1252 нет роста Табли ца 5 Частота выделения Str.pneumoniae и Н.influevzae из мокроты больных неспецифическими заболеваниями легких на экспериментальной и контрольной средах. 1 I,îëè÷åñòâî выделенных культур Микроорганизм Количество образцов патологического материала предлагаемая среда средапрототип 68 (58, 12 ) 87 (7", 35 ) 20 (29,41 о) 42 (61 76б) Str.pneunoniae Н.influenzae Составитель Н.Козлова 1 едактор Л.Павлова Техред И.Иоргентал Корректор C.!Оско Заказ 4165 Тираж Подписное ВНИИЛИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при Г1<НТ ССС1 113035, 11осква, )K-35, Гаушская наб., д. б/5 Производственно-издательский конон: ат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина, 101
