Ингибитор внутриклеточного образования свободных радикалов

 

Использование: изобретение относится к новому применению, по меньшей мере, одного производного ксантина в качестве ингибитора внутриклеточного образования свободных радикалов, вызывающих повреждение нервных клеток и нарушение их функций. 2 з.п. ф-лы, 2 табл.

Известно, что оксоалкил- и гидроксиалкил-ксантины стимулируют кровоснабжение и могут также использоваться при церебральных нарушениях кровообращения. Так, известно, что 1-(5-оксогексил)-3-метил-7-н-пропил-ксантин (соединение 1), благодаря своему сосудорасширяющемуся действию, пригоден при незначительной токсичности для лечения пациентов, которые страдают от нарушений артериального кровоснабжения.

Известно применение 1-(5-оксогексил)-3-метил-7-н-пропил-ксантина для лечения нарушений памяти.

Черепно-мозговые травмы играют статически важную роль как причины смертей при несчастных случаях, или причины продолжительных повреждений головного мозга.

Диагностически различаются открытые и закрытые черепно-мозговые травмы. Предметом заявки являются закрытые черепно-мозговые травмы. При этом встречаются очаговые (фокальные) поражения (например, контузии или гематомы) и диффузионные повреждения ткани мозга. Последние распространяются из первично травмированной области на другие области мозга и могут вести, в зависимости от локализации и тяжести, к обратимым или постоянным нарушениям (расстройству) функций головного мозга сенсорного, моторного или интеллектуального типа. Часто после черепно-мозговых травм встречается потеря сознания, которая может перейти в коматозное состояние. Первичные повреждения после разрушения ткани в головном мозге являются непоправимыми, однако только в редких случаях они ответственны за смертельный исход. Напротив, основной причиной постоянных помех или смерти являются возникающие и масштаб вторичных повреждений головного мозга, которые являются потенциально обратимыми и поддающимися терапевтическому воздействию. У 90% всех пациентов, скончавшихся от черепно-мозговых травм, доказано наличие вторичных повреждений (поражений).

До сих пор не известно средство, которое давало бы действующую защиту от возникновения вторичных поражений мозга. Клиническое испытание с барбитуратами и кальций-антагонистами не дали успеха. Лечение пациентов с тяжелыми черепно-мозговыми травмами ограничивается поэтому в настоящее время обычными интенсивными медицинскими мероприятиям, как стабилизация сердечного цикла и дыхания и, при известных условиях, контроль внутриклеточного давления посредством мочегонных средств или осмотерапии. Затем позднее используют физиотерапию и логопедические реабилитационные мероприятия.

Тяжесть и размер посттравматического вторичного поражения головного мозга зависит от размера первичной травмы, а также от типа и "своевременности" медицинского обслуживания. Патогенез посттравматического вторичного поражения сложный и ведет, наряду с другим, в конце концов, к сильно повышенному внутричерепному давлению (диффузный отек мозга) и к некрозу чрезвычайно нервных клеток.

Как важный патогенетический фактор для гибели ткани в новейшей литературе дискутируется образование макрофагов, которые освобождают ряд токсичных веществ, прежде всего, свободные кислородные радикалы. Макрофаги образуются в ходе активирования иммунной системы. Они возникают не только из стимулированных, образующих свободные радикалы, клеток крови, но и в головном мозге также из активированных микроглиальных клеток, которые, наряду с протеолетическими энзимами, в особенности большом масштабе производят свободные радикалы (Банати с сотрудниками Jlia, 1991). Так как повышенное образование свободных радикалов очевидно может вести к повреждению функций клеток, и нейротоксическое действие макрофагов обсуждается во взаимосвязи со смертью нервных клеток, соединения, которые тормозят образование свободных радикалов в макрофагах мозга, могут использоваться терапевтически в неврологических клиниках. Активирование микроглиальных клеток и\или появление макрофагов наблюдается в большом числе невропатологических процессов, которые происходят с разрушением ткани мозга (Стрейт с сотрудниками; Jlia, (1988), 301), а также в ходе посттравматического вторичного поражения мозга.

Неожиданно оказалось, что производные ксантина формулы 1 проявляют высокую ингибирующую активность по отношению образования свободных радикалов, а именно, как в периферийных (перитонеальных) макрофагах, так и в культуре активированных микроглиальных клеток головного мозга.

Изобретение касается поэтому применения производных ксантина формулы I и/или их физиологически совместимых солей, где R¹ означает: а) оксоалкил с 3 8 атомами углерода, углеродная цепь которого может быть неразветвленной или разветвленной, б) вторичный или третичный гидроксиалкил с 4 8 атомами углерода, с) алкил с 1 6 атомами углерода, углеродная цепь которого может быть неразветвленной или разветвленной; R² означает: алкил C₁-C₄ R³ означает:
а) водород,
б) алкил, с 1 6 атомами углерода, углеродная цепь которого может быть неразветвленной или разветвленной,
с) алкоксиалкил C₂-C₆,
д) оксоалкил с 3 8 атомами углерода, углеродная цепь которого может быть неразветвленной или разветвленной; в качестве ингибитора внутриклеточного образования свободных радикалов, вызывающих повреждение нервных клеток и нарушение их функций.

Предпочтительно используются производные ксантина формулы 1, в которых
R¹ означает:
а) оксоалкил с 4 6 атомами углерода, или
б) алкил с 3 6 атомами углерода;
R² означает алкил с 1 4 атомами углерода;
R³ означает:
а) алкил с 1 4 атомами углерода, или
б) оксоалкил с 3 6 атомами углерода.

Особенно предпочтительно используется 1-(5-оксогексил)-3-метил-7-н-пропил-кантин. В качестве примера следует назвать следующие соединения формулы 1:
1-(5-гидрокси-5-метил-гексил)-3-метил-ксантин,
7-(этоксиметил-1-(5-гидрокси-5-метил-гексил)-3-метил-ксантин,
1-(5-оксогексил) 3,7-диметилксантин,
7-(2-оксопропил)-1,3-ди-н-бутил-ксантин, или
1-гексил-3,7-диметил-ксантин.

Пригодными физиологически совместимыми солями производных ксантина формулы 1 являются соли щелочных, щелочноземельных металлов и соли аммония, включая соли физиологически совместимых органических аммоний-оснований.

Пример 1.

Фармакологические испытания и результаты.

Для того чтобы измерить внутриклеточное образование свободных кислородных радикалов в перитонеальных макрофагах, а также в культурах активированной микроглии, был выбран проточный цитометрический метод (Rothe, Оser, Valet, Naturwissenschaften, 75, 354, 1988). Специально определялось образование свободных радикалов в отдельных витальных клетках, при этом измерялось внутриклеточное окисление мембрано-проницаемого и не флюоресцирующего дигидрородамина 123 в мембрано-непроницаемый и внутриклеточно "захваченный", зеленый флюоресцирующий родамин 123.

Дигидрородамин растворялся в 43,3 мМ исходного раствора в N,N-диметилформамида (ДМФ; Мерк; Дармштадт, ФРГ). Метод пригоден также для индивидуального и одновременного измерения различных подпопуляций внутри одной гетерогенной клеточной популяции; он позволяет поэтому исключение загрязненных популяций. Исходя из этого, в другой серии опытов гарантировалась идентификация подлежащих измерению типа клеток посредством специфического иммуноцитохимического окрашивания антител непосредственно во время поточного цитометрического измерения. Перитонеальные макрофаги получались посредством перитонеального промывания с 10 мл HBS Hanks (Серва Файнбиохемика, Гейдельберг) мужских особей Вистар-крыс в возрасте 12 недель. Клетки седиментировались при 200 г и 20^oC в течение 5 мин и ресуспендировались в HBS Hanks (4 x 106 клеток/мл). Все клетки после приготовления хранились до цитометрического анализа при 4^oC в течение максимально 2 ч.

Перед началом измерения все клетки (суспензия макрофагов (10 мкл) еще разбавлялась 1 мл HBS Hanks) 5 мин при 37^oC окрашивались с 1 мкл 43,3 мМ раствора дигидрородамина 123 (DHR) в диметилформамиде. Для того чтобы испытать влияние соединения 1 в экспериментальных группах DHR-загруженные клетки инкубировались с 10 мкМ или 500 мкМ предлагаемого по изобретению соединения в течение 15, 25, 35, 45 и 65 мин, а именно, с или без параллельно протекающего стимулирования образования свободных радикалов посредством конканавалина А (Сигма Хеми, Дайзенхофен, сопА, 100 мкМ/мл). К соответствующим контрольным группам активное вещество не добивалось.

Микроглиальные культуры препарировались из головного мозга новорожденных крыс (Jiulian G Baker. F. Neuroscience, 1986, 6:2163 2178). После механической диссоциации ткани в модифицированной среде Далбекко-Иглса (Dulbecco's modifizziertem Eagle's Medium) (Сигма Хеми/, Sigma Chemie, ДМЕМ), дополненные 2 г/л NaHCO₃ и 20% антиактивированной нагреванием эмбриональной сывороткой телят, первичные культуры в течение 2 4 недель выдерживались в 75 см³ сосудах при 3% pCO₂ и 37^oC. Клетки, которые вырастали на поверхности непрерывного слоя клеток, удалялись при помощи встряхивания, гранулировались и ресуспендировались (3 x 106 клеток/мл) в Hepes Hanks буферный солевой раствор (5 мМ Hepks 0,15 М NACl, pH 7,35; Серва Файнбиохемика, Нейдельберг, ФРГ). Для того чтобы испытать активность соединения 1, в экспериментальных группах DHR загруженные клетки инкубировались с 50 мкМ предлагаемого по изобретению соединения в течение 15, 25, 35, 45 и 60 мин, а именно, с или без параллельно протекающего стимулирования образования свободных радикалов посредством конканавалина А (сопА, 100 мкМ/мл). К соответствующим контрольным группам активное вещество не добавлялось.

Клеточный объем и две флюоресценции измерялись одновременно в почти 10000 клетках на "образец" с помощью FACS сапроточного цитометра (Бектон Дикинсон, Сан Хосе, США). Флюоресценция родамина 123-зеленого (500-530 нм) и флюоресценция пропидий иодида-красного (590 700 нм) измерялись при возбуждении при помощи аргонового лазера с длиной волны 488 нм. Цитометр калибровался с помощью сандартизованных желто-зелено-флюоресцирующих "микросфер" диаметром 4,3 мкм (Полисайенс, ФРГ/Polyscience, St. Joor, F.R.J.).

Каждое измеренное значение основывается на измерениях отдельных клеток, содержащихся в одном "образце" (около 10000). Для того чтобы поддерживать экспериментальные граничные условия возможно постоянными, проводились несколько экспериментов друг за другом в один день. В одной такой серии опытов цитометрически измерялись 4 различных "образца" одной экспериментальной группы и их контроль в различные, определенные моменты. Как правило, выполнялись 3 4 серии опытов на одну экспериментальную группу.

А) Действия не перитонеальные макрофаги.

Стимуляция перитонеальных макрофагов посредством конканавалина А (сопА, 100 мкг/мл) ведет к значительному росту образования свободных кислородных радикалов, измеренному как увеличения зеленой флюоресценции после окисления дигидрородамина 123 (ДНР)в родамин 123. Когда измерялись перитонеальные макрофаги в присутствии 50 мкМ соединения 1, стимуляторный эффект сопА был блокирован (таблица 1). Влияние соединения 1 при времени инкубации свыше 15 мин значительно во всех измерениях (p < 0,05 в t тесте). Измеренная флюоресценция сопА-стимулированных перитонеальных макрофагов в присутствии 50 мкМ соединения 1 была даже меньше, чем в контрольных измерениях нестимулированных макрофагов. Супрессивный эффект (подавляющее действие) соединения 1 на образование свободных радикалов зависел от дозы, наиболее значительный эффект достигался при концентрации соединения 1 10 мкМ. При этом измерялось торможения (подавления) 10 мкМ соединения 1 на сопA-стимулированные микрофаги при максимальной сопА-активирующей способности. Он составлял в момент времени 35 мин 21% и был значительным (p < 0,05 в t - тесте).

B) Действие на микроглиальные клетки.

В культивированных микроглиальных клетках образование свободных радикалов (измеренное как флюоресценция родамина) было существенно выше (приблизительно в 50 100 раз), чем в перитонеальных макрофагах. Как описывалось ранее, это обширное образование свободных радикалов в микроглиальных клетках не может быть еще увеличено посредством стимулирования конканавалином А. Инкубирование микроглиальных клеток с 50 мкМ соединения 1 ведет к ярко выраженному (торможению) образования свободных радикалов. После инкубирования в течение 35 мин в 50 мкМ соединения 1 подавление клеточной родамин 123-флюоресценции достигает своего максимума и составляет, приблизительно, треть от контрольного значения без соединения 1 (табл. 2). Влияние соединения 1 при времени инкубации свыше 15 мин определено во всех измерениях (p < 0,05 в t тесте).

Пример 2.

Приготовление 1-(5-оксогексил)-3-метил-7-н-пропилксантина (соединение 1).

437,2 г 3-метил-7-пропилксантина, суспендированные в смеси из 240 г метанола и 321 г воды, при повышенной температуре переводят в раствор с 160 г 50% -го едкого натра, непосредственно после этого при температуре кипения смешиваются с 358 г 1-бром-гексанона-(5) и 4,5 ч нагревают до образования флегмы. После охлаждения непрореагировавший 3-метил-7-пропилксантин отделяют и спирт отгоняют. Водный раствор при помощи едкого натра подщелачивают до pH 11 и экстрагируют метиленхлоридом. Из остатка метиленхлоридного раствора после перекристаллизации из 5,2 диизопропилового эфира получают 1-(5-оксогексил)-3-метил-7-пропилксантин с температурой плавления 69 - 70^oC и с выходом почти 90% (по отношению к непрореагировавшему 3-метил-7-пропилксантину).

Формула изобретения

1. Применение по меньшей мере одного производного ксантина общей формулы

где R¹ оксоалкил с 3 8 атомами углерода, вторичный или третичный гидроксиалкил с 4 8 атомами углерода, алкил с 1 6 атомами углерода;
R² алкил с 1 4 атомами углерода;
R³ водород, алкил с 1 6 атомами углерода, алкоксиалкил с 2 6 атомами углерода, оксоалкил с 3 8 атомами углерода,
и/или по меньшей мере одной из его физиологических совместимых солей в качестве ингибитора внутриклеточного образования свободных радикалов, вызывающих повреждение нервных клеток и нарушение их функций.

2. Применение производного ксатина общей формулы по п.1, где R¹ - оксоалкил с 4 6 атомами углерода, алкил с 3 6 атомами углерода; R² алкил с 1 4 атомами углерода; R³ алкил с 1 4 атомами углерода, оксоалкил с 3 6 атомами углерода.

3. Применение по п. 1 в качестве производного ксантина 1-(5-оксогексил)-3-метил-7-н-пропил-ксантина.

РИСУНКИ

Рисунок 1

PD4A - Изменение наименования обладателя патента Российской Федерации на изобретение

(73) Новое наименование патентообладателя:
Санофи-Авентис Дойчланд ГмбХ (DE)

Извещение опубликовано: 27.12.2005        БИ: 36/2005

---