Синтетическая среда для разбавления и замораживания спермы баранов

 

Использование: искусственное осеменение овец. Сущность изобретения: с целью повышения устойчивости сперматозоидов барана к замораживанию и оплодотворяемости овцематок при осеменении криокнсервированной спермой в состав среды введен новый антиоксидантбромид-NN-диметил-N-децил-4-окси-3,5-ди-трет-бутил -бензил-амина, а также ксилит, 2 табл.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности, к искусственному осеменению сельскохозяйственных животных, например, овец.

Известны среды для разбавления и замораживания спермы баранов, включающие дисахара, желток куриного яйца, глицерин, буферные компоненты, ксилит и различные полисахариды.

Однако, известны среды обладают недостаточными криопротективными свойствами на сперматозоиды в связи с тем, что не содержат веществ, препятствующих процессу перекисного окисления липидов при глубоком замораживании спермы [1] Целью изобретения является уменьшение себестоимости синтетической среды для глубокого замораживания спермы баранов без снижения ее криопротективных свойств.

Поставленная цель достигается тем, что среда, включающая дисахарид, трис-(оксиметил)-аминометан, двунатриевую двуводную соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, желток куриного яйца, глицерин, декстрин и воду, дополнительно содержит ксилит и бромид N, N -диметил-N- децил- 4 окси-3,5-ди-трет-бутил-бензил-амина, при следующем соотношении компонентов (мас.): дисахарид (лактоза или сахароза) 5,0-8,0 ксилит 1,0-0,3 трис-(оксиметил) аминометан 0,065-0,13 двунатриевая двуводная соль этил-диаминтетрауксусной кислоты 0,08-0,16 декстрин 3,5-7,0 желток куриного яйца 12,0-15,0 глицерин 3,5-6,0 бромид-N, N-диметил-N-децил-4 окси-3,5-ди-трет-бутил-бензил-амина - 0,002-0,008
вода дистиллированная остальное.

Это новый препарат, синтезированный в инструменте хим. физики д.х.н. Никифоровым Г.А. Его структурная формула:

Указанная четверичная соль синтезируется в одну стадию из доступного промышленного продукта -П, П-диметил-4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутил-бензил-амина согласно следующей схемы:

При взаимодействии N,N-диметил-4-гидрокси-3,5-ди-тетра-бутил -бензинбромида с H-децилброванным в среде ацетона при температуре 25^oC образуется необходимая четвертичная соль с выходом до 65% Структура полученной соли подтверждена данными спектроскопии.

В составе синтетических сред для спермы животных данных препарат ранее не применялся.

Он является фенольным жирорастворимым антиоксидантом и способен быстро встраиваться в плазматическую мембрану, изменяя ее конформационное состояние путем снижения микровязкости мембраны. Обладая мощным антиоксидантным действием, данный препарат позволил, как показали наши опыты, повысить сохранность сперматозоидов во время замораживания, увеличить продолжительность их живучести, а также оплодотворяющую способность оттаянной спермы.

При введении нового антиоксидента в состав криоконсервированной среды оптимальной его дозой является 0,004% препарата.

Допустимые граничные значения концентрации компонентов в заявленной среде приведены в табл. 1.

Если содержание ингредиентов выходит за границу крайних нижних или верхних значений предлагаемой среды, то это дает худшие результаты и не приводит к достижению поставленной цели, (табл. 2).

Пример приготовления среды. На чистую химическую колбу вносят по рецепту лактозу, ксилит, трис-(оксиметил)-аминометан, двунатриевую дву-водную соль этилендиамин-тетрауксусной кислоты, декстрин, заливают прокипяченной дистеллированной водой (80-90^oC). Колбу помещают в кипящую водяную баню до полного растворения всех компонентов. Раствор охлаждают до 40^oC и вносят туда желток куриного яйца, глицерин и бромид-N,N-диметил-N-децил-4 окси-3,5-ди-трет-бутил-бензил-амина, который предварительно растворяют в 0,2 мл спирта.

Свежеприготовленная среда перед разбавлением спермы должна быть исследована по внешнему виду, цвету, запаху и периодически по показателю PH и осмотическому давлению. Предлагаемая синтетическая среда по физико-химическим свойствам должна отвечать следующим требованиям: внешний вид однородная эмульсия без осадка и механических примесей, цвет от темно-желтого до светло-коричневого, без запаха, PH 6,8±0,1, осмотическое давление (без глицерина) 6,0-10,0.

Приготовленную среду используют для разбавления спермы в течении 5-6 ч. Хранят при температуре 4-18^oC. Перед употреблением нагревают до 30-35^oC. При использовании среды к одному объему спермы добавляют 3 или 4 объема среды в зависимости от концентрации сперматозоидов.

Оптимальный (второй) состав предлагаемой среды (маc. Лактоза 5,8; ксилит 0,18: трис-(оксиметил) -аминометан-0,1; двунатриевая двухводная соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,13; декстрин -5,5; желток куриного яйца 14,0% глицерин 5,2; бромид-N,N, диметил-N-децил-4 окси-3,5-ди-трет-бутил-бензиламина 0,004; вода дисталлированная до 100, имеет более высокие криозащитные свойства в сравнении с другими вариантами и сходные с показателями прототипа. Подвижность сперматозоидов в ней после оттаивания составляет 4,5±0,09 баллов и абсолютный показатель выживаемости 18,8±0,83 усл.ед. что практически идентично с таковыми в среде с применением бромид-N,N-диметил-N-гексадецил-4 окси-3,5-ди-трет-бутил-бензил-амина (прототипа) 4,5±0,04 и 17,5±0,069 соответственно.

Указанный оптимальный состав среды испытан комиссией в производственных условиях на оплодотворящую способность спермы баранов, замороженной в данной среде при двухкратном осеменении овец в течение эструса в Республике Хакассия.

Результаты испытаний показали, что предложенная среда обладает высокими криозащитными свойствами, а исходные компоненты для синтеза нового антиоксиданта дешевы и менее дефицитны.

Кроме того, биологическая активность нового антиоксиданта позволяет в 1,5-2,0 раза уменьшить потребную дозу препарата без снижения криопротективных свойств.

Формула изобретения

Синтетическая среда для разбавления и замораживания спермы баранов, содержащая лактозу, декстрин, трис-(оксиметил)-аминометан, двунатриевую двухводную соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, глицерин, желток куриного яйца и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что дополнительно содержит ксилит и бромид-N, N-диметил-N-децил-4- окси-3,5-ди-трет-бутил-бензиламина при следующем соотношении ингредиентов, мас.

Лактоза 5,0 8,0
Декстрин 3,5 7,0
Трис-(оксиметил)-аминометан 0,065 0,13
Двунатриевая двухводная соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,08 - 0,16
Глицерин 3,5 6,0
Желток куриного яйца 12,0 15,0
Ксилит 0,1- 0,3
Бромид-N, N-диметил-N-децил-4-окси-3,5-ди-трет-бутил-бензиламина 0,002 - 0,008
Вода дистиллированная Остальноев

РИСУНКИ

Рисунок 1