Способ получения консервированного, содержащего протеин человека, лекарственного средства для инъекционного или инфузионного введения

 

Изобретение относится к медицине, в частности к области получения консервированных лекарств. Изобретение касается способа получения хорошо переносимых, консервированных инъекционных или инфузионных растворов, содержащих человеческий протеин. 2 с.п. и 9 з.п. ф-лы, 4 табл.

Изобретение относится к способам получения консервированных лекарственных средств, содержащих протеин человека, для применения в качестве инфузионных инъекционных растворов и растворов для внутривенного вливания в хорошо переносимой форме.

Протеины человека в смысле изобретения это аутогенные, встречающиеся лишь в небольших количествах протеины, используемые для терапевтических целей, как, например, t-PA (tissul plasminogen activator), G-CSF, (granulocyte colony stimulating factor), стрептокиназа, урокиназа, интерферон или ЕРО (эритропойетин), или их рекомбинантно получаемые производные, которые обладают в основном аналогичными или сопоставимыми фармакологическими свойствами.

В Европейской патентной заявке EP N 0.430.200 описаны содержащие протеины человека лекарственные средства для подкожного или внутримышечного применения, которые в результате добавки аминокислот показывают лучшую возможность биологического использования и лучшую переносимость по сравнению с известными формами введения.

Стабилизированные лекарственные средства, содержащие протеины человека, которые, среди прочего, содержат мочевину и различные аминокислоты, известны из Европейского патента EP 0.306.824, причем там в качестве человеческих протеинов названы например, в частности EPO и G CSF. Кроме того в EP N 0.456.153 описаны галеновые водные приготовления EPO для получения инъекционных препаратов для подкожного или внутримышечного применения, имеющие величину pH в пределах 6 8, и содержащие для стабилизации исключительно фосфат щелочного металла или галогенид щелочного металла.

Ген-технологическое получение вышеназванных человеческих протеинов известно, например, из следующих патентных заявок: в PCT заявках WO 85/02610 и WO 86/03520 описаны способы для ген-технологического производства rh EPO (рекомбинантный человеческий эритропойетин). Далее описано получение полипептидов, обладающих действием, подобным эритропойетину, в EP 0.409.113, EP 0.357.804, WO 86/02100 и WO 91/05867. Из уровня техники известны далее способы получения других рекомбинантных протеинов, например, полипептидов с действием, аналогичным плазминоген-активатору, из WO 90/09437, EP 0.227.462, EP 0.400.545 или EP 0.440.763. Получение полипептидов с действием, подобным G CSF, известно, например, из EP 91 107 429.2 или PCT/EP 91/00192.

EPO это гликопротеин, стимулирующий образование гемоглобина или эритроцитов в костном мозге. Этот липопротеин образуется главным образом в почке, находится в очень небольшом количестве в сыворотке (крови), и при физиологических условиях осаждается в моче.

Было, правда, установлено, что содержащие человеческие протеины инъекционные растворы или растворы для внутривенного введения различных изготовителей в результате различных составов в галеновом приготовлении или вследствие незначительных структурных отличий биологически активных веществ относительно последовательности аминокислот или образца гликозилирования протеина переносились по-разному. Хотя известные из уровня техники растворы были в основном изотоническими растворами, которые, собственно, без больших проблем должны были хорошо переноситься, при их применении были отмечены неприятные побочные действия. При введении, например, инъекционных растворов, содержащих EPO, пациенты часто жаловались на боли в месте укола, которые появлялись во время и после введения. В зависимости от соответственно применяемого галенового состава у многих пациентов часто появлялись жгучие боли, если вводили, в частности, такие инъекционные растворы, которые для стабилизации содержали как добавку сывороточный альбумин человека и цитратный буфер. В некоторых случаях у пациентов появлялась слишком высокая температура, высокое кровяное давление, крапивница, боли в спине, тошнота или также шок.

Далее оказалось, что инъекционные растворы с относительно небольшим содержанием биологически активного вещества не могут быть достаточно хорошо стабилизированы. Так, например, составы лекарственных средств, которые как человеческий протеин содержали EPO в количестве, например, 500 20.000 U, были недостаточно стабильны. Можно было обнаружить, что некоторые галеновые составы благоприятствуют нежелательному образованию агрегации или агломераций человеческих протеинов, особенно при продолжительном хранении. В результате этого при применении подобных препаратов могут иметь место иммунологические проблемы.

Известные до сих пор из уровня техники препараты лекарственных средств, содержащие человеческие протеины, это составы, которые, как правило, не содержат консервантов, поскольку они используются обычно для одноразового приема в виде так называемого приготовления с однократной дозировкой или емкостей с однократной дозировкой. Так называемые единицы (измерения) с многократной дозировкой или емкости с многоразовой дозировкой, например, пригодны для многократного введения в любых частичных количествах биологически активного вещества. В результате этого предъявляются особые требования к стабильности и к стойкости при хранении подобных форм введения, особенно относительно стерильности растворов. По этой причине такие растворы снабжаются консервантами, с тем, чтобы предотвратить рост инфекционного начала в приготовленном готовом к употреблению, инъекцинном растворе или в растворе для внутреннего введения.

Приготовление консервированных препаратов лекарственных средств, содержащих человеческие протеины, оказалось, однако, трудным. При введении консервантов выяснилось, что эти проблемы стабильности вызываются при продолжительном хранении лекарственных средств. При этом происходит дезактивация человеческих протеинов и образование агломератов, которые могут быть причиной для наблюдаемых непереносимостей инъекционных растворов. Остальные способы получения консервированных рецептур для инфузионных или инъекционных целей нельзя применять в случае биологически активных вещество человеческих протеинов, поскольку в условиях стерилизации в автоклаве при 121^oC в течение 20 мин биологически активные вещества дезактивируются и разрушаются в своей структуре. Известно также, что обычные, применяемые в фармации консерванты, реагируют с биологически активными веществами человеческих протеинов, и при этом они дезактивируются. По этой причине до сих пор внутривенные (i. v.) или подкожные (s. c.) препарации приготовляют как составы с однократной дозировкой при асептических условиях, не применяя при этом консерванты.

Была поставлена задача найти способ получения консервированных лекарственных средств, содержащих человеческие протеины для инъекционных и инфузионных целей, с помощью которых можно изготавливать такие лекарственные средства, которые не имели бы вышеназванных недостатков. Полученные таким образом лекарственные средства должны быть воспроизводимы с хорошей переносимостью, при использовании, обеспечивать максимально безболезненное применение, и должны быть стерильными. Кроме того, должны быть предоставлены в распоряжение формы введения с многократной дозировкой (емкости с многократной дозировкой), которые являются стерильными, и которые могут применяться с хорошей переносимостью. Эта задача была решена тем, что при изготовлении лекарственных средств, содержащих человеческие протеины, для инъекционных или инфузионных целей добавляют консерванты в концентрации в пределах 2% (вес. об. G/V), в частноси от 0,01 1% и/или 0,1 0,3% и при определенных обстоятельствах перед получением стойкого при хранении состава лекарственных средств консерванты снова удаляют. Благодаря выбору таких консервантов, которые обладают очень небольшой скоростью аллергии, представляется далее возможным оставлять подобные консерванты также и в стойком при хранении составе лекарственных средств, так что селективное удаление не является безусловно необходимым.

Полученные таким образом лекарственные средства консервированы, т.е. они содержат консерванты, или во время их изготовления присутствовал по меньшей мере, эпизодически, один консервант. Для консервации пригодны все вещества, имеющие бактерицидные действия. Применяемые консерванты тормозят рост попадающих при расфасовке в препарат микроорганизмов или умерщвляют их.

В предложенном способе особенно выгодным представляется тот факт, если используются такие консерванты, которые без труда могут быть удалены в одном из последних технологических этапов способа изготовления стойкого при хранении состава лекарственного средства. Это имеет то преимущество, что применяемые лекарственные средства не содержат тогда консервантов, оказывающих какое-либо влияние на переносимость. К летучим консервантам, которые при этом являются особенно благоприятными, относятся хлоретон (хлорбутанол, 1,1,2-трихлор-2-метил-2-пропанол), бензиловый спирт.

После того как было установлено, что различные консерванты при одинаковом консервирующем воздействии имеют различную скорость аллергии, переносимость можно улучшить в результате правильного выбора средства. Консерванты с небольшой скоростью аллергии это в частности хлорбутанол, бензиловый спирт и бензалконийхлорид. Бензалконийхлорид есть в смеси из четвертичных аммониевых соединений (кватс) типа алкилбензил-диметиламмоний хлориды общей формулы (H₅C₆-CH₂-N⁺ /CH₃/₂R)Cl, причем R - это алкильный остаток C₈H₁₇C₁₈H₃₇, например, бензододецинийхлорид или кетальконийхлорид (сравни Кирк-Отмер 2: 633 и след. с. 19: 562 и след. с.).

Эти консерванты имеют далее то преимущество, что они не инактивируют содержащиеся в растворе человеческие протеины. Переносимость также улучшается в результате максимально небольшой концентрации консерванта. В частности, содержание отдельного консерванта в растворе лекарственного средства не должно превышать величины 10 мг/мл. Предпочтительно используются до 5 мг/мл консерванта в растворе лекарственного средства.

Необходимую концентрацию можно свести до минимума в результате осуществления различных мер. Например, в результате того, что инактивация человеческого протеина может быть максимально предотвращена благодаря консерванту. Это имеет еще одно преимущество, что стабильность инъекционного раствора повышается. Инактивацию можно затормозить тем, что консервант выбирают принимая во внимание его незначительную реактивность. Инактивация дополнительно подавляется, если контакт между человеческим протеином и консервантом является максимально кратковременным. Необходимую концентрацию консерванта в растворе также можно уменьшить в результате того, что исключается его абсорбция на материалах, как, например, на резине, с которыми контактирует раствор.

Для переносимости значительную роль играет тип применяемых консервантов. Все консерванты имеют более или менее большую степень аллергии. Для того, чтобы обеспечить стерильность, не всегда однако следует избегать их использование. Согласно исследованиям, положенным в основу, изобретения, представляется возможным использовать консерванты при изготовлении иъекционных растворов таким образом, чтобы гарантировались как значительная стерильность, так и исключение побочных влияний консервантов почти в полной мере.

Во многих случаях, несмотря на тот факт, что добавленные консерванты реагируют более или менее с человеческими протеинами и при этом инактивируют их, нельзя полностью отказаться от добавки консерванта, потому что микроорганизмы при заполнении могут проникнуть в раствор, или потому что при приготовлении из стерильного лиофилизата емкостей для многократной дозировки готовят инъекционный раствор, который должен быть законсервирован вплоть до полного израсходования.

Непроблематичным представляется добавка консерванта при изготовлении препарата, если консервант выбирают таким образом, чтобы он при лиофилизации испарялся или возгонялся. Консерванты, обладающие соответствующей летучестью, это, например, хлоретон, бензиловый спирт.

Поскольку консерванты, обычно применяемые в фармации, вступают в реакцию с человеческими протеинами и инактивируют их, то препарации для внутривенных и подкожных применений изготавливают как составы с однократной дозировкой при асептических условиях, причем без применения консервантов. Не всегда однако следует избегать того, чтобы при заполнении некоторые микроорганизмы попадали в препарат, причиняя вред, если они в своем росте не будут подавлены или умерщвлены в результате использования консерванта.

Пригодные концентрации находятся в пределах между около 0,1 и 2,0, преимущественно между 0,1 и 0,3. Точная концентрация зависит от концентрации действующего вещества, и время от времени определяется по способу, известному специалисту.

Необходимо, чтобы рецептуры в сосудах с многоразовой дозировкой для внутривенного и подкожного применения в достаточной степени подвергались консервации, т. е. что еще в последний день указанного срока годности консервирующее действие должно иметься в полном объеме. С тем, чтобы удовлетворить этому требованию, содержащий человеческий протеин раствор в инъекционной форме должен содержать консервант. Это затрагивает определенные проблемы, потому что см. выше консерванты вступают в реакцию с человеческими протеинами и могут вызвать у пациента сенсибилизацию. Такая реакция с действующим веществом приводит, с одной стороны, к уменьшению активности действующего вещества, а с другой стороны, к снижению консервирующего действия, которое в результате этого еще более уменьшается, так что это может привести к абсорбции консерванта на резиновых пробках.

В соответствии с изобретением, эти трудности разрешаются тем, что используется такой консервант, который в меньшей степени реагирует с человеческими протеинами и оказывает меньшее сенсибилизирующее действие, так что следует стремиться по возможности к более кратковременному контакту между человеческим протеином и консервантом, и к исключению тех факторов, которые вносят для потребления консерванта.

К мало реактивным и сенсибилизирующим консервантам относят хлорбутан, бензиловый спирт, бензалконийхлорид и комбинации этих веществ. При использовании отдельных из названных консервантов применяют следующие концентрации: хлорбутанол: 2,0 5,0 мг/мл, предпочтительно: 3,0 4,0 мг/мл. Бензиловый спирт: 1,0 5,0 мг/мл, предпочтительно 2,0 3,0 мг/мл. Бензалконийхлорид: 0,01 0,05 мг/мл, предпочтительно: 0,02 0,03 мг/мл.

Оказалось, что особенно выгодно использовать комбинации отдельных консервантов. Благодаря этому достигается лучший эффект консервации и сводятся до минимума неблагоприятные взаимодействия с человеческими протеинами. При использовании одного единственного консерванта в некоторых случаях, в зависимости от применяемого человеческого протеина, не может быть обеспечена необходимая стабильность препаратов. Использование бензалконийхлорида в оптимально консервирующих концентрационных количествах может привести, например, к инактивации человеческого протеина. Применение хлорбутанола в концентрации, еще не приводящей к агрегации человеческого протеина при температуре, обычной для холодильника, не может способствовать при известных обстоятельствах достаточной консервации. Использование бензилового спирта в количестве, необходимом для консервации, может привести к физическим непереносимостям и к помутнениям раствора лекарственных средств. В результате комбинации отдельных консервантов эти недостатки можно избежать. Предпочтительные комбинации это растворы, которые содержат, в частности, бензиловый спирт (бензалконийхлорид, бензиловый спирт) хлорбутанол или хлорбутанол (бензиловый спирт) бензалконийхлорид. При этом хлорбутанол используется преимущественно до концентрации 10 мг/мл, бензиловый спирт до концентрации 10 мг/мл и бензалконийхлорид до 0,1 мг/мл, в частности 0,01 - 0,05 мг/мл. Особенно выгодным представляется комбинированное применение бензилового спирта и бензалконийхлорида, при этом концентрация бензилового спирта в растворе лекарственных средств составляет преимущественно 3 6 мг/мл, а концентрация бензалконийхлорида составляет 0,01 0,025 мг/мл.

Применение менее реактивного и менее сенсибилизирующего консерванта и кратковременный контакт уже способствуют снижению необходимого количества консерванта, потому что благодаря этому сводится до минимума расщепление консерванта при инактивации человеческого протеина.

Минимальный кратковременный контакт обеспечивается в результате того, что рецептура в виде лиофилизата или в концентрированном виде в данном случае, после того как при лиофилизации (см. выше) был удален консервант хранится в стерильных условиях, и только лишь при изготовлении инъекционной формы добавляется консервант, причем этот инъекционный раствор должен быть израсходован в течение 30 дн.

Если выбирают лиофилизат, то фармацевтическая упаковочная единица может дополнительно содержать растворители, необходимые для реконституции. Эти (растворители), как правило, рассчитаны на соответствующий лиофилизат таким образом, что при смешивании получают готовые для шприца растворы с предложенными свойствами. Этот лиофилизат уже может содержать частично или полностью необходимые количества консервантов, так что реконституция осуществляется в основном с помощью дистиллированной воды для инъекционных целей. С другой стороны, в принципе возможно, что реконституционный раствор содержит необходимое количество консервантов, с тем чтобы изготовить консервированные, готовые для впрыскивания растворы лекарственных средств. В случае препаратов с многократной дозировкой это является предпочтительным вариантом.

Осуществление предложенного способа заключается в том, что человеческие протеины растворяют в воде с необходимыми вспомогательными веществами, добавляют необходимые количества консервантов (вплоть до максимально 6%) и, в случае необходимости, подогревают до температуры, которая способствует вытеснению данного человеческого протеина с его стабильностью, не инактивируя его при этом. Консервант оставляют для воздействия в течение продолжительного времени, до тех пор, пока раствор не будет стерильным, т.е. примерно в течение четырех часов, преимущественно от 10 мин до двух ч. После этого раствор действующего вещества заполняют в бутылки и подвергают лиофилизации. При этом консервант, как правило, во время лиофилизации возгоняется или испаряется. Полученные таким образом лиофилизаторы после реконституции с обычными растворителями позволяют получить стерильный раствор для инфузионных или инъекционных целей. На хорошую переносимость инъекционного раствора, содержащего человеческие протеины, кроме того, оказывает влияние правильный выбор pH-величины, буферной емкости, титруемой кислотности и буферных веществ, содержащихся в растворе.

Верхнее значение pH раствора не должно находиться значительно выше нейтральной точки (значение pH крови расположено между 7,2 и 7,4), потому что человеческие протеины в спиртовой сфере не являются стабильными. Для внутривенного введения растворы имеют величину pH преимущественно в пределах от 4,5 до 7,4. Для подкожного введения предпочтение отдается растворам с величиной pH приблизительно 6 7,4. Внутривенное и подкожное применение отличается друг от друга, так как в результате внутривенного притекания крови и содержащихся в крови буферов возможна более быстрая ассимиляция к физиологическим pH-условиям, чем это может произойти при подкожном введении. Поскольку скорость ассимиляции при подкожном и внутривенном применении можно улучшить еще также в результате максимально низкой буферной емкости и по возможности более низкой титруемой кислотности, то приемлемое минимальное значение pH-величины раствора также зависит еще от этих параметров. Буферная емкость готового к применению раствора находится при этом в диапазоне от 0 - 10 м /Val/л, а титруемая кислотность в диапазоне 0 20 м /Val/л. В частности, буферная емкость готового к применению раствора должна составлять не более чем 6 м/Val/л, а титруемая кислотность не более чем 10 м/Val/л.

Буферная емкость определяется обычно как такое эквивалентное количество (Val) кислоты или щелочи, которое необходимо для того, чтобы pH-величину раствора с объемом один литр изменить на одну pH-единицу. Если для титрования применяют одноосновные кислоты или основания, то данные Val/л применяемой кислоты или основания соответствуют молярному количеству моль/л этой кислоты. Поскольку в данном случае применяемые растворы имеют pH-величину в кислотном диапазоне, то альтернативно буферная емкость может быть определена как такое количество, например, 0,1 н. NaOH-раствора, которое требуется для того, чтобы поднять pH-величину раствора с одного литра на одну pH-единицу. Содержащие человеческий протеин растворы лекарственных средств при определении буферной емкости содержат фармацевтические вспомогательные вещества или вещества-носители.

Определение буферной емкости лекарственных средств, содержащих человеческие протеины, осуществляется, исходя из готового к применению инъекционного или инфузионного растворов, которые наряду с биологически активным веществом содержат вспомогательные вещества или добавки, обычные в фармакологической практике. Как правило, такие растворы имеют кислую pH-величину для стабилизации протеина. В результате титрования посредством оснований определяется соответствующее количество основания, которое необходимо, с тем чтобы величину pH раствора повысить на одну pH-единицу.

Предпочтительные границы для буферной емкости в инфузионном или инъекционном растворе это для внутривенной дозы до 2,4 мл 0,1 н. натрового щелока, предпочтительно до 0,5 мл. Это соответствует количеству щелочи 0,24 ммоль или 0,05 ммоль. Для подкожного введения применяют предпочтительно до 2 мл 0,1 н. NaOH-раствора, в частности до 0,2 мл 0,1 н. NaOH-раствора. Это соответствует количеству щелочи в пределах до 0,1 ммоль или до 0,02 ммоль.

Далее оказалось, что представляется выгодным, если готовые к применению инъекционные или инфузионные растворы имеют по возможности небольшую титруемую кислотность до 5 м Val/л.

Предпочтительные границы для титруемой кислотности инфузионных и инъекционных растворов это для внутривенного применения до 10 мл, предпочтительно до 5 мл, 3 мл или 1 мл 0,1 н. NaOH-раствора. Это соответствует титруемой кислотности до 1 ммоль/л, или до 0,3 ммоль/л, или 0,1 ммоль/л. Для подкожного применения предпочтение отдается количествам до 5 мл, особенно до 2 мл или до 0,5 мл 0,1 н. NaOH-раствора. Титруемая кислотность составляет в этом случае до 0,05 ммоль/л, или до 0,2 ммоль/л, или 0,05 ммоль/л.

Титруемая кислотность или титруемая основность определяется обычно как такое количество щелочи или кислоты, которое требуется для того, чтобы pH-величину раствора с объемом 1 л установить до pH-величины крови (около 7,2 7,4). В данном случае титруемая кислотность альтернативно может определяться также как такое количество, например, 0,1 н. NaOH-раствора, которое необходимо, с тем чтобы pH-величины крови (приблизительно 7,3). Содержащие человеческие протеины растворы лекарственных средств при определении буферной емкости содержат обычные фармацевтические вспомогательные вещества или добавки. Способ определения титруемой кислотности осуществляется аналогичным образом, как и определение буферной емкости, в результате того, что исходят из готового к применению инъекционного или инфузионного раствора, и определяют то количество основания, которое требуется, с тем чтобы установить величину pH раствора около 7.

Используемый pH-диапазон для достаточно безболезненно применяемого инфузионного или инъекционного раствора находится в зависимости от соответственно применяемого человеческого протеина в кислом или нейтральном диапазоне. Инфузионные или инъекционные растворы имеют pH-величину в диапазоне примерно от 2 до 7,4. Предпочтительно применяются растворы с величиной pH примерно 3,8 7,4, при этом как нижний предел рассматриваются в частности pH-величины 4,5 6,0, предпочтительно 5,5 6,0. Как верхний предел pH-диапазона применяются преимущественно pH-величины растворов, которые находятся вблизи pH-величины крови. Для внутривенных применений используют предпочтительно растворы с pH-величиной в пределах 6 7,4, в частности 6,8 - 7,2. Для подкожных применений используют преимущественно растворы с pH-величиной от 6,5 до 7,2, в частности 7,0 7,2.

Помимо встречающейся в природе формы человеческих протеинов можно применять также и соответствующие мутеины "Muteine". Под понятием мутеины, как правило, имеют в виду такие человеческие протеины, аминокислотная последовательность которых отличается по меньшей мере одной аминокислотой от естественной последовательности. Эти отличия могут состоять в том, что одна или несколько, преимущественно 1 10 аминокислот в естественной последовательности заменяют другими аминокислотами, или то одну или несколько аминокислот добавляют к N- или C-предельному концу, или также удаляют. В таком случае говорят о N- или C-предельных удлинениях или N- или C-предельных делециях. Вышеназванные возможности можно при необходимости также комбинировать друг с другом, т.е. N-предельный конец естественной последовательности может быть, например, удлинен при одновременном укорачивании C-предельного конца, при этом в данном случае одновременно одна или несколько аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами. Принимая во внимание соответствующие направления индикации, полученные таким образом фрагменты в основном должны обладать одинаковыми основополагающими терапевтическими свойствами и (воз)действиями, как и естественные человеческие протеины.

Обычно понятие "рекомбинантный" относится к таким человеческим протеинам, которые получают с помощью рекомбинантной DNA технологии. Эти способы включают клонирование гена, который для соответствующего человеческого протеина кодирует место прикрепления соответствующих с DNA или геномических DNA в соответствующий вектор, как, например, в бактериальные плазмиды, и трансформацию этих рекомбинантных плазмид в соответствующие клетки хозяина (паразита). Клонированный ген затем экспримирует в клетке хозяина (паразита), и человеческий протеин изолируется, собственно, известным способом.

Жидкие или также лиофилизированные лекарственные средства содержат при необходимости обычные фармацевтические вспомогательные вещества, как, например, стабилизаторы или органические гидрофильные полимеры. Как стабилизаторы пригодными, например, являются олигосахариды, как, например, сукроза, тетралоза, лактоза, декстраны с молекулярным весом примерно от 10.000 до 2.000.000. Органические гидрофильные полимеры это макромолекулы с углеродной основной структурой, которая состоит из гидрофильных мономерных единиц, в данном случае, с полярными боковыми группами, как, например, полиэтиленгликоль или поливинилпирролидон.

Кроме того, составы лекарственных средств содержат обычные в фармацевтике буферы, как, например, щелочные фосфаты (фосфат натрия или калия или их кислые соли или дигидрогенные соли), соли органических или неорганических кислот или аминокислот. Состав различных буферных веществ в рецептуре выбирают таким образом, чтобы в итоге получить по возможности незначительную буферную емкость готового к применению инъекционного или инфузионного раствора. Это может произойти в результате того, что используют минимальное количество буферных веществ, при этом, в частности, все количество буфера не должно превышать концентрацию в растворе лекарственного средства порядка 100 ммоль/л. Предпочтительно используют буферные вещества в концентрации от 10 до 100 ммоль/л, особенно 20 60 ммоль/л. Альтернативно этому возможно также выбирать отдельные буферные вещества таким образом, чтобы они в своем действии, находящемся в основном в кислом или в основном буферном диапазоне, взаимно компенсировали друг друга. В этом случае общее количество буферных веществ может составлять до 200 ммоль/л в готовой к применению лекарственной форме.

Лиофилизированные лекарственные средства дополнительно содержат преимущественно структурообразователь, который при замораживании водного раствора образует кристаллическую матрицу, остающуюся стабильной по своей структуре также во время последующей лиофилизации и при продолжительном хранении лиофилизата при различных наружных условиях. В этом смысле как пригодные структурообразователи рассматриваются маннитол или глицин.

Полученные таким образом лекарственные средства поступают в торговлю преимущественно в виде лиофилизатов. Их можно применять как препараты для одноразового использования, при этом определенное количество человеческого протеина находится в инъекционном сосуде, ампуле или капсуле, а лиофизилат растворяется в результате добавления соответствующего количества реконституционного раствора. Этот реконституционный раствор уже может содержать необходимое количество щелочи, которая требуется для того, чтобы отрегулировать желаемое значение величины pH готового для инъекции раствора. Наряду с этим можно применять прочие изотонические добавки. Лиофилизат, с другой стороны, также уже полностью или частично может содержать количества основных реагентов, которые необходимы для предпочтительного pH-диапазона, так что реконституция осуществляется в основном посредством дистиллированной воды для инъекционных целей. Далее, как лиофилизат, так и реконституционный раствор могут содержать средства, обеспечивающие получение изотонического раствора.

Такой реконституционный раствор набирают затем в инъекционный шприц и вводят непосредственно пациенту. Так называемые препараты с однократной дозировкой содержат, например, rh -EPO в количестве от 500 до 20.000, предпочтительно 1.000, 2.000, 5.000, 10.000 ил 15.000 U. При соответственно большем применении человеческого протеина можно изготавливать также препараты с многократной дозировкой. В этом случае применяют больший объем (около 5 10 мл) как реконституционный раствор, причем этот раствор можно применять затем для нескольких использований. Применяемое количество человеческого протеина в этом случае может быть установлено индивидуально врачом или его можно использовать для нескольких применений у различных пациентов.

Специфическая активность используемого для получения инъекционных или инфузионных растворов EPO составляет преимущественно приблизительно 160.00 lU на абсорбционную единицу при 280 m (сравни EP 0.209.539).

Содержащие человеческий протеин инъекционные растворы содержат растворенные в воде, помимо обычных для биологически активного вещества вспомогательных веществ, к которым, наряду с уже названными стабилизаторами, буферами, комплексообразователями относятся и смачивающий агент. Буферы используются в концентрациях примерно от 1 до около 100 мМоль/л. Пригодные pH-величины растворов находятся в пределах около 4,5 и приблизительно 7,4 при внутривенном применении, и в пределах между около 6,0 и около 7,4 при подкожном применении. Верхний предел расположен в диапазоне pH крови (7,2 до 7,4). Более высокие значения pH-величин следует избегать, потому что человеческие протеины в щелочной среде, как правило, не стабильны.

Ниже изобретение описывается более подробно на основе примеров. В качестве действующего вещества, вводят заменяющие класс человеческих протеинов, соответственно rh EPO и G-CSF. Однако равным образом могут применяться также и другие человеческие протеины.

Для изготовления инъекционных растворов, используемых в изобретении, в стерильном V2A котле с двойной рубашкой, оснащенным мешалкой, растворяют в воде вспомогательные вещества. Основные вспомогательные вещества это буферы, комплексообразователи, стабилизаторы и смачивающие агенты. Для установления физиологически оптимального диапазона для внутривенного и подкожного применения пригодными в качестве буферов являются особенно: гликоколль, цитрат натрия, первичный фосфат калия, вторичный фосфат калия, карбонат и соли аминокислот, кроме того, натриевые и калийные соли яблочной кислоты, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, винной кислоты и аспарагиновой кислоты и комбинации этих веществ. Буферы используются в концентрации примерно от 1 до 100 мМоль/г раствора. Действующее вещество добавляют в раствор и осуществляют заполнение до конечного объема и помешивание. Исходный раствор фильтруют в условиях стерильности через мембранный фильтр с шириной пор 0,2 m. Полученный при этом раствор заполняют до отметки 0,5 мл в инъекционные сосуды при асептических условиях, а затем высушивают на лиофилизационной установке.

Вышеописанные рецептуры являются также стабильными как готовые для впрыскивания растворы. При их изготовлении полученный раствор не подвергают лиофилизации, а после фильтрации в стерильных условиях заполняют непосредственно в ампулу или в инъекционный сосуд с объемом, например, 1 мл на каждую емкость.

Для изготовления фармацевтических форм введения, которые содержат человеческие протеины, применяют обычные фармацевтические вспомогательные вещества или добавки. Далее могут быть добавлены стабилизаторы или растворители, как, например, основные аминокислоты аргинин, лизин или орнитин. Как аминокислоты используются в частности глицерин, лейцин, изолейцин, треонин, глутамин, глутаминовая кислота, аминоуксусная кислота, фенилаланин, а также другие аминокислоты, названные в патентных заявках EP 0 430 200 или EP 0 306 824, которые служат для стабилизации или растворения протеина, и кроме того, могут использоваться также как буферные вещества. Форма введения может поступать в торговлю как лиофилизат или также как готовый к употреблению инфузионный или инъекционный раствор.

При изготовлении фармацевтической упаковочной единицы формы введения, как правило, снабжаются прилагаемой запиской, на которой, среди прочего, содержится указание на то, что эти инфузионные и инъекционные растворы обеспечивают хорошо переносимое, безболезненное применение. На основе следующих примеров еще более точно описываются предложенные растворы, содержащие человеческий протеин, для сосудов с многократной дозировкой и их изготовление. В этих растворах речь идет о тех, которые как человеческий протеин содержат EPO или G-CSF. Однако равным образом можно использовать также и другие человеческие протеины. Изготовленные рецептуры имеются как лиофилизаторы или как жидкие составы, которые при хранении в холодильнике при температуре около +4^oC до около +8^oC остаются стабильными в течение нескольких лет.

Пример 1. EPO 2.000 единиц инъекционного сухого вещества (исходный раствор для 35.000 сосудов).

К 30 л этого раствора, содержащего вспомогательные вещества, добавляют 214,3 мл загрузки сырого эритропойетина с EPO-титром 140.000 единиц/1 мл, и заполняют до конечного объема 35 л и помешивают. С помощью оставшегося раствора вспомогательных веществ осуществляют промывку фильтрационной системы. Исходный раствор фильтруют в условиях стерильности через мембранный фильтр с шириной пор 0,2 /um. Отфильтрованный в условиях стерильности раствор заполняют в инъекционные сосуды до 1 мл при асептических условиях и подвергают сушке вымораживанием на лиофизилазационной установке.

Описанные в примере рецептуры стабильны при хранении не только как лиофилизаты, но также и как готовые для впрыскивания растворы.

Пример 2. ЕРО-лиофилизат 5.000U (единиц) и 10.000U (единиц) (табл. 2).

Получение лиофилизатов осуществляется соответственно предписанию, указанному в примере 1, с единственным отличием, что перед лиофилизацией заполнение осуществляется в сосуды емкостью 0,5 мл, а не в сосуды емкостью 1 мл.

Эти лиофилизаты перед применением растворяют посредством консервантов, которые содержат хорошо переносимые реконституционные растворы, хлорбутанол 5,0 мг, вода для инъекционных целей ad 1,0 мл. Альтернативно можно применять также растворы бензилового спирта (около 4 5 мг) мл (при добавлении бензалконийхлорида (приблизительно 0,01 0,05 мг/мл).

Пример 3. ЕРО-инъекционный раствор, готовый для введения (табл. 3).

Этот способ изготовления отличается от способа получения, применяемого в примере 2, лишь тем, что полученный раствор не подвергают лиофилизации, а заполняют непосредственно в ампулу или в инъекционный сосуд, каждый имеющий вместимость по 0,5 мл соответственно.

Эти инъекционные растворы разбавляют перед применением консервированным, хорошо переносимым раствором в количестве 0,5 мл или 1,0 мл, со следующим составом: бензиловый спирт 5,0 мг, вода для инъекций ad 1,0 мл. Альтернативно можно применять также растворы бензилового спирта (около 4 5 мг/мл) при добавлении бензалконийхлорида (примерно 0,01 0,05 мг/мл).

Пример 4. rhG CSF растворы с pH 2,5, мг: rhG CSF 0,175 Хлорид натрия 1,500 Полисорбат 80 0,050 Аминоуксусная кислота для анализа 5,750 L-лейцин 0,500 L-изолейцин 0,500 L-треонин 0,125 L-глутаминовая кислота 0,125 L-фенилаланин 0,250
HCl 0,1 моляр. 0,000
Вода для инъекций +493,025
Значение pH-раствора, реконституированного в 0,5 мл воды для инъекций составляет 2,5.

Эти инъекционные растворы перед применением разбавляют консервированным, хорошо переносимым раствором в количестве 0,5 мл или 1,0 мл, со следующим составом: бензиловый спирт 5,0 мг, воды для инъекций ad 100 мл. Альтернативно можно использовать также растворы бензилового спирта (около 4 - 5 мг/мл) при добавлении бензалконийхлорида (примерно 0,01 0,05 мг/мл).

Пример 5. G CSF рецептуры с pH величиной 4,5, мг:
rhG CSF 0,175
Хлорид натрия 1,500
Полисорбат 80 0,050
Аминоуксусная кислота для анализа 6,550
L-лейцин 0,500
L-изолейцин 0,500
L-треонин 0,125
L-глутаминовая кислота 0,125
L-фенилаланин 0,250
HCl 0,1 моляр. ad pH 4,5 0,000
Вода для инъекций +492,225
Значение pH-раствора, реконституированного в 0,5 мл воды для инъекций составляет 4,5. Эти инъекционные растворы перед применением разбавляют посредством 0,5 мл или 1,0 мл консервированного, хорошо переносимого раствора со следующим составом: бензиловый спирт 5,0 мг, вода для инъекций ad: 1,0 мл. Альтернативно могут применяться также растворы бензилового спирта (около 4 5 мг/мл) при добавлении бензалконийхлорида (примерно 0,01 0,05 мг/мл).

Буферная емкость: 3,0 ммоль/л NaOH (30 мл 0,1 н. NaOH).

Титруемая кислотность: 5,0 ммол/л NaOH (50 мл 0,1 н. NaOH).

Пример 6. G-CSF рецептура с pH величиной 3,8 4,0, мг:
rhG CSF 0,175
Хлорид натрия 1,500
Полисорбат 80 0,050
Аминоуксусная кислота для анализа 5,750
L-лейцин 0,500
L-изолейцин 0,500
L-треонин 0,125
L-глутаминовая кислота 0,125
L-фенилаланин 0,250
HCl 0,1 моляр. ad pH 3,8 4,0 0,000
Вода для инъекций +493,025
Значение pH-раствора, реконституированного в 0,5 мл воды для инъекций составляет 3,9. Эти инъекционные растворы перед применением разбавляют консервированным, хорошо переносимым раствором в количестве 0,5 мл или 1,0 мл, со следующим составом: бензиловый спирт: 5,0 мг, вода для инъекций ad 1,0 мл. Альтернативно можно применять также растворы бензилового спирта (около 4 5 мг/мл) при добавлении бензалконийхлорида (около 0,01 0,05 мг/мл).

Буферная емкость: 5,8 ммоль/л NaOH (58 мл 0,1 н. NaOH).

Титруемая кислотность: 10 ммоль/л NaOH (100 мл 0,1 n NaOH).

Пример 7. G-CSF рецептуры c pH 4, мг (см. табл. 4).

Буферная емкость: 5,8 ммоль/л NaOH (58 мл 0,1 н. NaOH).

Титруемая кислотность: 10 ммоль/л NaOH (100 мл 0,1 n NaOH).

Рецептуры, описанные в примерах 1 7, стабильны при хранении не только как лиофилизаты, то также и как готовые для впрыскивания растворы.

Формула изобретения

1. Способ получения консервированного, содержащего протеин человека, лекарственного средства для инъекционного или инфузионного введения путем добавления к нему вспомогательных веществ, отличающийся тем, что дополнительно вводят по меньшей мере одно консервирующее средство, выбранное из группы хлорбутанол, бензиловый спирт, бензалконийхлорид или комбинацию этих веществ при концентрации консервируемого средства 0,001 2,0%
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрация консервирующего средства в инъекционном или инфузионном растворе составляет от 0,01 до 1,0%
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что консервирующее средство вводят в форме комбинации по меньшей мере двух консервирующих средств.

4. Способ по пп.1 3, отличающийся тем, что консервация хлорбутанола в инъекционном или инфузионном растворе составляет 2 5 мг/мл.

5. Способ по пп.1 3, отличающийся тем, что концентрация бензилового спирта в инъекционном или инфузионном растворе составляет 1 5 мг/мл.

6. Способ по пп. 1 3, отличающийся тем, что концентрация бензалконийхлорида в инъекционном или инфузионном растворе составляет 0,01 - 0,05 мг/мл.

7. Способ по пп.1 6, отличающийся тем, что вводят в качестве протеина человека ЕРО из -CSF или протеин с аналогичным плазминогенактиваторским действием.

8. Способ по пп.1 7, отличающийся тем, что буферную емкость форм лекарственного средства устанавливают на значении до 10 m Val/л.

9. Способ по пп.1 8, отличающийся тем, что титруемую кислотность готового наносимого лекарственного средства устанавливают на значении до 15 м Val/л.

10. Способ по пп.8 и 9, отличающийся тем, что для установления буферной емкости или титруемой кислотности используют хорошо переносимое буферное вещество из группы гликокол, цитрат натрия, фосфаты или карбонаты щелочных металлов, соли аминокислот, щелочные соли яблочной кислоты, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, винной кислоты, аспаргиновой кислоты, или комбинации этих веществ.

11. Лекарственное средство, полученное по п.1, содержащее протеин человека в эффективном количестве и вспомогательные добавки, отличающееся тем, что дополнительно оно содержит по меньшей мере одно консервирующее средство, выбранное из группы, хлорбутанол, бензиловый спирт, бензалконийхлорид или комбинацию этих веществ в концентрации 0,001 2,0%

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2