Штамм гибридных клеток mus musculus l., продуцирующий моноклональные антитела к гексону аденовируса собаки первого серотипа (cav-1)

 

Использование: ветеринарная биотехнология, разработка реагентов для диагностики аденовирусной инфекции собак. Сущность: получение штамма гибридных клеток Mus musculus L., продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к гексону аденовируса собаки первого серотипа (CAV-1). Штамм получают гибридизацией миеломной линии P3-X63-Ag8-653 с клетками периферических лимфатических узлов мышей линии BALB/C, иммунизированных препаратом гексона CAV-1. Антитела используют в иммуноферментном анализе для выявления CAV-1 в биологических жидкостях. Чувствительность метода составляет 30 нг/мл.

Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, в частности к получению штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела, которые могут быть использованы для приготовления высокоспецифических диагностических реагентов с целью выявления вируса в сыворотках крови и других биологических жидкостях собак и экспресс-диагностики инфекционного гепатита плотоядных.

Аденовирус собак 1 серотипа (CAV-1) вызывает острое, контагиозное заболевание инфекционный гепатит, протекающее с преимущественным поражением печени и сопровождающееся воспалительными процессами слизистых оболочек глаз, носовой полости, желудочно-кишечного тракта, поражением центральной нервной системы. Регистрируется болезнь у собак, лисиц, песцов, нутрий и других плотоядных.

Для всех аденовирусов характерны преимущественная продукция главного структурного белка вирусного капсида гексона в процессе инфекции и преобладание антител к гексону в иммунном ответе. Поэтому основные способы диагностики аденовирусных инфекций направлены на идентификацию гексона соответствующих серотипов аденовирусов или на выявление антител к нему.

Необходимость данной работы обусловливается тем, что диагностика аденовирусной инфекции, связанная с выявлением антигена, затруднена в связи с низким содержанием вируса в патогенном материале, недостаточным для обнаружения классическими серологическими методами. Для этих целей необходимы методы, обладающие высокой чувствительностью и специфичностью.

Известно, что штамм гибридных клеток, полученный из одного клона, является постоянным продуцентом антител строго определенной специфичности. Диагностические тест-системы на основе моноклональных антител характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью и значительно превосходят по этим параметрам традиционные серологические тесты, в которых используются поликлональные антисыворотки.

В настоящее время известны штаммы гибридных клеток, продуцирующие моноклональные антитела к гексону аденовирусов человека Ad2, Ad5 [1] Известен также штамм гибридных клеток, продуцирующий моноклональные антитела к гексону аденовируса крупного рогатого скота BAV-3 [2] Штамм был получен путем слияния спленоцитов иммунных мышей BALB/c с клетками миеломы Sp 2/0. Препараты, полученные на основе моноклональных антител, были использованы в ИФА для обнаружения гексоновых антигенов аденовирусов крупного рогатого скота.

Моноклональные антитела, продуцируемые этими штаммами не могут быть использованы для создания тест-системы по выявлению аденовируса собак серотипа CAV-1 и экспресс-диагностики инфекционного гепатита плотоядных.

Цель исследований получение штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к гексону аденовируса собак серотипа CAV-1.

Штамм гибридных клеток получен путем слияния клеток мышиной миеломы линии P3-X63-Ag8-653 с клетками периферических лимфатических узлов (паховых и подколенных) мышей линии BALB/c, иммунизированных двукратно (100 мкг) препаратом гексона CAV-1, очищенным из культуральной среды, содержащей аденовирус хроматографическими методами.

Слияние клеток проводили через 3 дня после последней инъекции по стандартной методике с использованием ПЭГ с м.м. 1500. Клетки миеломы и лимфоциты в соотношении 1:4-1:10. Селекцию гибридом проводили на среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Гибридомы культивировали на 96-луночных панелях (фирма "Nunc") на среде RPMI- 1640 или ДМЕМ с 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота в атмосфере с 5% CO₂.

Скрининг гибридом на продукцию специфических моноклональных антител проводили методами непрямого твердофазного ИФА с использованием антивидовых иммунопероксидазных конъюгатов, а также препарата, содержащего иммунохимически чистый гексан. Клонирование и реклонирование клеточных культур проводили на 96-луночных панелях методом предельных разведений с использованием макрофагального фидерного слоя.

В результате был отобран и размножен клон, продуцирующий моноклональные антитела к гексону аденовируса собак серотипа CAV-1, которые реагировали с гексоном в ИФА, перекрестные реакции с другими структурными белками аденовирусного капсида отсутствовали. Этот клон клеток последовательно размножен в 96-, 24-луночных панелях, а затем в культуральных матрасах. Культуральная жидкость была исследована на содержание специфических антител. Титр специфических антител в ИФА составлял 1:320. Препараты моноклональных антител получали 2-х кратным осаждением раствором сульфата аммония 50% насыщения с последующим диализом. Была определена классовая принадлежность и специфичность моноклональных антител в ИФА, иммуноблоттинге, РДП, РТГА и РН.

Предложенный штамм гибридных клеток мышей Mus. Musculus 1CAV-1 N СХЖ РАСХН 51, продуцент моноклональных антител к гексону аденовируса собак серотипа CAV-1 обладает следующими свойствами.

Морфологические признаки. Клетки округлой формы с большим ядром, хорошо прикрепляются к субстрату, размножаются на поверхности субстрата и частично в суспензии.

Культуральные свойства. Клетки перевивают один раз в 2 3 дня с полной заменой ростовой среды с коэффициентом 1:2 -1:4.

Характеристика культуры на животных. Клетки вызывают образование асцитов у линейных мышей BALB/c, обработанных пристаном за 7-10 дней до внутрибрюшинного введения 2-10·10⁶ клеток/мышь.

Контаминация. Тесты на микоплазмы, бактерии, плесневые грибы и дрожжи - отрицательны.

Изотип продуцируемых моноклональных антител IgG_2a.

Хранение культур. Среда для замораживания 90% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 10% диметилсульфоксида. Режим замораживания: до минус 70^oC 1^oC/мин, далее жидкий азот (-196^oC). Восстановление после размораживания: быстрое размораживание при +37^oC, центрифугирование при 1200 об. /мин 10 мин, ресуспендирование в ростовой среде до концентрации 0,3-0,5·10⁶ кл/мл. Жизнеспособность после размораживания 70-80% Пример 1. Клетки клона пассировали на среде ДМЕМ с 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 4 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глютамина в атмосфере с 5% CO₂. Титр специфических моноклональных антител в культуральной жидкости в ИФА составил 1:320.

Пример 2. Клетки клона вводили в брюшную полость линейных мышей BALB/c, предварительно за 7 сут праймированным 0,3 мл пристана по 2-10·10⁶ клеток/мышь в 0,5 мл фосфатно-солевого буфера. На 10-14 сут получена асцитическая жидкость, титр спефцифических моноклональных антител в которой составлял в 1:10⁵ в ИФА, 1:2 в РДП и РТГА, 1:32 в РН.

Пример 3. Препараты моноклональных антител, полученные из асцитической жидкости двукратным осаждением раствором сульфата аммония 50% насыщения, были использованы в качестве фиксирующих антител в "сэндвич"-ИФА. Для иммобилизации на микропанелях моноклональные антитела брали в концентрации 50 μg/ml, в качестве детектирующих антител была использована поликлональная антисыворотка. Для детекции использовали очищенный препарат гексона, культуральную жидкость, содержащую гексон, сыворотки крови и секреты от экспериментально зараженных и спонтанно инфицированных собак. Чувствительность метода при этом составляла 30 ng/ml.

Предложенный штамм апробирован нами с положительным результатом в лабораторных условиях с 1992 по 1994 год.

Штамм гибридных клеток мышей Mus. Musculus 1CAV-1 N СХЖ РАСХН 51 продуцент моноклональных антител к гексону аденовируса собак серотипа CAV-1 хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Российской коллекции культур клеток при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии (СХЖ РАСХН) под N СХЖ РАСХН 51.

Штамм является продуцентом моноклональных антител специфически реагирующих только с гексоном аденовируса собак CAV-1, и не дающих перекрестных реакций с другими структурными белками аденовирусного капсида.

Наработку моноклональных антител можно проводить в неограниченном количестве. Моноклональные антитела являются препаратом, имеющим стандартные характеристики.

Штамм может быть использован в научно-исследовательских институтах, проблемных лабораториях, ведущих работы в области вирусологии и биотехнологии.

Препараты моноклональных антител, полученные из асцитической жидкости, можно использовать в "сэндвич"-ИФА для выявления аденовируса серотипа CAV-1 в сыворотках крови и других биологических жидкостях собак и экспресс-диагностики инфекционного гепатита плотоядных.

Источники информации 1. Adam E. Nazs I. Lengyel A. et al. Determination of different antigenic sites on the adenovirus hexon using monoclonal antibodies.-Arch. Virol. 1987, 93: 261-271.

2. Isakova V.R. Kiseleva E.K. Kirasova M.A. et al. Characterization of a series of monoclonal antibodies specific for bovine adenovirus serotype BAV3 hexon antigen and their use in an ELISA for detection of adenoviral hexons. Acta Microbiol. Hungarica, 1990, 37: 309-316.

Формула изобретения

Штамм гибридных клеток Mus musculus L. ВСКК СХЖ N 51, продуцирующий моноклональные антитела к гексону аденовируса собаки первого серотипа (CAV - 1).