Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l., используемый для получения моноклонального антитела к гликопротеинам iiв-iiiа тромбоцитов человека

 

Использование: биотехнология, терапия острого инфаркта миокарда. Сущность: получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши, продуцирующего моноклональные антитела к гликопротеиновому комплексу IIb-IIIa тромбоцитов человека. Указанные антитела полностью ингибируют агрегацию тромбоцитов, индуцированную аденозиндифосфатом и тромбином, и могут быть использованы для ингибирования тромботических осложнений у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями. 2 ил., 2 табл.

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в биологии и клинической практике.

Две главные реакции тромбоцитов адгезия и агрегация опосредуются мембранными гликопротеидами (ГП). Главным белком поверхности тромбоцитов является комплекс ГП IIb-IIIa. Именно этот комплекс на активированных тромбоцитах служит рецептором фибриногена, что определяет его ключевую роль в процессе агрегации.

ГП IIb имеет молекулярную массу 135 кДа и состоит из двух связанных дисульфидной связью цепей с молекулярными массами 116 и 23 кДа. ГП IIIa имеет молекулярную массу 95 кДа и содержит большое количество внутримолекулярных дисульфидных связей, отчего после восстановления его структура становится менее компактной и электрофоретическая подвижность снижается.

В отличие от других рецепторов для белков адгезии ГП IIb-IIIa взаимодействует с белками-лигандами только после активации тромбоцитов и является, таким образом, индуцибельным рецептором. Изменение конформации комплекса ГП IIb-IIIa и связывание с ним фибриногена и других лигандов является ключевым механизмом агрегации тромбоцитов. Фибриноген образует мостики между тромбоцитами и, таким образом, служит кофактором в процессе агрегации. Воздействия, препятствующие связыванию белков-лигандов (диссоциация комплекса с помощью ЭДТА, ингибирование связывания антителами и RGD-содержащими пептидами), ингибируют агрегацию тромбоцитов, а тромбоциты с наследственным дефицитом ГП IIb-IIIa (тромбастения Гланцманна) неспособны к фибриноген-зависимой агрегации, т.е. агрегации, индуцированной большинством известных агонистов (АДФ, тромбин, фибриллярный коллаген, адреналин и др.).

Большинство моноклональных антител (мАТ), направленных против ГП IIb-IIIa, неспособны ингибировать агрегацию тромбоцитов, однако некоторые мАТ специфически блокируют связывание фибриногена и других белков адгезии с рецептором и, таким образом, ингибируют агрегацию тромбоцитов [1-4] Обработка такими антителами имитирует состояние тромбоцитов, сходное с наблюдаемым при тромбастении Гланцманна. In vitro тромбоциты теряют способность к агрегации, индуцированной большинством агонистов (АДФ, тромбин, коллаген, адреналин и др.). Работы, выполненные на экспериментальных животных, указывают на то, что мАТ, ингибирующие агрегацию тромбоцитов, могут быть использованы в клинической практике в качестве антитромботических агентов [5] Наиболее перспективным представляется использование этих мАТ при лечении острого инфаркта миокарда и при операциях по протезированию сосудов. Анализ опубликованных работ показывает, что способность ингибировать агрегацию тромбоцитов у подобных мАТ выражена в различной степени [1,2,4] Штамм-прототип, охарактеризованный в заявке на Европейский патент [6] и затем подробно описанный в работе [4] продуцирует мышиные мАТ 7ЕЗ. Это антитело в концентрации 10 мкг/мл полностью ингибирует агрегацию тромбоцитов, индуцированную АДФ и тромбином. Другие аналоги ингибируют агрегацию приблизительно в тех же или более высоких концентрациях (табл. 2).

Целью изобретения является получение высокопродуктивной гибридомы, продуцирующей мАТ против ГП IIb-IIIa, способной ингибировать агрегацию тромбоцитов в более низких концентрациях, чем прототип 7ЕЗ и другие аналоги.

Цель достигается созданием гибридного штамма на основе клеток иммунной селезенки мыши ВАLB/C и мышиной миеломной линии Х63-Аg8-653. Штамм отбирается по способности продуцируемого антитела наиболее эффективно ингибировать агрегацию тромбоцитов.

Получение штамма 1. Иммунизация, слияние и получение первичных популяций.

Штамм получают следующим образом. Самцов мышей линии BALB/C иммунизируют свежевыделенными отмытыми тромбоцитами в буфере Тироде-НЕРЕS по приведенной ниже схеме (табл. 1), не описанной ранее в литературе. Через 3 дня после разрешающей иммунизации 12х10⁷ клеток селезенки иммунной мыши гибридизируют с 25х10⁶ клеток мышиной миеломы Х63-Аg8-653 в присутствии 0,7 мл среды RPMI-1640, содержащей 45% (объем/объем) ПЭГ (молекулярный вес 3350) и 15% ДМСО. После гибридизации и отмывки от ПЭГ клетки высевают в 96-луночные планшеты по 2х10⁵ клеток в лунку в селективной среде (среда RPMI-1640 с добавлением 20% телячьей эмбриональной сыворотки, 10^-4 М гипоксантина, 4х10^-7 М аминоптерина и 1,6х10^-5 М тимидина). Через 7 дней среду меняют на такую же, но не содержащую аминоптерина, и культивируют клетки в этой среде в течение двух недель. По окончании селекции клетки переводят на среду для культивирования (среда RPMI-1640 с добавлением 20% телячьей эмбриональной сыворотки, 4 мМ L-глутамина, 10 мМ пирувата натрия, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, аминокислот и витаминов для базальной среды Игла и 0,05 мМ меркаптоэтанола). Через неделю культивирования проводят отбор первичных популяций гибридов-продуцентов, определяя содержание антитромбоцитарных антител в культуральной среде методом иммуноферментного анализа (ИФА). Затем гибридные клетки, секретирующие антитела против антигенов поверхности тромбоцитов, пересевают в лунки 24-луночного планшета и проводят повторный скрининг методом ИФА.

2. Скрининг мАТ. Связывание с тромбоцитами.

Скрининг мАТ, связывающихся с тромбоцитами, осуществляют с помощью метода ИФА с использованием не фиксированных, как это принято в мировой практике, а интактных тромбоцитов. Отмытые тромбоциты (10⁷ в 100 мкл раствора Тироде-НЕРЕS) вносят в лунки 96-луночного микротитровального планшета (Nunc, Дания) и осаждают в течение 5 мин при 1000 g. Для лучшего прикрепления тромбоцитов к пластику планшеты инкубируют 30 мин, при 37^oC и затем удаляют неприкрепившиеся тромбоциты, промывая лунки раствором Тироде-НЕРЕS. После этого пластик блокируют 1% БСА (по 150 мкл в лунку) в течение 30 мин при 37^oC. Культуральные среды гибридомных клеток или очищенные антитела вносят в лунки в объеме 50 мкл и инкубируют 40 мин при 37^oC. После пятикратной отмывки раствором Тироде-НЕРЕS в лунки вносят 50 мкл антител козы против IgG мыши, конъюгированных с пероксидазой. После 30-минутной инкубации и семикратной отмывки связавшуюся пероксидазу определяют по цветной реакции с хромогенным субстратом (0,1 мг/мл 1,2-фенилендиамина и 0,006% Н₂O₂ в 50 мМ цитратном буфере, pН 4,5). Субстрат добавляют в объеме 100 мкл и после развития окраски (через 5-10 мин) реакцию останавливают, внося в лунки по 25 мкл 50% Н₂SO₄. Оптическую плотность определяют при 492 нм в спектрофотометре Titerteck Multiscan (Flow, Великобритания). В качестве положительного контроля в ИФА используют сыворотку иммунизированных мышей, а в качестве отрицательного контроля сыворотку интактных мышей и культуральную среду миеломных клеток. Таким образом отбирают наиболее продуктивные клоны.

3. Скриннинг мАТ. Ингибирование агрегации.

Культуральные среды, содержащие антитела, реагирующие с тромбоцитами, проверяют на способность мАТ ингибировать агрегацию тромбоцитов. Агрегацию, стимулированную АДФ, исследуют в обогащенной тромбоцитами плазме (ОТП) (2,5х10⁸ тромбоцитов в мл), а агрегацию, индуцированную тромбином, в суспензии отмытых тромбоцитов (3х10⁸/мл). Исследование агрегации проводят в агрегометре Aggregation Analyzer (Биола, Россия) при 37^oC и при перемешивании со скоростью 800 об/мин.

4. Клонирование.

Отобранные гибриды-продуценты клонируют методом конечных разведений. В 96-луночных планшетах (Flow) в течение двух недель культивируют спленоциты мыши BALB/с (по 4х10⁴ клеток в лунке) в качестве фидерного слоя. Затем в эти же планшеты высевают гибридные клетки (по 1-2 клетки в лунку). После второго клонирования практически 100% субклонов продуцируют антитела к тромбоцитам, ингибирующие агрегацию. Таким образом, в результате скриннига гибридов продуцентов мАТ к поверхностным ГП тромбоцитов отобрана гибридома, образующая мАТ, наиболее эффективно ингибирующие агрегацию тромбоцитов.

Характеристика штамма Условное наименование отобранного штамма CRC64. Штамм продуцирует мАТ, ингибирующие агрегацию тромбоцитов. Условное наименование мАТ, продуцируемых штаммом CRC64. Штамм депонирован в Коллекции клеточных культур под номером 591Д и характеризуется следующими свойствами.

1. Родословная штамма. Штамм CRC64 является продуктом слияния клеток селезенки мыши BALB/C и миеломы Х63, АG8, 653 (клон Р301). Мышей иммунизировали суспензией тромбоцитов. Слияние произведено с помощью полиэтиленгликоля ПЭГ 3000 (Merck). Селекция гибридных клеток проведена с помощью селективной среды ГАТ. Штамм проведен через 4 клонирования, позитивных клонов 100% 2. Число пассажей к моменту паспортизации 20.

3. Стандартные условия культивирования. Культивирование гибридных клеток проводят в пластиковых флаконах в среде RPMI 1640 с добавлением 20 х телячьей эмбриональной сыворотки, 4 мМ глютамина, 10 мМ пирувата натрия, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, аминокислот и витаминов для базальной среды Игла и 0,05 мМ меркаптоэтанола при 37^oC в атмосфере 5% углекислого газа.

4. Культуральные свойства. Посевная доза гибридных клеток 10⁵ клеток в мл. Плотность в монослое 10⁶ клеток в мл. Культуру пассируют через 36 ч. Через 3 сут культивирования концентрация мАТ составляет 20-30 мкг/мл. Продукция антитела сохраняется по крайней мере в течение 20 пассажей в культуре.

5. Характеристика культивирования в организме животных. Клетки штамма CRC64 для получения препаративных количеств мАТ культивируют в брюшной полости мышей линии BALB/C. Мышам за 7 сут до инъекции клеток гибридомы вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл пристана. Гибридные клетки вводят внутрибрюшинно по 4х10⁶ клеток в мл. Асцит образуется через 12-16 сут. Концентрация мАТ в асцитной жидкости 10-20 мг/мл.

6. Цитоморфологическая характеристика стандартные клетки мышиной гибридомы.

7. Видовая принадлежность мышь линии BALB/c.

8. Онкогенность клеток и полезного продукта специально не определяли. Эти тесты будут проведены в случае клинических испытаний антитела CRC64 или его производных.

9. Маркерные признаки. См. характеристику продукта.

10. Контаминации. При длительном наблюдении и посевах на питательные среды бактерии и грибковые загрязнения в культуре не обнаружены. Заражение микоплазмой не выявлено.

11. Криоконсервация. Клетки штамма консервируют по 10⁶ клеток в мл в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10% ДМСО и хранят в жидком азоте.

Характеристика полезного продукта штамма СRC64.

Штамм CRC64 продуцирует мАТ иммуноглобулины класса G1. Очистку мАТ CRC64 из асцитной жидкости проводят с помощью преципитации сульфатом натрия с последующей ионообменой хроматографией на ДЭАЭ-Toyopearl. Очищенное антитело электрофоретически гомогенно и имеет молекулярный вес 150 кДа.

1. Характеристика антигена.

Определения природы антигена мАТ CRC64 проводят с помощью иммунопреципитации антителом его антигена из лизата ¹²⁵I-меченных тромбоцитов. В преципитатах обнаруживаются два белка с молекулярными весами 130 и 90 кДа в невосстанавливающих условиях, 120 и 100 кДа в восстанавливающих, что соответствует электрофоретическим характеристикам ГП IIb и IIIa. Обработка тромбоцитов ЭДТА, вызывающая диссоциацию комплекса ГП IIb-IIIa, предотвращает преципитацию белков-мишеней.

Параметры связывания мАТ CRC64 с тромбоцитами определяют в присутствии двухвалентных катионов или ЭДТА (перед добавлением антитела тромбоциты инкубировали с 5 мМ ЭДТА, чтобы вызвать диссоциацию комплекса ГП IIb-IIIa). В присутствии ЭДТА антитело практически не связывается с тромбоцитами. Это соответствует данным иммунопреципитации и также указывает на комплексзависимую природу эпитопа CRC64. В насыщающей концентрации с одним тромбоцитом связывалось около 48000 молекул ¹²⁵I-CRC64, что соответствует числу копий ГП IIb-IIIa на поверхности тромбоцита. Сравнение параметров связывания и результатов экспериментов по агрегометрии свидетельствует о том, что насыщение антителами возможных мест связывания и полное блокирование агрегации тромбоцитов происходит примерно при одних и тех же концентрациях мАТ CRC64.

Параметры связывания мАТ CRC64 и данные иммунопреципитации дают возможность считать, что антигеном антитела CRC64 является ГП IIb-IIIa, причем это антитело узнает детерминанты, представленные только на комплексе этих белков.

2. Ингибирование агрегации тромбоцитов мАТ CRC64.

АДФ и тромбин наиболее важные физиологические агонисты тромбоцитов. Оба индуктора стимулируют агрегацию, опосредованную связыванием фибриногена с комплексом ГП IIb-IIIa.

Способность мАТ CRC64 ингибировать агрегацию тромбоцитов проверена на тромбоцитах 15 доноров. Полное ингибирование АДФ индуцированной агрегации тромбоцитов в ОТП наблюдается при концентрации антител 3 мкг/мл (фиг.1). У некоторых доноров полное ингибирование агрегации наступает при меньших концентрациях CRC64. Наименьшая концентрация, при которой наблюдается блокирование реакции агрегации в ОТП 0,5 мкг/мл. Наиболее сильным из индукторов тромбоцитов является тромбин, используемый в высоких концентрациях (более 0,5 ед/мл). СRC64 способно полностью ингибировать агрегацию, стимулированную 1 ед/мл тромбина. В этом случае полное блокирование агрегации достигается при концентрации антитела 5 мкг/мл (фиг.2).

Действие F(ab')2-фрагментов мАТ CRC64 на агрегацию тромбоцитов исследовано на тромбоцитах 10 доноров. F(ab')2-фрагменты CRC64 полностью блокируют агрегацию тромбоцитов, стимулированную АДФ в концентрации 2 мкг/мл (фиг.1), а агрегацию, индуцированную тромбином в концентрации 5 мкг/мл (фиг.2), т.е. в том же диапазоне молярных концентраций, что и интактные иммуноглобулины.

Таким образом, полученное мАТ CRC64, также как и его F(ab')2-фрагменты, обладает способностью полностью ингибировать фибриноген-зависимую агрегацию тромбоцитов, индуцированную АДФ и тромбином, и узнает на поверхности тромбоцитов комплекс мембранных ГП IIb-IIIa.

3. Сравнение с аналогами и прототипом.

Как и большинство описанных в литературе антител, ингибирующих агрегацию тромбоцитов, мАТ CRC64 является комплекс-специфическим и не взаимодействует с диссоциированными белками. Очевидно, что также как и другие аналогичные мАТ, СRС64 препятствует связыванию фибриногена (и, возможно, других белков адгезии) с его рецептором на поверхности активированных тромбоцитов комплексом ГП IIb-IIIa. Этим объясняется действие подобных антител на агрегацию тромбоцитов.

Для полного ингибирования АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов достаточно 3 мкг/мл CRC64, а для ингибирования тромбин-индуцированной агрегации 5 мкг/мл. (Причем у большинства доноров требовались более низкие концентрации). Сравнение с другими описанными в литературе антителами, в том числе и с антителом 7ЕЗ, охарактеризованным в заявке на Европейский патент [6] свидетельствует о том, что полученное антитело отличает наиболее высокая ингибирующая активность по сравнению с другими аналогами (табл. 2). На основании приведенных данных можно сделать вывод, что мАТ CRC64 по этой характеристике, т.е. наиболее важной для возможного применения в клинической практике, превосходит известные аналоги.

Список литературы 1. Coller B.S. Peerschke E.I. Scudder L.E. Sullivan C.A. A murine monoclonal antibody that completely blocks the binding of fibrinogrn to platelets produces a thrombasthenic-like state in normsl platelets and binds to glycoprotein IIb and/or IIIa. J. Clin. Invest. 1983, v.72, pp.325-338.

2. Bennett J.S. Hoxie J.A. Leitman S.F. Vilaire G. Cines D.B. Inhibition of fibrinogen binding to stimulated human platelets by a monoclonal antibody. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, v. 80, pp. 5269-5275.

3. McEver R. Bennett E.M. Martin M.N. Identification of two structurally and functionally distinct sites on human platelet membrane glycoprotein IIb-IIIa using monoclonal antibodies. J. Biol. Chem. v. 8, pp. 5269-5275.

4. Coller B.S. A new monoclonal antibody reports an activation-dependent change in the conformation and/or microenviroment of the platelet GP IIb-IIIa complex. J. Clin. Invest. 1985, v. 76, pp. 101-108.

5. Gold H.K. Coller B.S. Tsunehiro Y. Tomiyoahi S. Fallon J.T. Guerrero J. L. Leinbach R.C. Ziskind A.A. Collen D. Rapid and sustained cjronary artery recanalization with combined bolus injection of recombinant tissue-type plasminogen activator and monoclonal antiplatelet GP IIB/IIIa antibody in a canine preparation. Circulation, 1988, v. 77, pp. 670-677.

6. European patent application. 0206532, Int. Cl. C12P 21/00/

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. ВСКК(П) 591Д, используемый для получения моноклонального антитела к гликопротеинам IIв IIIа тромбоцитов человека.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3

NF4A Восстановление действия патента Российской Федерации на изобретение

Извещение опубликовано: 20.03.2005        БИ: 08/2005

NF4A Восстановление действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Дата, с которой действие патента восстановлено: 20.12.2008

Извещение опубликовано: 20.12.2008        БИ: 35/2008

---