Способ экспресс-диагностики туберкулеза на основе реакции латекс-агглютинации

 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и касается способа экспресс-диагностики туберкулеза на основе реакции латекс-агглютинации. Способ включает инкубирование исследуемой неинактивированной сыворотки крови с полистирольным латексом или полистирольным латексом с функциональными группами. Используют указанные латексы, сенсибилизированные антигеном ацетонвысушенных микобактерий, полученным методами диск-электрофореза в полиакриламидом геле или гель-хроматографии на сефакриле. При этом в качестве указанного антигена используют внутриклеточную цитоплазматическую белковую фракцию из M.tuberсulosis или M.africanum. Способ прост, информативен, позволяет получить достоверные данные. 3 табл.

Изобретение относится к иммунологии, иммунохимии и касается разработки метода экспресс-диагностики туберкулеза для определения в сыворотке крови человека антител к антигенам микобактерий, адсорбированных на латексных частицах.

Известен способ латекс-агглютинации для определения в спинно-мозговой жидкости больных туберкулезом очищенного плазменного мембранного антигена с помощью кроличьих иммуноглобулинов, адсорбированных на латексных частицах [16].

В ряде патентов использованы латексы с адсорбированными на них иммуноглобулинами для определения антигенов в патологическом материале больных туберкулезом [4, 15, 19]. Так, в работе [15] на латексах адсорбированы иммуноглобулины к липоарабиноманнану из M.tuberculosis в исследованиях [19] на латексах-моноклональные антитела к антигенам различных видов микобактерий и других микроорганизмов, в патенте [4] на латексах иммуноглобулины к антигенам из M.smegmatis.

Известен способ латекс-агглютинации для определения антител в сыворотках больных туберкулезом при использовании различных антигенов: туберкулопротеинов [13] , клеточной культуры M. tuberculosis шт. H37Ra, которая была профильтрована, стерилизована, диализирована, а затем адсорбирована на латексные частицы [11] . Однако при постановке латекс-агглютинации с антигенами, не имеющими достаточную степень очистки, только в 60-80% случаев выявляются антитела в сыворотках больных туберкулезом.

Для получения латексных диагностикумов используют сорбцию препаратов на полимерные частицы латекса, в настоящее время чаще применяют латексы, активированные различными функциональными группами. В качестве аналога использован метод латекс-агглютинации, в котором определяли антитела в сыворотках больных кишечным иерсиниозом с помощью антигенов Y.enterocilitica сероварианты 03 и 09, иммобилизованных на окрашенных жирорастворимыми красителям полистирольных латексах с различными функциональными группами [10]. Из 44 сывороток количество сывороток с уровнем антител, превышающим диагностический титр, составляло 70,5% при использовании диагностикума на серотип 09.

Недостатком является то, что метод был использован: 1) для диагностики иерсиниоза, 2) применены эпоксидные и альдегидные функциональные группы на поверхности частиц латекса, 3) процент положительных сывороток составил только 70%, 4) при постановке реакции латекс-агглютинации использовали разбавитель.

В качестве прототипа взят способ экспресс-диагностики туберкулеза [12], в котором использованы полистирольные латексные частицы (0,77 - 0,98 мкм), антиген - туберкулопротеин, полученный из инактивированной культуральной среды M.tuberculosis штамм H37Ra, преципитированный трихлорацетатной кислотой и диализированный.

Этапы получения латексного диагностикума и постановка реакции.

А) Получение латексной суспензии: 10% суспензия - 1 мл + 16 мл дистил. воды, 3% суспензия - 1 мл + 4 мл дистил.воды.

Полученные растворы профильтрованы через бумажный фильтр N 40, помещены в холодильник при 2-4^oC. К 1 мл первого и второго препарата добавлено по 9 мл 0,1 М глицинового буферного солевого раствора, определена их оптическая плотность на спектрофотометре Junior Coleman. Первый препарат - 8,5% суспензия.

Б) Раствор антигена: 0,85% туберкулопротеин - это 5 мг клеток в 10 мл физ. р-ра.

В) латексный диагностикум: 0,1 мл антигена + 6 мл физ.р-ра + 1 мл глицинового буферного раствора латекса. Перемешать.

Полученный диагностикум помещали в термостат 37^oC на 1 ч, затем тщательно перемешивали и использовали в латекс-агглютинации.

Г) Постановка реакции латекс-агглютинации: последовательно осуществляют разведения 0,5 мл инактивированной сыворотки в 8 лунках с 0,5 мл физ.р-ра, затем во все лунки вносят по 0,5 мл сенсибизированной латексной суспензии, перемешивают, инкубируют при 37^oC - 2 ч, центрифугируют при 2500 об/мин 5 мин, учет результатов производят по четырехбалльной системе.

Результаты.

Исследованы сыворотки 222 пациентов. Активные случаи туберкулеза (легочный, внелегочный) составили 75 (79,8%), отдельно по группам: 1) Активные, субактивные, прогрессирующие - полож. реакция - 31 (96,8%), отриц. - 1.

2) Хронические, стационарные - полож. - 44 (69,8%), отриц. - 18.

3) Неактивные случаи туберкулеза - полож. - 19 (35,7%), отриц. - 37 (66,1%).

4) Нетуберкулезные случаи - полож. - 8 (33,3%), отриц. - 16 (66,7%).

Недостатками способа являются: 1) для получения латексного диагностикума в качестве антигена использован туберкулопротеин, имеющий достаточно высокую степень очистки и, следовательно, не обладающий необходимой чувствительностью и специфичностью; 2) для получения необходимой концентрации - 0,85% раствора антигена использовали большое количество клеточной суспензии - 5 мг в 10 мл; 3) исследуемую сыворотку брали не менее 0,5 мл и инактивировали; что возможно снизило чувствительность реакции; 4) время постановки реакции и учет результатов составил 3 ч.

Целью изобретения является повышение скорости диагностики туберкулеза с помощью метода экспресс-диагностики постановка реакции латекс-агглютинации, повышения ее чувствительности и специфичности за счет полистирольных латексных частиц, сенсибилизированных высокочувствительными и специфичными антигенами микобактерий.

Цель достигается путем получения латексной суспензии, растворов антигенов, полученных методами электрофореза в полиакриламидном геле и гель - хроматографии на сефакрил S-200, латексного диагностикума и постановки реакции латекс-агглютинации с сыворотками больных туберкулезом.

Сущность способа состоит в том, что получают полистирольный латексный диагностикум путем сенсибилизации латексов антигенами, полученными из M. tuberculosis, осуществляют постановку реакции латекс-агглютинации с сыворотками больных туберкулезом и здоровых доноров.

Отличительными признаками способа по изобретению являются: 1) впервые разработан способ латекс-агглютинации с антигенами микобактерий, которые обладают высокой чувствительностью и специфичностью, полученные методами электрофореза в ПААГ и гель-хроматографии; 2) разработанный способ реакции латекс-агглютинации позволяет четко дифференцировать сыворотки больных активной формой туберкулезного процесса от сыворотки других форм и здоровых доноров; 3) использованы неокрашенные полистирольные латексные частицы - белые и окрашенные жирорастворимыми красителями с различными функциональными группами - желтые (полистирол + глицидилметакрилат); 4) изучено несколько антигенных препаратов, полученных методами электрофореза в полиакриламидном геле и гель-хроматографии;
5) для сенсибилизации латексов использовали малое количество антигенов 50-100 мкг/мл;
6) для постановки реакции не требуется дорогостоящего оборудования;
7) для получения буферных растворов не требуется дорогостоящих реактивов, их используемое количество незначительно;
8) при постановке реакции латекс-агглютинации разбавитель не использован;
9) применялись неинактивированные сыворотки, их количество от одного больного составляет только 0,1 мл (малое количество);
10) для постановки реакции не требовалось применения специализированных планшет, постановка реакции осуществлялась на предметном стекле, помещенном на темный фон;
11) учет результатов реакции латекс-агглютинации осуществляли через 1 мин, т.е. сразу же после смешивания сыворотки и диагностикума при комнатной температуре.

Получение антигенов: 1 и 2 белковые фракции из M.tuberculosis штамм H37Rv. Этап 1. Культура M.tuberculosis шт. H37Rv получена из коллекции ЦНИИтуберкулеза г. Москва. После производится на 5-6 пробирок среды Левенштейна-Йенсена, культивировали 3-4 недели до появления колоний в виде "бородавок" - шероховатых - R-форма. Полученную свежую культуру рассевают на синтетическую среду Сотона (солевой р-р, аспарагин, глицерин) в колбы по 250 мл, культивируют при 37^oC в течение 3-4 недель до появления шероховатой пленки на поверхности среды. Фильтруют через стерильный бумажный фильтр и сразу обрабатывают бактериальные клетки охлажденным ацетоном (3-кратная обработка 10-12 объемами темп. -4^oC), ацетатным буфером pH 5,5, физ.р-ром (pH 7,4-7,6). Высушивали в вытяжном шкафу, получали ацетонвысушенные клетки.

Этап 2. Получение антигенов из ацетонвысушенных клеток. Механическая экстракция трис-глициновым буфером (pH 8,3) - 15 мин, центрифугирование 30 мин - 15 000 об/мин, в супернатанте определяют белок по методу Lowry O.H. et al [18] , наносят на полиакриламидный гель (ПААГ) в трубочках, осуществляют диск-электрофорез в ПААГ без SDS по Ornstein, Davis [20, 21, 22] в течение 3 ч, производят элюцию антигенов [1, 2] белковых фракций из трубочек геля (одна окрашенная - контроль), 0,85% NaCl, центрифугируют при 6000 об/мин - 20 мин - 2-3 раза, в надосадке - белковая фракция, лиофилизация. Метод Фадеевой [9].

Получение белкового антигена-3 из M.tuberculosis шт. H37Rv.

Получение ацетонвысушенных клеток как в этапе 1 (см. выше).

Этап 3. Механическая экстракция трис-HCl буфером pH 8,0 - 10 мМ, содержащим дезоксихолат натрия 0,2% и 0,15 М NaCl. Центрифугирование при 30 мин - 20000 об/мин, гель-хроматография на колонке с Сефакрил S-200, концентрация ультрафильтрацией на мембране Амикон, диализ против 10 мМ трис-HCl буфера (pH 8,0) 3 сут, лиофилизация.

Получение 1, 2 белковых фракций из M.africanum.

Методика получения ацетонвысушенных клеток и белковых фракций методом электрофореза в ПААГ аналогична получению 1, 2 белковых фракций из M.tuberculosis шт. H37Rv, экстрагировали фракции с др. относительной электрофоретической подвижностью Rf.

Характеристика белковых антигенов: 1, 2, 3 белковые фракции - внутриклеточные белки (белково-полисахаридный комплекс, углеводы - следы). M.tuberculosis штамм H37Rv,
Метод получения:
1, 2 фракция - диск-электрофореза в ПААГ, 3 фракция - гель-хроматография на сефакрил S-200.

Характеристика: 1, 2 белковые фракции M.tuberculosis.

Молекулярная масса - метод Hedrick, Smith /1968/ в модификации Бузуна /1970/ метод диск-электрофореза в ПААГ;
1 фракция - 161000-124000-79000 Да - это "триплет" с Rf = 33,8-37,7-40,1 [9].

2 фракция - 35000-29000 Да. Высокомолекулярные интенсивно окрашенные фракции ("триплет") в электрофорезе в ПААГ градиентном с SDS: мол. масса - 66896-60424-55768 Да [1].

Газожидкостная хроматография: в 1, 2 белковых фракциях обнаружены: кислота 16:0, следы углеводов - маннозы, галактозы, глюкозы. Содержание азота по Кьельдалю: 1 фракция - 6,66%, 1 фракция - 7,39%.

1 и 2 белковые фракции изучены в РСАЛ, МТИФА, ИФА, иммуноблоттинге, фагоцитозе, РБТЛ, латекс-агглютинации, пероксидазоантипероксидазном методе, кожных туберкулиновых реакциях, протективные свойства. Кожные пробы на морских свинках, обезьянах.

3 белковая фракция. Мол. масса - метод электрофореза в ПААГ с D, гель-хроматография - 30-35 КД, концентрация белка 0,4-0,9 мг/мл. Остаточная концентрация дезоксихолата натрия не превышает 0,01%.

1, 2 фракция M. africanum. Мол. массу не опред., на протеинограмме 1 фракция Rf = 38,1-45,9, 2 фракция 50-80 = Rf.

Изучены в электрофорезе в ПААГ и получены. Изучены в МТИФА, кожных туберкулиновых реакциях на обезьянах.

Характеристика стандартных препаратов РРД и вакцины БЦЖ.

1. Сухой очищенный туберкулин РРД серии 481, получен по методу Линниковой М. А. /1939/: двухмесячную культуру, выращенную на жидкой питательной среде, стерилизуют в течение часа при 100^oC. Затем фильтруют через фильтр Зейтца, добавляют 0,25% карболовой кислоты и подвергают ультрафильтрации через коллодиевый фильтр до 1/10 первоначального объема, обрабатывают 25%, а затем 10% р-ром трихлоруксусной кислоты (ТХУ), промывают спиртом 96^o - 2 раза, а затем 5-6 раз серным эфиром при центрифугировании. Очищенный туберкулин является гаптеном. Белок 82,4 ± 1,63, нуклеиновые кислоты - 5,59 ± 0,5, полисахариды, а также липиды, соли. РРД использован в концентрации: 60 мкг, 120 мкг.

Вакцина БЦЖ-серия 146 К 609. Вакцина БЦЖ получена в 1919 г. А.Кальметом и М.Гереном. Штамм вакцины БЦЖ был получен из Парижа в 1925 г. проф. Л.А.Тарасевичем. Вакцина БЦЖ (обычная) содержит 0,05 мг в 0,1 мл - 20 доз препарата. Вещества, входящие в состав - натрия глютаминат 1,5% р-р (pH 7,8). В прививочной дозе - 0,15 мг глютамината натрия.

Свойства: 1) хорошо растворима, 2) прозрачна, оптическая плотность для БЦЖ - 0,35 ± 3, 3) дисперсность - 1,5-1,8, 4) остаточная влажность - не более 5%, 5) нетоксична, 6) стерильна, 7) безвредна, 8) обладает специфической активностью: жизнеспособность БЦЖ - 10-30 млн., термостабильность - при хранении 4 недели при 37^oC - число жизнеспособных бактерий в 1 мг должно быт не менее 25% от исходного их числа. Вакцина БЦЖ использована в концентрации 50 мкг и 100 мкг.

Получение латексных частиц.

Работу по получению полимерных микросфер проводили на кафедре синтеза полимеров Московской академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова. Получены латексные частицы с эпоксидными группами. В технологическом процессе на этапе затравочной полимеризации использовали глицидилметакрилат. Это приводило к формированию на поверхности частиц эпоксидных групп.

Схема получения окрашенных полистирольных латексов с различными функциональными группами:
1) получение монодисперсных полистирольных частиц,
2) окрашивание и очистка полистирольного латекса,
3) проведение затравочной полимеризации окрашенного полистирольного латекса с глицедилметакрилатом (эпоксидные группы).

Концентрация эпоксидных групп - 50 мкМоль на 1 г полимера. Латексы белые, желтые. Краситель у желтых - судан - Sudan Orang G [10]. Размер 1,5 мкм у белых и желтых. Применение окрашенных латексов для приготовления препаратов на основе антигенов микобактерий позволило улучшить визуализацию учета результатов.

Получение антигенов: бактериальная масса выращена в туберкулезной больнице N 3 (г. Химки), бактериол. лаборатория (до 1993 г).

1, 2 белковые фракции M. tuberculosis и M.africanum получены методом диск-электрофореза на каф. микробиологии Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова (до 1993 г.).

3 белковая фракция M.tuberculosis шт. H37Rv в лаб. биотехнологии Института Иммунологии (г. Любучаны, ст. Столбовая), (до 1993 г.).

Этапы получения латексного диагностикума, постановки реакции латекс-агглютинации осуществляли следующим образом:
А) Получение латексной суспензии - использовали два латексных препарата:
а) 14,6 г полимера в 100 мл суспензии,
б) 9,1% - 9,1 г полимера в 100 мл суспензии.

Получали 1% суспензию латекса:
белые 14,6% - 1 мл латекса + 13,6 мл фосфатного буфера,
желтые 9,1% - 1 мл латекса + 8,1 мл фосфатного буфера.

Растворы отмывали фосфатным буфером (pH 8,0) по 15 мин - 2 раза при 4000 об/мин, каждый раз сливая надосадок.

Б) Антигены:
1) 1 и 2 белковые фракции, полученные из M.tuberculosis методом диск-электрофореза в ПААГ,
2) 3 фракция, полученная гель-хроматографией на сефакрил S-200, из M. tuberculosis шт. H37Rv,
3) 1 и 2 белковые фракции, полученные диск-электрофорезом в ПААГ из M. africanum,
4) стандартные препараты: РРД серия 481, вакцина БЦЖ серия 146 К 609.

Все растворы антигенов изучены в концентрациях 100 мкг/мл и 50 мкг/мл.

В) Буферные растворы:
а) 0,1 М глициновый буфер pH 7,81,
б) фосфатно-солевой буферный раствор pH 8,0.

Г) Получение латексного диагностикума: 0,5 мл раствора антигена и 0,5 мл 1% раствора латексов помещали в термостат 37^oC на 1,5 ч, затем отмывали суспензию фосфатным буфером на центрифуге по 15 мин 2 раза при 4000 об/мин. Надосадок сливали к полученному диагностикуму, добавляли 1 мл глицинового буфера, помещали в термостат на 1 ч при 37^oC, а затем в холодильник (4^oC) - выдерживали в течение ночи. Отмывали диагностикум фосфатным буфером на центрифуге по 156 мин 2 раза при 4000 об/мин, добавляли 1 мл фосфатного буфера и осуществляли постановку реакции латекс-агглютинации.

Д) Постановка реакции латекс-агглютинации: сыворотки исследованы в разведениях 1:2 до 1:256 [4] и 1:4 [16].

Всего сывороток:
а)18 сывороток больных различными формами туберкулеза: фиброзно-кавернозной, инфильтративной, диссеминированной, туберкуломы (табл. 1),
б) сыворотка донорская /пул/ - из диагностического набора Hepa Strip, HuaP medik, отрицательная контрольная сыворотка, партия 25,
г) сыворотка здорового человека,
д) сыворотка амбулаторного больного.

На предметное стекло помещали 1 каплю (0,05 мл) сыворотки и 1 каплю латексного диагностикума, перемешивали в течение 30 с - 1 мин и наблюдали реакцию латекс-агглютинации. Реакция осуществлялась при комнатной температуре.

Полученные результаты: 1) разработан способ экспресс-диагностики туберкулеза на основе реакции латекс-агглютинации,
2) сыворотки больных туберкулезом с латексным туберкулезным антигенным диагностикумом на 1 и 2 день после взятия крови дают четкую и быструю агглютинацию /4+, 3+/, а пул сывороток доноров - отрицательную,
3) более четкая и быстрая агглютинация наблюдалась с белыми латексными частицами,
4) крупнохлопчатая, быстро протекающая агглютинация наблюдалась с сыворотками больных фиброзно-кавернозной и инфильтративной формами процесса,
5) все антигены, использованные для получения латексных диагностикумов по характеру реакции латекс-агглютинации (крупнохлопчатая, четкая, быстро текущая) можно распределить в следующей последовательности: 3 фракция, 1 и 2 фракция из M.tuberculosis, РРД, 1 и 2 фракция из M.africanum вакцина БЦЖ.,
6) оптимальная концентрация антигенов - 100 мкг/мл,
7) характер агглютинации с сыворотками больных: крупнохлопчатая, среднехлопчатая, мелкохлопчатая,
8) на 1 и 2 день после взятия крови агглютинация более быстрая и более четкая, на 5 и 6 сутки сыворотки больных туберкулезом дают мелкохлопчатую агглютинацию,
9) четыре сыворотки изучены в титрах от 1:2 до 1:256 со всеми антигенными препаратами разных концентраций: 120,100, 60, 50, 35, мкг и 16 сывороток в разведении 1:4 /4+, 3+/,
10) при исследовании неразведенных сывороток жидкость мутная и агглютинация определяется нечетко,
11) с пулом сыворотки доноров - агглютинация отрицательная, жидкость мутная,
12) агглютинация с сывороткой здорового человека: белые латексы - 3 и 1 фракции M. tuberculosis /1:8-2+,1+/, желтые - 1:2,1:4-2+,1+ - агглютинация мелкохлопчатаая,
13) агглютинацию оценивали по 4-балльной системе: 4+, 3+, 2+, 1+ (табл. 2 и 3).

Список литературы:
1. Бадукшанова Н.М. //автореф. канд. дисс. "Значение белковых фракций в такосномии и идентификации клинических штаммов микобактерий", М., 1985.

2. Бадукшанова Н.М., Воробьев А.А., Гусев В.В., Рыбалкин С.П., Каурова С. Состав белкового комплекса M.africanum - Тез. докл. Всес. науч.-технич. конфер. "Современные проблемы иммунологии, биотехнологии, генной и клеточной инженерии в ветеринарной медицине". - 1990. - 5-7 дек. - с. 9-10. - Нижн. Новгород.

3. Бузун Г.А. Прикладная биохимия. - 1976. - т. 12. - N 1. - с. 118-122.

4. Воробьева З.Г., Лазовская А.Л. Лукин Ю.В. Способ выявления микобактериальных антигенов. - Горький, 1723526 A1 C 01 33/569, 13.01.89 /92/.

5. Гизатулина Н.М. Специфическая профилактика туберкулеза (вакцина БЦЖ, контроль, получение). - М., 1996. - МГУ им. М.В.Ломоносова.

6. Гизатулина Надия Мансуровна - патентообладатель. Авторы: Воробьев А. А. , Гизатулина Н.М., Хлебников Е.С., Головлев И.Р., Краснопрошина Л.И., Фадеева Н. И. , Афанасьев С.С., Гусев В.В. //Патент N 2095816 на изобретение "Способ получения антигена из клеток для создания диагностикума". Приоритет изобр-ния 22 декабря 1994 г. Зарегистрирован в Госуд. реестре изобрет-ний - 10 ноября 1997 г.

7. Линникова М.А. Очищенный протеин дериват. - Проблемы туберкулеза. - 1939. - N 12. - с. 10.

8. Линникова М.А., Лямда-Геллер Б.А. Получение высокоочищенной фракции очищенного сухого туберкулина, ее химическая и биологическая характеристика. - Проблемы туберкулеза. - 1963. - N 89. - с. 67.

9. Фадеева Н. И. , Дыхно М.М., Кочемасова З.Н., Кассирская Н.Г., и др. Выделение и изучение внутриклеточных белков туберкулезных микобактерий. М.: Жмэи. - N 12. - с. 39-42.

10. Яшина Н.В., Гукасян И.А., Фиш Н.Г., Парфенова Е.В., ... Прокопов Н. И. и др. // Иммунохимические реагенты на основе окрашенных частиц полистирольных латексов. - кн. Биомедицинские технологии. - ММА им. И.М.Сеченова. - М, 1994. - с. 68-75.

11. Cole R.V. Lazarus A.W. Hedrick H.G. // Development and Evalution of a simple latex agglutibnation test for diagnosis of tuberculosis. - Amerixan Society for microbiology. - 1972. v. 24 - N 4. p. 525-534.

12. Dubocry B. O., White F.C. // Lotex agglutination test for tuberculosis. - American review of respiratory discases. - 1966. v. 94. - N 6. - p. 914-922.

13. Gordan g., Balogh A. // Valoarea latezagglunarii in diagnosticul de laborator al tuberculozei polmonory/ - Revista sanitara militara (Bucuresti). - 1979. - v. 82. - N 2. - p. 189-192.

14. Hedrick J. L. , Smith A. // Arch. Bilochem. - 1968. - v. 126. - p. 155-158.

15. Istrate N. - Agglitination test for mycabacterial antigens in biological samples. - PCT G 01 N 33/569 AIWO 92/14154 - 20.08.92.

16. Krambovitis E, mc. Illmurray M.B., Lock P.E., Holzel H, Hendrickse W // Rapid diagnosis of tuberculous meningitidis by latex particle agglutination. - Lancet. - 1984. - N 8412. - p. 1230-1231.

17. Lefebvre R, Tibqut G, Chavoir M, Soureque B // Chromatographis pattern of acetone-extractable pool isolated from mammalian tissue gomogetates. - Advances in Medical chemistry. - 1974. v. 16. - N 1. - p. 2-12.

18. Lowry O. H., Rosebrough N, Farr A. // Protein veasuremetn with the Folin-phenol reagent. - J. Biol. Chem. - 1951. - v. 193. - p. 265-275.

19. Mauch H, Wagner S. Sonneborn H.H., Horn J. // Verfahren zum immunologischen Nachweis von myrobarterien im sputum sowie monorlonale Antirorper zur Durchfuhrung des Verfahrens. - C 01 N 33/569/540-1) EP 0273/333/A2 - 02.01.87 г. A3 - это технологическая лицензия.

20. Ornstein L, Davis B // Bortlag vor "The socierty of the study of blood". - Bull. N.Y. Acad. Med. - 1959. - v. 24. - p. 3-11.

21. Orstein L // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 1964. - v. 121. - p. 321.

22. Davis B // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 1964. - v. 121. - p. 424.

Формула изобретения

Способ экспресс-диагностики туберкулеза посредством постановки реакции латекс-агглютинации, включающий инкубирование исследуемой сыворотки крови с полистирольным латексом, сенсибилизированным антигеном клеток микобактерий, отличающийся тем, что неинактивированную сыворотку крови инкубируют с полистирольным латексом или полистирольным латексом с функциональными группами, сенсибилизированным антигеном ацетонвысушенных клеток микобактерий, полученным методами диск-электрофореза в полиакриаламидном геле или гель-хроматографии на сефакриле, при этом в качестве указанного антигена используют внутриклеточную цитоплазматическую белковую фракцию, выбранную из группы, включающей первую белковую фракцию из M.tubereulosis штамм H₃₇Rv с молекулярной массой 161000-124000-79000 Дальтон, вторую белковую фракцию из M.tubereulosis штамм H₃₇Rv с молекулярной массой 35000-29000 Дальтон, третью белковую фракцию из M. tubereulosis штамм H₃₇Rv с молекулярной массой 30000-35000 Дальтон, а также первую белковую фракцию из M.africanum c Rf, равным 38,1 - 45,9, и вторую белковую фракцию из M.africanum c Rf, равным 50-80, стандартным препаратом РРД и вакциной БЦЖ.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2