Способ моделирования легочного сапа

 

Изобретение относится к микробиологии. В качестве экспериментальных животных используют белых мышей линии BALB/c, близких к человеку по видовой резистентности к сапу. Заражают их 30 ЛД₅₀ штамма возбудителя сапа Ц-5, адаптированного к организму мышей путем многократных пассажей на данном виде животных в динамической аэрозольной камере диаметром 0,29 м при скорости воздушного потока 0,5 м/с, производительности генератора аэрозолей по воздуху 30 л/мин, по жидкости 1,5 мл/мин, времени заражения 5 мин, концентрации бактериальной суспензии, взятой для распыления, 10⁹м.кл./мл. Воспроизведена острая форма легочного сапа, патогенез которого близок к механизму развития сапа у человека, разработанная биологическая модель может быть использована для экспериментального изучения широкого круга научно-практических вопросов, в частности отработки схемы ранней лабораторной диагностики легочного сапа. 1 табл.

Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам моделирования первичной легочной формы сапа.

Сап относится к особо опасным инфекционным заболеваниям, характеризующимся тяжелым клиническим течением, трудностями дифференциальной диагностики, специфической профилактики и лечения. По этим показателям, а также уровню летальности, легочная форма сапа, возникающая в результате аспирации бактериального аэрозоля, среди других клинических проявлений болезни занимает особое место. Экспериментальное решение вопросов, связанных с разработкой методов и средств диагностики, лечения и профилактики легочного сапа вызывает необходимость создания адекватных поставленным задачам и наиболее приближенных к человеку биологических моделей.

Известен способ моделирования острой формы легочного сапа на золотистых хомячках (Rosebury T.E. Experimental air-borne infection.- Baltimore: Williams a. Wilkins Co., 1947. - 222 p.). Однако из-за высокой чувствительности этих животных к сапу патогенез заболевания имел существенные отличия от развития инфекции у человека. Кроме того, у выживших хомячков не отмечалось признаков перенесенной болезни, что не позволяло проводить исследования по изучению иммунного статуса макроорганизма. Животные оказались малопригодными для оценки эффективности вакцин и терапевтических средств.

Наиболее близким и до сегодняшнего дня считающимся оптимальным способом воспроизведения легочного сапа является использование в качестве экспериментальных животных морских свинок, хотя эти разработки выполнены еще в 40-х годах этого столетия (Studies on certain biological characteristics of Malleomyces mallei and Malleomyces pseudomallei. II. Virulence and infectivity for animals /W.R.Miller, L.P.Pannel, L.Cravits et al.// J.Bacteriol. - 1948. - Vol.55, N 1. - P. 127-135.). Несмотря на то, что морские свинки более устойчивы к сапной инфекции, чем золотистые хомячки, тем не менее обладают достаточно высокой чувствительностью к заражению возбудителем сапа, что не позволяет считать этот вид лабораторных животных адекватной моделью. Своеобразие патогенеза сапа у морских свинок и отличие его при заболевании у людей, вероятно, объясняет такой факт, как отсутствие закономерности "доза-эффект" при воспроизведении инфекционного процесса у животных, что затрудняет интерпретацию результатов экспериментов.

Есть основания считать, что адекватная модель легочного сапа может быть получена на животных, близких по видовой резистентности к человеку, который маловосприимчив к сапу. По этому признаку лабораторные белые мыши наиболее полно соответствуют указанному требованию, а относительно низкая стоимость их и доступность для большинства экспериментаторов делают выбор этих животных предпочтительным.

Попытки использования белых мышей для моделирования сапной инфекции предпринимались и ранее (Дорофеев А. Н. Распределение животных по степени восприимчивости сапа/Ветеринария. - 1941, N 6. - С. 6 - 10). Однако из-за низкой восприимчивости животных к сапу заражение или не давало результатов, или при введении больших доз возбудителя сапа животные погибали в короткие сроки от интоксикации, без развития специфического инфекционного процесса. В этих экспериментах были использованы типичные штаммы сапного микроба, патогенные для некоторых видов лабораторных животных, за исключением белых мышей, и применялись парентеральные способы заражения.

Целью настоящего изобретения является создание биологической модели легочного сапа, позволяющей наиболее полно воспроизвести патогенез реального заболевания у человека, а также получать однотипные и воспроизводимые результаты.

Для достижения поставленной цели белых мышей линии BALB/с заражали штаммом P. mallei Ц-5, адаптированного к организму мышей путем многократных пассажей на данном виде животных. Величина ЛД₅₀ шатамма P.mallei Ц-5 для белых мышей при аэрогенном способе заражения составила 34,4 (24,7-47,8) ж.м. кл. Линейность белых мышей (BALB/с) обеспечивала однотипность и воспроизводимость результатов эксперимента.

Проведено сравнительное изучение возможности моделирования на линейных белых мышах легочной формы сапа аэрогенным способом заражения типичным и адаптированным штаммами P.mallei Ц-5. Животных инфицировали в горизонтальной динамической аэрозольной камере с длиной рабочего участка канала 2,0 м и диаметром 0,29 м при следующих технических условиях: скорость воздушного потока в установке - 0,5 м/с, производительность пневматического генератора аэрозоля по воздуху - 30 л/мин, по жидкости - 1,5 мл/мин, фракционно-дисперсный состав (ФДС) аэрозоля - 70 - 80% частиц диаметром до 3,0 мкм, время экспозиции животных в аэрозоле - 5 мин. Концентрация суспензии 24-часовой агаровой культуры возбудителя сапа составляла 10⁹ м.кл./мл, что позволяло при заданных технических параметрах эксперимента получать животным аспирационную дозу инфекта, равную 30 ЛД₅₀.

У белых мышей, зараженных типичным штаммом возбудителя сапа, признаков развития легочного сапа не отмечено. Срок наблюдения - 60 дней.

Аэрогенное заражение линейных белых мышей возбудителем сапа, адаптированного к этому виду животных, вызывало у них остро протекающую легочную форму сапа, основные этапы развития которого характеризовались следующими особенностями: 1. Начальный период заболевания - первые двое суток. Период адаптации инфекта к внутренней среде макроорганизма, развитие патологических процессов на клеточном уровне в легочной ткани в первые часы после заражения. Размножение возбудителя сапа в месте внедрения и как следствие - нарастание патологических явлений в верхних дыхательных путях и органах системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ). В легких - формирование пневмонических очагов, в печени и селезенке - начальные стадии воспалительных реакций.

2. Генерализация инфекции - третий день заболевания. Диссеминация возбудителя сапа в макроорганизме, бактериемия, бактериурия. В легких - сформировавшиеся очаги гнойной бронхопневмонии, в печени и селезенке - образование гранулем экссудативного характера, являющихся специфическим патоморфологическим элементом сапного инфекционного процесса. Начало дегенеративных процессов в других органах.

3. Терминальная стадия - четвертые - седьмые сутки. Полная обсемененность макроорганизма сапными бактериями, токсемия. Усиление явлений гнойного воспаления в легких, вплоть до гистолиза ткани, процессы некробиоза и гистолиза в органах СМФ, расстройство гемодинамики и дистрофические изменения в миокарде и почках, трахеит. Смерть животных наступала от гнойной бронхопневмонии и нарастающих явлений, характерных для септикопиемического процесса.

Острая форма сапа у человека, в отличие от хронического течения, встречается значительно чаще. Причем независимо от входных ворот инфекции отмечается первичность поражения легких и регионарных лимфатических узлов (Абрикосов А. И. //Частная патологическая анатомия. - М., 1947. - С. 426 - 480). Аналогичное развитие начальной стадии заболевания наблюдали у линейных белых мышей в поставленном эксперименте. В дальнейшем, если первичный патологический комплекс не локализован, наступает стадия генерализации инфекционного процесса у человека, имеющая те же характерные признаки, что и у линейных белых мышей с легочной формой сапа. Изучение патоморфогенеза экспериментального легочного сапа и сравнение его с изменениями клеток при сапе у человека показало сходство специфических поражений тканей и органов макроорганизма - образование гранулем, как правило, экссудативного характера и неспецифических проявлений общеинфекционной патологии - некротические, дистрофические процессы, расстройство гемодинамики. Полученные результаты дают основание считать, что разработанная на линейных белых мышах модель легочного сапа по своим патогенетическим особенностям соответствует развитию сапа у человека и может быть с большей эффективностью, чем известные ранее биомодели, использоваться для решения широкого круга научно-практических вопросов прикладного характера, в частности, отработки схемы ранней лабораторной диагностики легочного сапа.

Линейных белых мышей заражали аэрозолем адаптированного штамма P.mallei Ц-5 дозой, равной 30 ЛД₅₀ при условиях, описанных ранее. В различные сроки после заражения кровь, мочу, смыв с носоглотки животных исследовали бактериологическим и экспрессными методами иммунодиагностики. Установлено, что сапные антигены в сыворотке крови животных были обнаружены с помощью ТИФА и ХЛИА в 100% проб уже через 4 ч после заражения, РНГА была положительной в 20% проб крови (таблица). Через 10 ч после заражения методами ТИФА, ХЛИА и РНГА антигены были определены в смывах из носоглотки, крови и моче, а из смывов, взятых в те же сроки и через сутки, была выделена культура возбудителя сапа. В последующие дни заболевания диагностика сапа не вызывала затруднений.

Таким образом, использование предлагаемой биомодели легочного сапа позволило определить эффективность различных методов ранней лабораторной диагностики сапа, а также целесообразность исследования отдельных видов клинического материала. Результаты исследования показали, что с помощью указанных методов можно уже в первые часы после контакта животных с бактериальным аэрозолем и в инкубационном периоде заболевания поставить правильный диагноз, что дает основание рекомендовать конкретную схему лабораторной диагностики для практического применения.

Пример 1. Группу из 20 белых мышей линии BALB/с заражали в горизонтальной динамической аэрозольной камере с длиной рабочего участка канала 2,0 м и диаметром 0,29 м типичным штаммом P.mallei Ц-5 при следующих технических и биологических условиях: скорость воздушного потока - 0,5 м/с, производительность генератора аэрозоля по воздуху - 30 л/мин, по жидкости - 1,5 мл/мин, ФДС аэрозоля - 70 - 80% частиц диаметром до 3,0 мкм, время экспозиции животных - 5 мин, концентрация суспензии 24-часовой агаровой возбудителя сапа в сахарозо-глицериновой смеси - 10⁹ м.кл./мл. Аспирационная доза инфекта, получаемая каждым животным, составляла величину, равную 1032 (741-1434) ж.м. кл. , что соответствовало 30 ЛД₅₀. При наблюдении за животными в течение 60 дней и исследовании взятого от них материала признаков развития легочного сапа не отмечено.

Пример 2. Группу из 20 белых мышей линии BALB/с заражали штаммом P. mallei Ц-5, адаптированным к организму мышей путем многократных пассажей на данном виде животных при условиях, описанных в в примере 1. У линейных белых мышей возникала остро протекающая легочная форма сапа, механизм развития которого был аналогичен патогенезу сапа у человека, включая начальный период заболевания, стадию разгара инфекционного процесса и терминальную. Показано сходство специфических для сапа и общеинфекционных проявлений патоморфогенеза. Линейность белых мышей обеспечивала однотипность и воспроизводимость результатов. Разработанная модель легочного сапа рекомендована для экспериментального изучения различных научно-практических вопросов прикладного характера.

Пример 3.

Группу из 80 белых мышей линии BALB/с заражали адаптированным штаммом P. mallei Ц-5 при условиях, описанных в примере 1. В различные сроки после аэрогенного заражения (4-10 ч-1-2 сутки и т.д.) по 10 животных умерщвляли, а взятый от них клинический материал - смыв с носоглотки, кровь и мочу исследовали бактериологически, посевом на чашки с агаром, приготовленном на основе гидролизата казеина с 3 - 5% глицерина (pH 6,9). Из крови отделяли сыворотку, которую инактивировали 30 мин при 56^oC, в смыв из носоглотки и мочу добавляли формалин до конечной концентрации 1%, после чего пробы исследовали экспрессными методами иммунодиагностики - ТИФА, ХЛИА, РНГА, ИФА. Правильный лабораторный диагноз заболевания оказалось возможным поставить уже через 4 - 10 ч после заражения животных и подтвердить его выделением культуры возбудителя из материала (смыв с носоглотки), взятого в те же сроки (10 ч).

Таким образом, используя предлагаемый способ удалось разработать схему ранней лабораторной диагностики легочного сапа, позволяющую еще до развития клинических симптомов, установить этиологию заболевания, что имеет важное значение для выбора тактики лечебных и профилактических мероприятий.

Формула изобретения

Способ моделирования легочного сапа, включающий аэрогенное заражение животных возбудителем сапа, отличающийся тем, что в качестве экспериментальных животных используют белых мышей линии BALB/с, заражают их 30 ЛД₅₀ (ЛД₅₀ = 34,4 ж.м.кл.) штамма сапного микроба, обладающего высокой патогенностью для данного вида животных, в динамической аэрозольной камере диаметром 0,29 м при скорости воздушного потока 0,5 м/с, производительности генератора аэрозолей по воздуха 30 л/мин, по жидкости 1,5 мл/мин, времени заражения 5 мин, концентрации бактериальной суспензии, взятой для распыления, 10⁹ м.кл./мл.

РИСУНКИ

Рисунок 1