Диетическая абсорбируемая композиция, способная улучшать биологическое равновесие флоры кишечного тракта

 

Изобретение относится к медицине и касается диетической абсорбируемой композиции, способной улучшать биологическое равновесие флоры кишечного тракта. Сущность изобретения состоит в обезвоженном препарате, включающем пропионовокислые бактерии и двураздельные бактерии в количестве по крайней мере 10⁹ клеток/г, предпочтительно 10¹⁰ - 10¹² клеток/г. Изобретение позволяет ввести в препарат двураздельные бактерии, позволяющие улучшить биологическое равновесие кишечного тракта. 7 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к диетической абсорбируемой композиции, способной улучшать биологическое равновесие флоры кишечного тракта человека и млекопитающих.

Хорошо известно, что содержимое кишечного тракта человека, которое соответствует приблизительно 1-1,5 кг пищевых веществ, в процессе пищеварительной трансформации, включает значительную популяцию микроорганизмов, которая может быть оценена примерно как 10¹⁰ клеток/г в ободочной кишке.

Эту популяцию разделяют на различные группы бактерий, некоторые из которых являются безвредными или благоприятными, тогда как другие, в особенности относящиеся к бактериям кишечной группы микроорганизмы и гнилостные бактерии, приводят к продуцированию токсичных веществ и отрицательно влияют на здоровье.

Однако, в особенности начиная с двадцатого века, в различных работах пытались показать, что присутствие значительной популяции молочнокислых бактерий очень сильно ограничивает развитие гнилостных видов и, следовательно, продуцирование этих токсичных веществ.

Таким образом, совершенно естественно было предложить введение в организм значительной популяции этих бактерий, либо используя особую пищу, либо путем прямого введения (в желудок) этих бактериальных клеток; из возможной молочнокислой флоры особенно было рекомендовано введение следующих, указанных в качестве не ограничивающего объема охраны изобретения примера бактерий: Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus или еще Streptococus faecium.

Тем не менее, это введение не позволило достичь ожидаемых результатов, потому что, с одной стороны, популяция бактерий кишечного тракта представляет собой систему, равновесие в которой очень трудно модифицировать, и, с другой стороны, установлено, что потребление молочнокислых бактерий оказывает только незначительное влияние на гнилостную флору, которая вызывает известные недомогания и затруднения.

Сравнительно недавно, то есть в течение десятилетия 1970-1980, также было предложено вводить в человеческое питание немолочнокислые виды бактерий двураздельного типа, которые, как показано, способны представлять интерес для здоровья. Такие ферменты можно потреблять, либо используя молочные десерты или другие молочные продукты, сквашенные частично двураздельной флорой, либо путем прямого введения (в желудок) упакованных для этой цели живых клеток.

Такое введение, однако, не оправдывает надежд при использовании, поскольку экзогенным двураздельным бактериям с трудом удается прочно внедриться в кишечник человека, особенно в случаях, когда кишечное равновесие не из лучших.

С учетом вышесказанного, целью настоящего изобретения является стремление найти средство, позволяющее улучшать популяцию двураздельных бактерий.

При этом были приняты во внимание работы профессора Генри Беррена из Лилля, который установил, что пропионовая кислота представляет собой специфический селективный и элективный элемент флоры двураздельных бактерий.

Однако известно, что эта органическая кислота является одним из продуктов, образующихся в результате ферментации, особенно лактата, с помощью особого типа бактерий пропионовокислых бактерий, которые, хотя и не принадлежат к группе молочнокислых бактерий, тем не менее присутствуют в питании человека уже столетия; в частности, они являются бактериями, которые позволяют получать глазки во время изготовления сыра, называемого "эмментальским"; в самом деле, в конце созревания эти сыры содержат пропионовокислых бактерий около 10⁹ клеток/г.

Следует заметить, что, кроме пропионовой кислоты, ферментация при использовании пропионовокислых бактерий, между прочим, приводит к образованию уксусной кислоты и диоксида углерода. Параллельно этим работам, согласно публикации Tsutomu Kaneko, Hiroharu Mori, Megumi lwata и Sachiki Meguro "Growth stimulator for Bifidobacteria Produced by Propionibacterium freudenreichii and Several Intestinal Bacteria", J. Dairy Sci., 77, 393-404 (1994), установлено, с одной стороны, что пропионовокислые бактерии, и особенно бактерии типа Propionibacterium freudenreichii, могут продуцировать фактор роста двураздельных бактерий, и, с другой стороны, что жирные кислоты с короткой цепью и, в частности, пропионовая кислота оказывают очень значительное ингибирующее воздействие на рост многочисленных нежелательных кишечных бактерий, но стимулируют рост двураздельных бактерий.

Также, согласно заявке на патент Японии 07227207, уже было предложено добавлять пропионовокислые бактерии к продуктам питания, особенно к кисломолочному продукту, содержащему двураздельные бактерии, с целью улучшения выживания этих бактерий.

Кроме того, следует заметить, что из заявки на патент США 4806368 известна диетическая таблетка на основе пищевых волокон, в особенности яблочных волокон, которая может включать двураздельные бактерии и, кроме того, меньшее количество пропионовокислых бактерий, действующая в качестве противогрибкового средства.

С учетом этих предварительных сведений, целью согласно изобретению является попытка прямого применения, и в большом количестве, двураздельных и пропионовокислых ферментов вместе в форме готовой к употреблению разовой дозы, которую можно легко проглатывать.

Итак, понятно, что такая абсорбция оказывается полностью благоприятной и позволяет, в частности, в значительной степени уменьшать обычные пагубные воздействия гнилостных бактерий, даже несмотря на возможный обратный эффект, если учесть значительное выделение диоксида углерода в результате пропионовокислой ферментации как свидетельство роли этих ферментов в образовании глазков сыров.

Следовательно, предметом изобретения является абсорбируемая диетическая композиция, способная улучшать биологическое равновесие флоры кишечного тракта человека и млекопитающих, отличающаяся тем, что она образована обезвоженным препаратом, включающим пропионовокислые бактерии и двураздельные бактерии в количестве, по крайней мере, 10⁹ клеток/г и предпочтительно порядка 10¹⁰ - 10¹² клеток/г, что соответствует очень высокой концентрации бактерий.

Этими бактериями, в общем случае, являются живые бактерии, однако они могут представлять собой также и убитые бактерии при условии, чтобы при этом был сохранен их ферментативный потенциал.

Эти бактерии предпочтительно состоят от 80 до 99% из пропионовокислых бактерий и от 20 до 1% из двураздельных бактерий.

Композиция согласно изобретению, следовательно, предпочтительно включает в среднем в десять раз больше пропионовокислых бактерий, чем двураздельных бактерий.

Используемые двураздельные бактерии принадлежат, в общем, к виду Bifidobacterium и предпочтительно их выбирают среди штаммов В. bifidum, В. longum, В. adolescentis, В. breve, В. infantis и В. pseudolongum.

Вообще пропионовокислые бактерии относятся к видам Propionibacterium freudenreichii или Propionibacterium shermanii или Propionibacterium thoenii или Propionibacterium jensenii или Propionibacterium acidipropionici.

Эти бактерии могут быть использованы в виде индивидуального штамма или предпочтительно в виде смеси штаммов; в случае пропионовокислых бактерий предпочтительно сочетать одновременно сильно аутолитические штаммы с малоаутолитическими штаммами.

Изобретение относится также к использованию обезвоженного препарата, включающего пропионовокислые бактерии в количестве, по крайней мере, 10⁹ клеток/г, предпочтительно порядка 10¹⁰ - 10¹² клеток/г, для получения диетической абсорбируемой композиции, способной улучшать биологическое равновесие флоры кишечного тракта человека и млекопитающих и в особенности повышать популяцию двураздельных бактерий.

Следует заметить, что эта популяция двураздельных бактерий может происходить либо от эндогенных бактерий, либо от экзогенных бактерий, добавляемых к препарату.

Эта композиция предпочтительно находится в виде индивидуальных фракций массой примерно от 100 мг до 1 г, предпочтительно 200-500 мг, включающих дозу бактерий для ежедневного приема.

Эти фракции можно прямо вводить (проглатывать) или их можно предварительно разбавлять жидкостью; они могут быть упакованы в любой форме, позволяющей облегчать абсорбцию: таблетки, пакетики с гранулированным или нет порошком.

Подтверждено, что в таких обезвоженных концентрированных препаратах пропионовокислых бактерий, хранившихся два года при температуре 4^oC, концентрация бактерий снижается меньше, чем на один Log.

Эксперимент показывает, что устойчивые или нет к кислоте желудочного сока желатиновые капсулы соответствуют особенно предпочтительному типу упаковки.

Согласно другой характеристике изобретения, каждая индивидуальная фракция содержит, по крайней мере, 10⁹ бактерий и предпочтительно - порядка 10¹⁰ - 10¹² бактерий.

Следует заметить, что ниже порога 10⁹ бактерий эффект ненадежный, что, по всей вероятности, является результатом того, что бактерии тогда погибают из-за желудочной кислотности или вследствие воздействия солей желчных кислот до их попадания в ободочную кишку.

Согласно изобретению, следовательно, предлагается ежедневный прием человеком в качестве пищевой добавки дозы пропионовокислых бактерий, соответствующей примерно тысячной доле всей флоры кишечного тракта (которая составляет около 10¹⁴ единиц), что соответствует количеству, определенно большему предложенного раньше для бактерий другого типа.

Подтверждено, что такое введение согласно изобретению исключает любое пагубное воздействие и, кроме вышеуказанных преимуществ, имеет следствием: - заметное снижение эмиссии типичных, плохо пахнущих газов за счет гнилостных бактерий; - изменение цвета и запаха испражнений.

Эти данные четко указывают на природу "симбиотической" активности пропионовокислых бактерий и двураздельных бактерий, причем пропионовокислые бактерии стимулируют развитие двураздельных бактерий.

Этот результат подтверждается исследованием, осуществляемым с целью выяснения, могут ли штаммы Propionibacterium либо улучшать скорость внедрения штамма Bifidobacterium bifidum в кишечный тракт мыши, либо повышать уровень его активности в различных сегментах кишечного тракта.

Это исследование, во-первых, показывает, что невозможно достоверно определить Propionibacterium в кишечном тракте мыши, даже в отсутствие микробов, то есть в отсутствие пищеварительной флоры.

Зато показано, что введение Propionibacterium в виде культуры в питьевую воду этих мышей позволяет стимулировать скорость внедрения штаммов Bifidobacterium bifidum в кишечный тракт.

Это научное исследование, следовательно, доказывает, что действительно существует синергизм между воздействиями пропионовокислых бактерий и двураздельных бактерий.

Эти результаты, кроме того, можно подтвердить исследованиями, с одной стороны, ин виво на здоровых людях, и, с другой стороны, ин витро.

Исследования ин виво.

Их проводят с целью изучения в больничной среде Университетского Госпитального Центра в Кане выживаемости и/или внедрения штаммов пропионовокислых бактерий в кишечную среду и их воздействие на флору двураздельных бактерий группы из девятнадцати здоровых субъектов-добровольцев мужского пола.

Согласно эксперименту каждый доброволец в течение двух недель ежедневно проглатывает желатиновую капсулу, содержащую 5·10¹⁰ пропионовокислых бактерий, селекционированных Национальным институтом агрономических исследований и происходящих из банка штаммов, используемых в сыродельной промышленности, следовательно, совершенно безвредных для человека.

Вводимые пропионовокислые бактерии подразделяются на два штамма примерно по 50% каждого, причем один из этих штаммов мало подвержен автолизу, тогда как другой подвергается автолизу на уровне желудка и в начале тонкой кишки под действием солей желчных кислот.

Изучение фекальной флоры осуществляют на образце испражнений до приема пропионовокислых бактерий с целью выяснения базального состояния флоры, в процессе приема препарата и после него с целью определения продолжительности выживания экзогенных бактерий в кишечном тракте субъектов-добровольцев.

Это изучение включает подсчет вводимых пропионовокислых бактерий и двураздельных бактерий.

В результате этих исследований обнаружено, что популяция пропионовокислых бактерий в испражнениях значительно повышена, начиная с первого отбора пробы пропионовокислых бактерий, но что этот эффект временный и становится незначительным после прекращения введения бактерий.

Эти результаты показывают, что фракция штаммов пропионовокислых бактерий может сохраняться в кишечном тракте человека, но что они не могут туда прочно внедряться.

Для определения воздействия пропионовокислых бактерий на популяцию двураздельных бактерий также проводят отборы проб, осуществляемые до введения пропионовокислых бактерий (a), во время этого введения (б) и после него (два отбора проб (в и г), осуществляемые с интервалом в неделю).

Следует заметить, что отбор пробы (б) соответствует среднему из двух отборов, осуществляемых с интервалом в неделю.

Подсчет Bifidobacteries позволяет рассчитать средние величины (в Log) популяции во время этих четырех периодов.

Таким образом находят средние значения, соответствующие 8,40 (а); 8,90 (б); 9,43 (в) и 8,89 (г). Эволюцию во времени изучают с помощью непараметрического статистического теста для спаренных популяций (тест Wilcoxon Matched и Signed-Ranks). Он показывает, что во время введения пропионовокислых бактерий (отбор б) популяция двураздельных бактерий значительно увеличивается по отношению к базовому числу (отбор а) (p = 0,0096) и остается повышенной по отношению к первому контролю (отбор в) после прекращения их введения (p = 0,031). Нет различия между подсчетом Bifidobacteries во время поступления пропионовокислых бактерий (отбор б) и первым контролем после прекращения их введения (1 неделя) (отбор в) (p = 0,19); популяция Bifidobacteries уменьшается во втором контроле (отбор г) (p = 0,049) по сравнению с первым контролем после прекращения введения (отбор в) и возвращается на уровень, предшествующий введению пропионовокислых бактерий (отбор а) (p = 0, 25), между вторым контролем (отбор г) и предыдущим отбором (отбор в).

Эти результаты показывают, что введение в повышенной дозе пропионовокислых бактерий благоприятствует развитию флоры двураздельных бактерий; этот эффект быстрый, наблюдаемый с первой недели, и устойчивый, по крайней мере, в течение недели после прекращения введения пропионовокислых бактерий.

Исследования ин витро.

Целью этих исследований является: - изучение резистентности пропионовокислых бактерий при пищеварительном "стрессе", то есть в условиях желудочной кислотности и в присутствии солей желчных кислот; - изучение влияния культур пропионовокислых бактерий на рост двураздельных бактерий; - охарактеризовывание в желательном случае агента, ответственного за это влияние.

Резистентность пропионовокислых бактерий к пищеварительному "стрессу".

Между их введением и их поступлением в ободочную кишку, где они вступают в контакт с кишечными бактериями и особенно с двураздельными бактериями, пропионовокислые бактерии подвергаются некоторому количеству "стрессов", неблагоприятных для их выживания, основными из которых являются желудочная кислотность и контакт с солями желчных кислот в тонкой кишке.

Для определения резистентности пропионовокислых бактерий к этим "стрессам" выбирают два штамма, относящихся к виду Propionibacterium freudenreichii, а именно штамм LS 410, который является малочувствительным к автолизу, и штамм LS 2501, который сильно подвержен автолизу.

У человека желудочное значение pH после поступления пищевого комка составляет 2-3 и среднее время опорожнения желудка порядка 90 минут.

Для оценки резистентности вышеуказанных штаммов к кислотности желудка, следовательно, их испытывают при различных значениях pH (2, 3 и 4) в течение 90 минут при 37^oC.

Обнаружено следующее: - при pH 4 жизнеспособность обоих штаммов не ухудшается; - при pH 3 штамму LS 410 не наносится ущерб, однако штамм LS 2501 имеет незначительное снижение жизнеспособности; - при pH 2 оба штамма почти полностью погибают после 90-минутного времени инкубации.

Резистентность обоих штаммов к солям желчных кислот при температуре 37^oC оценивают, выбирая концентрации желчных кислот 1, 2 и 5 г/л, соответствующие по существу концентрации на входе в тонкую кишку.

Эти исследования позволяют установить, что при более слабой концентрации (1 г/л) штамм LS 410 остается полностью резистентным даже спустя 5,5 часов времени инкубации. Однако штамм LS 2501 имеет худшую резистентность.

В присутствии 2 и 5 г/л солей желчных кислот жизнеспособность обоих штаммов отчетливо уменьшается, причем штамм LS 2501 является более чувствительным, чем штамм LS 410.

В заключение, эти исследования показывают, что оба изученных штамма обладают большой резистентностью по отношению к умеренным пищеварительным "стрессам". Однако в условиях повышенных "стрессов" преобладающая часть бактерий не является резистентной, причем сильно подверженный автолизу штамм (LS 2501) является более чувствительным.

Эти результаты показывают необходимость для достижения заметного воздействия на биологическое равновесие флоры кишечного тракта человека введения значительного количества бактерий для обеспечения достаточной выживаемости штаммов на входе в ободочную кишку.

Влияние культур пропионовокислых бактерий на рост двураздельных бактерий.

Для проведения этих исследований два штамма двураздельных бактерий, В. longum и В. bifidum, высевают в среду, содержащую 50%: 50%: - культуральный бульон, применимый для роста двураздельных бактерий;
- культуру пропионовокислых бактерий (штаммы LS 410 или LS 2501) либо молодых (48 часов), следовательно, малолизированных, либо в возрасте 11 дней, следовательно, сильно лизированных, что особенно касается чувствительности к автолизу штамма LS 2501.

Таким образом обнаруживают, что присутствие молодой культуры LS 410 и, в меньшей степени, LS 2501 приводит к повышению уровня полной популяции В. bifidum в конце фазы экспоненциального роста: число жизнеспособных бактерий в 3-4 раза выше в присутствии LS 410 и в 2-3 раза выше в присутствии LS 2501.

Что касается В. longum, то в присутствии культуры LS 410 в конце фазы роста имеется в 2 раза более высокая популяция В. longum.

В случае более старых по возрасту культур можно наблюдать строго благоприятное воздействие обоих штаммов на рост В. bifidum во время фазы экспоненциального роста (популяция в 2-3 раза выше).

В заключение, оба вида пропионовокислых бактерий, испытываемых при этом исследовании, оказывают влияние на рост В. bifidum. Их воздействие различно в зависимости от возраста культуры: молодые культуры вызывают увеличение выживаемости двураздельных бактерий в конце роста, приводя к конечным популяциям, в 2-3 раза более значительным (более заметное воздействие LS 410), тогда как более старые культуры оказывают воздействие только в начале роста, уменьшая время генерации, но без модификации уровней конечной популяции.

Характеристика агента, ответственного за бифидогенный эффект.

Влияние супернатантов культуры пропионовокислых бактерий.

Роль пропионовой кислоты.

Проводят эксперименты, подобные вышеуказанным, используя, с одной стороны, только культуральные супернатанты, образующие внеклеточную фракцию бактерий, и, с другой стороны, контрольную среду, дополненную пропионовой кислотой.

Таким образом обнаружено, что по сравнению с контролем культуральные супернатанты пропионовокислых бактерий оказывают строго стимулирующее воздействие на рост В. bifidum (в 3-4 раза больше жизнеспособных бактерий после культивирования в течение 9 часов); это воздействие более заметно в конце фазы роста при использовании штамма LS 2501.

Подтверждено, что эти промоторные эффекты возникают отчасти вследствие влияния пропионата. Однако оказывается, что пропионат не является единственным ответственным за эти эффекты, особенно в случае штамма LS 2501.

Пропионовая кислота также оказывает стимулирующее влияние на метаболическую активность В. longum.

Влияние внутриклеточной среды.

Обнаружено, что присутствие внутриклеточной среды обоих штаммов пропионовокислых бактерий вызывает последующее увеличение оптической плотности и сухой клеточной массы обоих видов двураздельных бактерий. Однако эти эффекты не коррелируют с увеличением роста В. bifidum или В. longum, если учесть, что их жизнеспособность, так же, как их метаболическая активность, во время фазы роста не изменяется.

Влияние изолированных стенок:
Обнаружено, что изолированные стенки пропионовокислых бактерий, гидролизованные или нет, не оказывают влияния на рост В. longum и В. bifidum.

В заключение, промоторный эффект пропионовокислых бактерий в отношении роста двураздельных бактерий не связан ни с их внутриклеточным содержимым, ни со стенками. Ответственные соединения локализованы главным образом во внеклеточной среде. Пропионат соответствует одному из этих соединений.

Формула изобретения

1. Обезвоженный препарат, содержащий пропионовокислые бактерии в количестве по крайней мере 10⁹ клеток/г, предпочтительно около 10¹⁰ - 10¹² клеток/г, пригодный для получения диетической абсорбируемой композиции, способной улучшать биологическое равновесие флоры кишечного тракта человека и млекопитающих, стимулируя развитие двураздельных бактерий в кишечнике.

2. Препарат по п.1, отличающийся тем, что композиция включает двураздельные бактерии.

3. Препарат по п.2, отличающийся тем, что композиция включает 80 - 99% пропионовокислых бактерий и 20 - 1% двураздельных бактерий.

4. Препарат по любому из пп.1 - 3, отличающийся тем, что пропионовокислые бактерии принадлежат к вину Propionibacterium freudenreichii, или Propionibacterium shermanii, или Propionibacterium thoenii, или Propionibacterium jensenii, или Propionibacterium fcidipropionici.

5. Препарат по любому из пп.2 - 4, отличающийся тем, что двураздельные бактерии принадлежат к виду Bifidobacterium и их выбирают среди штаммов B. bifidum B.longum, B.abolescentis, B.breve, B.infantis и B.pseudolongum.

6. Препарат по любому из пп.1 - 5, отличающийся тем, что композиция находится в виде индивидуальных фракций массой примерно от 100 мг до 1 г, предпочтительно 200 - 500 мг, включающих дозу бактерий для ежедневного приема.

7. Препарат по п.6, отличающийся тем, что композиция находится в форме желатиновых капсул.

8. Препарат по п.6 или 7, отличающийся тем, что каждая индивидуальная фракция содержит по крайней мере 10⁹, предпочтительно около 10¹⁰ - 10¹² бактерий.