Способ формирования гепаринизированной поверхности

 

Изобретение относится к области биологии, в частности биохимии. Способ формирования гепаринизированной поверхности, заключающийся в последовательном нанесении водных растров красителя метиленового синего (толуидинового синего) и гепарина на поверхность, способную адсорбировать или химически связывать молекулы красителя. Технический результат: способ отличается быстротой и легкостью формирования поверхности с антикоагулянтными свойствами. 1 табл.

Предлагаемое изобретение относится к области биологии, в частности биохимии.

С прогрессом ангиохирургии достигнуты значительные успехи в разработке и выполнении реконструктивных операций на сосудах. Однако тромбозы реконструированных сосудов, возникающие как в ближайшем, так преимущественно в отдаленном послеоперационном периодах, существенно снижают эффективность оперативных вмешательств. В связи с этим, несмотря на многочисленные работы, ведущиеся в этом направлении, проблема формирования атромбогенной, в частности, гепаринизированной поверхности сосудистых протезов, сосудов с эктомированной интимой, алло- и ксенотрансплантационного материала и т.д. не является до конца решенной в клинической практике.

Известны и описаны, а некоторые используются в практике (а), следующие аналогичные способы формирования атромбогенной (гепаринизированной) поверхности: а) местная обработка кровеносных сосудов и анастомозов раствором гепарина во время операции (Оперативная хирургия /Под ред. И.Литтманна. - Будапешт: Изд-во АН Венгрии, 1985. -1175 с.). Гепарин не способен к прочному взаимодействию с элементами соединительной ткани, поэтому эта мера является кратковременной: большая часть антикоагулянта не задерживается при восстановлении кровотока; б) физико-химические и химические методы обработки поверхности кровеносных сосудов или алло- и ксенотрансплантатов. Например, в целях профилактики тромбоза стенки эндартерэктомированных артерий подвергают воздействию ультразвука в присутствии гепарина в течение 30 с. Гепарин удерживается в стенке сосуда не более 12 часов (Антужев А.Ф. Профилактика инфицирования сосудистых протезов и тромбоза эндартерэктомированных артерий /Дисс. на соискание уч. степени канд. наук.-1985). Пупочные вены или сонные артерии собак, свиней, предлагаемые к использованию в качестве сосудистых трансплантатов, химически модифицируют гепарином с помощью карбодиимида в течение не менее 5 часов, достигая концентрации гепарина 31,5 мкг на см² поверхности (Venkataramani E. S. , Fred Senatore, Маriо Feola, et al. Nonthrombogenic small-caliber human umbilical vein vascular prosthesis //Surgery.-1986.-V.6.-P.735-741); в) гепаринизация поверхности различных синтетических (например, полиуретановых) сосудистых протезов посредством химической модификации функциональных групп (РСТ WO 90 00, 343; Heyman P.W., Cho C.S., McRea J.C. et al. Heparinized polyurethanes: in vitro and in vivo stadies //J.of Biomedical Materials Research.-1985.-V.19.- P.419-436), пропитка синтетических трансплантатов гепарин-коллагеновым сополимером (Shankar Н., Senatore F., Wu D.R. et al. Co-immobilisation and interaction of heparin and plasmin on collageno-elastic tubes //Biomaterials, Artificial Cells and Artificial Organs.-1990.-V. 18. -# 1. -P. 59-73) и т.д. Эти способы гепаринизации либо находятся в стадии научных разработок, либо не получили практического применения из-за некоторых недостатков.

Также известен способ связывания гепарина, являющегося полианионным электролитом, с катионизированной поверхностью. Например, гепарин или гепарансульфат (из эндотелия бычьей аорты), иммобилизованные на частично катионизированной с помощью 3-хлор-2-гидроксипропилтриметиламмонийхлорида поверхности целлюлозы, обладают антикоагулянтной активностью и могут использоваться в качестве биоматериалов - мембран с атромбогенной поверхностью, подобной поверхности кровеносных сосудов (Baumann Н., Keller R., Ruzicka E. Partially cationized cellulose for non-thrombogenic membrane in the presence of heparin and endothelial-cell-surface-heparansulfate //J. Membr. Sci.-1991.-V.61.-P.253-268). Такой же принцип связывания гепарина с четвертичными аммониевыми солями применяется в анионобменной хроматографии. Также описано взаимодействие гепарина с поликатионной поверхностью, образованной иммобилизованным на полиэтилвининиловом спирте поли-L-лизином·НВг (Xinghang М., Fazal M. S. , Wan K.S. Heparin binding on poly(L-lysine)-immobilized surface //J. Colloid Interface Sci. -1991.- V.147.-#l.-P.251-261). На гладкой поверхности полимера за 30 мин из крови или плазмы при скорости 100 мл/мин концентрация гепарина достигает 0,52 мкг/см², на пористой - 1,69 мкг/см². Для проявления поверхностью антикоагулянтных свойств концентрация гепарина должна быть не менее 5 мкг/см² (Venkataramani E.S., Fred Senatore, Mario Feola et al. Nonthrombogenic small-caliber human umbilical vein vascular prosthesis //Surgery.-1986.-V.6.-P.735-741).

Способов, описывающих формирование гепаринизированной поверхности биологических или полимерных материалов с помощью каких-либо красителей, в литературе не обнаружено. Авторами предлагается способ формирования гепаринизированной поверхности посредством нанесения раствора гепарина с предварительной обработкой водным раствором красителя метиленового синего (МС) любой поверхности, способной либо адсорбировать, либо химически связывать молекулы красителя. Таким образом, с помощью молекул МС, являющихся четвертичными аммониевыми солями, вначале формируется катионизированная поверхность. Гепарин, как полиэлектролит с отрицательно заряженными группами, связывается с агрегированными молекулами МС, придавая поверхности антикоагулянтные свойства. Описанный механизм взаимодействия красителя и гепарина лежит в основе явления метахромазии (Кононский А.И. Гистохимия. - Киев: Вища школа, 1976.- 280с.) (схему см. в конце текста).

Преимуществами данного способа является быстрота и легкость формирования поверхности с антикоагулянтными свойствами, а также возможность в широких пределах изменять поверхностную концентрацию гепарина в зависимости от концентрации раствора красителя (см. таблицу).

Метиленовый синий (голубой) относится к так называемым витальным красителям. В течение почти 70 лет его использовали в качестве антисептика для кишечника и мочевыводящих путей. В настоящее время МС не находит такого широкого применения, но не потерял значения при лечении цианоза, вызываемого недостатком кислорода или отравлением кровяными ядами (вводится внутривенно) (Машковский М. Д. Лекарственные средства. - Харьков: Торсинг, 1997.-Т.2.-590с). МС также применяется в гистологии как метахроматический краситель для выявления кислых мукополисахаридов и других элементов соединительной ткани.

Для придания поверхности антикоагулянтных свойств можно обрабатывать последовательно водными растворами красителя и гепарина любые ткани живого организма, имеющие в составе гликозаминогликаны, например, эндартерэктомированные кровеносные сосуды, алло- и ксенотрансплантаты.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующим примером. Водные растворы МС различной концентрации (от 0,1 до 1,0%) наносили на поверхность одинаковых по площади фрагментов артерии или аорты с эктомированной интимой (кадаверный материал) в течение 2-5 минут, избыток красителя удаляли фильтровальной бумагой и обрабатывали раствором гепарина (5000 ед./мл) в течение 2-5 минут. Не вступившие в реакцию с поверхностью медии (media) краситель и гепарин отмывали проточной водой в течение 10-15 минут. Для количественного определения гепарина краситель на поверхности фрагментов сосуда восстанавливали Zn в солянокислой среде до лейкосоединения. После обесцвечивания МС гепарин в растворе определяли карбазоловым методом по реакции Дише на уроновые кислоты (Carbohydrate analysis /Ed. by Chaplin M.F. and Kennedy J.F. -Oxford, Washington, 1986.-228p) и рассчитывали на 1 см² поверхности media (см. таблицу).

Как видно из приведенных в таблице результатов, концентрация гепарина, иммобилизованного на поверхности тканей с помощью метиленового синего, больше чем 5 мкг/см² и является достаточной для проявления поверхностью антикоагулянтных свойств.

Формула изобретения

Способ формирования гепаринизированной поверхности посредством нанесения раствора гепарина, отличающийся тем, что поверхность предварительно обрабатывается водным раствором красителя метиленового синего в концентрации 0,1 - 1,0%.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2