Ингибиторы процессов, связанных с dр-iv

 

Описываются ингибиторы процессов, связанных с DP-IV, выбранные из соединений с общей формулой А-В (группа I), где В означает формулу (I), n равно 1 или 2; m равно 0, 1 или 2; X означает СН₂, S, SO, SO₂, О; Y означает N; R означает H, CN, СНО, В(ОН)₂; А прикрепляется к Y, и а) когда R означает H, А является альфа-аминоацильной группой, полученной из альфа-аминокислоты, несущей циклоалифатическую боковую цепь, или представляет собой бета-аминоацильную группу общей формулы (II), где р принимает значения от 1 до 6, при этом кольцо в любом случае может содержать ненасыщенные связи и/или замещение гетероатомом; б) когда R означает CN, А соответствует определению, данному в (а), и, кроме того, может быть получен из любой L-альфааминокислоты, несущей липофильную боковую цепь, и в) когда R означает СНО или В(ОН)₂, А означает бета-аминоацильную группу, определяемую в (а); (группа II): В, n, m, Х - как указано выше; R означает H, CN; А прикрепляется к Y, при этом А представляет собой (i), где а = 1-5; D означает G - (СН₂)_b - (R₄) - R₃; G означает NH или NMe; b = 1-12; q = 0 или 1; R₄ означает Z - NH - (CH₂)_c или NH - Z - (CH₂)_c-, где с = 1-12; Z означает СО, СН₂; R₃ = СО₂Н или его эфир, CONH₂, CONR₅R₆, SO₂NH₂, SO₂NR₅R₆, ОН, OR₅, замещенный или незамещенный арил, NH₂, NR₅R₆, NHCOR₅, NHSO₂R₅, NH-CH(:NR₅)NR₅R₆; R₅ и R₆ выбирают, независимо друг от друга, из Н, низших алкильных, фторалкильных групп, или R₅ и R₆ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, составляют цепь C₃-C₈; или А представляет собой (ii), где R¹ = Н, Me; Е = J-(СН₂)_b-(R₄)_q - R₃; J = СО; a, b, q, R₃ и R₄ соответствуют определению, данному в (i), или представляет собой (iii), где R² = Н, Me; L означает (CH₂)_d-(CO)_г-(CH₂)_b-(R₄)_q-R₃, где r = 1, d = 1-4; b, q, R₃ и R₄ соответствуют определению, данному в (i). Вышеописанные ингибиторы являются высокоактивными конкурентными ингибиторами DP-IV (со значениями К в диапазоне от 10^-6 до 10^-10), и характеризуются химической стабильностью (t_1/2 > 24 ч). 3 з.п. ф-лы, 20 табл.

Предпосылки создания изобретения DP-IV (КФ 3.4.14.5) - связанная с мембраной сериновая протеаза - была впервые индентифицирована в почках крыс по ее способности расщеплять дипептиды на N-конце некоторых пептидов (Hopsu-Havu V.K. and Glenner G.G., Histochemie, 1966, 7, 197). Дипептиды при этом должны относиться к типу X-Pro или X-Ala, где X обозначает любую аминокислоту. Показано, что X-Пролин расщепляется более эффективно, чем X-Ala.

DP-IV широко распространена в тканях млекопитающих, отмечены большие количества ее в почках, эпителии кишечника и плаценте (Yaron A. and Naider F. , Critical Reviews in Biochem. Mol. Biol., 1993, 28 (1). 31). В иммунной системе человека фермент экспрессируется практически только при активации T-лимфоцитов CD4 типа, в этом случае показано, что фермент синонимичен поверхностному антигену клеток CD26.

Точная роль DP-IV в физиологии человека не совсем ясна, однако последние исследования показали, что фермент играет важную роль в физиологии и патофизиологии человека, в частности в приведенных ниже процессах.

(а) Иммунный ответ: экспрессия DP-IV увеличивается в T- клетках при митогенной или антигенной стимуляции (Mattern Т. et al., Scand. J. Immunol., 1991, 33, 737). Показано, что ингибиторы DP-IV и антитела к DP-IV подавляют пролиферацию митоген- и антиген-стимулируемых T-клеток зависимым от дозы способом (Schon Е. et al. Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1991, 372, 305 и имеющиеся в работе ссылки).

Показано, что другие разнообразные функции T-лимфоцитов, такие, как продуцирование цитокина, опосредованная ИЛ-2 (IL-2) пролиферация клеток и хелперная активность B-клеток зависят от активности DP-IV (Schon Е. et al., Scand. J. Immunol. 1989, 29, 127). Недавно появилось сообщение об ингибиторах DP-IV, полученных на основе борпролина (Flentke G.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 1556), которые, несмотря на свою нестабильность, оказались эффективными в ингибировании антиген-индуцированной пролиферации лимфоцитов и продукции ИЛ-2 в CD4^* T-хелперных клетках мышей. Было показано, что такие ингибиторы борной кислоты эффективны in vivo у мышей, вызывая супрессию антител, образования индуцированного иммунным стимулятором (Kubota T. et al., Clin. Exp. Immunol., 1992,89, 192). Также недавно в ряде других работ были представлены доказательства участия DP-IV в генерации иммунного ответа (например, Tanaka Т. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. NY, 1993, 90, 4586; Hegen M. et al., Cell Immun., 1993, 146, 249, Subramanyan M. et at., J. Immunol., 1993, 150, 2544).

Ряд исследователей объясняют важное значение DP-IV тем, что она связывается на клеточной поверхности с трансмембранной фосфатазой CD45 (Torimoto Y. et al., J. Immunol., 1991, 147, 2514). Связь CD45-DP-IV может разрушаться под действием ингибиторов DP-IV или лигандов неактивного сайта. Известно, что CD45 представляет собой интегральный компонент T-клеточной сигнальной системы.

(б) Недавно появилось сообщение в пресс-релизе Пастеровского Института в Париже (и впоследствии на презентации работы А.Г. Гованессяна на 8-ой конференции Сент Гарда в Париже, 25-27 октября 1993 г. (Hovanessian A.G., 8th Cent Gardes Meeting) о том, что DP-IV необходим для проникновения вирусов ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в CD4⁺ T-клетки и их инфицирования. Исследователи из французской группы заявили, что DP-IV взаимодействует с ними и может расщеплять при этом V3 петлю гликопротеина gp120 вирусной оболочки. Они также сообщили, что ингибиторы или антитела к DP-IV успешно препятствуют входу вируса в клетку. Ранее было известно о селективном снижении экспрессии CD26 в T-клетках у ВИЧ-1 инфицированных пациентов (Valle-Blazquez М. et al., J. Immunol. , 1992. 149, 3073), а также о том, что Tat белок ВИЧ-1 связывается с DP-IV (Subramanyam М. et al., J. Immunol., 1993, 150, 2544).

(в) Недавно было показано, что DP-IV в легочном эндотелии представляет собой адгезионную молекулу для клеток метастазы легкого и карциномы простаты крысы (Johnson R.C. et al., J. Cell. Biol., 1993, 121. 1423). Известно, что DP-IV связывается с фибронектином, при этом некоторые опухолевые клетки метастаз несут на своей поверхности большие количества фибронектина.

(г) Было показано, что DP-IV связывается с ферментом аденозиндезаминазой [АДА (ADA)] на поверхности T-клеток (Kameoka J. et al., Science, 1993. 261, 466). Недостаток АДА вызывает у человека тяжелый комбинированный иммунодефицит (ТКИД (SCID)]. Взаимодействие AДA-CD26 может пролить свет на патофизиологию ТКИД.

(д) В фибробластах кожи человека, больного псориазом, ревматоидным артритом (РА) и красным плоским лишаем, был обнаружен высокий уровень экспрессии DP-IV (Raynaud F. et al., J. Cell Physiol., 1992, 151, 378).

(e) В тканевых гомогенатах, взятых от пациентов с доброкачественной гипертрофией простаты и в простатосомах была обнаружена высокая активность DP-IV. Простатосомы представляют собой производные от простаты органеллы, важные для придания сперме большей подвижности (Vanhoof G et al., Eur J. Clin Chem. Clin. Biochem., 1992. 30. 333).

(ж) Было показано, что DP-IV ответственна за деградацию и инактивацию циркулирующих в крови пептидов, имеющих в качестве предпоследней аминокислоты на N-конце пролин или аланин, т.е. вещества P, рилизинг-фактора ростового гормона и представителей семейства глюкагон/вазоактивных кишечных пептидов (Mentheim R. et al., Eur. J. Biochem., 1993, 214,829).

(з) У пациентов с периодонтитом отмечен повышенный уровень DP-IV в деснах (Сох S.W. et al., Arch. Oral. Biol. 1992, 37, 167).

(и) Имеется множество других данных, указывающих на повышенный (а иногда и пониженный) уровень DP-IV при различных патологических состояниях.

Из вышесказанного следует, что потенциальные ингибиторы DP-IV могут использоваться как лекарственные средства для лечения заболеваний человека. Такие ингибиторы могут применяться в качестве: (а) Иммуносупрессоров, например, при трансплантации органов; супрессоров высвобождения цитокина, в частности, при различных аутоиммунных заболеваниях, таких, как воспаление кишечника, множественный склероз, ревматоидный артрит.

(б) Препаратов, препятствующих внедрению ВИЧ в T-клетки, а следовательно, могут использоваться для профилактики и лечения СПИДа.

(в) Препаратов для предупреждения развития метастаз, особенно при опухолях молочной железы и простаты, в легкие.

(г) Средств для лечения кожных болезней, таких как псориаз, красный плоский лишай.

(д) Средств для подавления подвижности спермы и, следовательно, в качестве мужских контрацептивов.

(е) Средств, полезных для применения при доброкачественной гипертрофии простаты.

Ингибиторы DP-IV К числу конкурентных ингибиторов ферментной активности DP-IV относятся только упомянутые выше нестабильные борные кислоты (t_1/2 30-90 мин при pH 7) (Bachovchin et al. , WO 91/16339, октябрь 1991 г.), имеющие значения K для DP-IV в наномолярном диапазоне, и простые аминокислотные пирролидиды или тиазолиды (Neubert et al., DD 296075 A5, ноябрь 1991 г.), обладающие очень небольшой силой (K_i > 0,1 мкМ). Заявленные в том же Германском патенте аминоацильные альдегиды пролина не могут быть синтезированы вследствие легкой внутримолекулярной конденсации N- концевой аминогруппы с альдегидной группировкой.

В настоящем изобретении раскрываются высокоактивные конкурентные ингибиторы DP-IV (со значениями K_i в диапазоне от 10^-6 до 10^-10), характеризующиеся химической стабильностью (t_1/2 24 час). Они относятся к трем группам соединений (Группы I, II и III).

Группа I Эти молекулы имеют структуру, позволяющую им прочно связываться с активным центром DP-IV и ингибировать его протеолитическую активность, не препятствуя прикреплению любых дополнительных лигандов, способных связываться с поверхностью DP-IV (т.е. не на его активном центре). Такие соединения Группы I могут использоваться в качестве иммуносупрессоров: противоинфекционных агентов относительно ВИЧ: средств, подавляющих высвобождение некоторых цитокинов (например, ИЛ-2, ИЛ-6, γ -INF) из активированных клеток. В эту категорию попадают также борные кислоты и пирролидиды, упомянутые ранее.

Группа II Эти соединения происходят из соединений Группы I, однако они содержат, в отличие от последних, расширения длинной цепи к боковым цепям аминокислоты, обозначенной в общей структуре как А. Полученные соединения прикрепляются прочно к активному центру DP-IV, однако расширения длинной цепи выступают из активного центра фермента и препятствуют прикреплению любого другого лиганда, способного связываться с поверхностью DP-IV. Такие соединения могут иметь те же самые области применения, что и соединения Группы I, но в дополнение к ним могут также блокировать взаимодействие DP-IV с (i) CD45, (ii) V3 петлей gp120 ВИЧ-1, (iii) фибронектином поверхности опухолевой клетки и (iv) любым другим лигандом, важным для активации T-клеток, внедрения вируса в T-клетки или адгезии опухолевых клеток.

Группа III
Эта группа включает новые димеры, в которых два ингибитора DP-IV, направленных на активный центр фермента, связаны длинной цепью через боковые цепи аминокислотных остатков, обозначенных в общей формуле как A. Такие димеры могут конкурентно ингибировать две молекулы DP-IV и также препятствовать связыванию дополнительных лигандов с поверхностью DP-IV. Описываемые димеры имеют такие же области применения, как и соединения Группы II, но могут быть более эффективными.

Изобретение относится к ингибиторам процессов, опосредованных действием DP-IV, которые характеризуются общей формулой:
A-B (Группы I и II) или

где В представляет собой

n = 1 или 2; m = 0, 1 или 2; NH или NR, где R = низший алкил(C-C);
A прикрепляется к Y;
-Y = -N, -CH или C (когда -CO группа в A замещена группой CH= или CF=),
R=H, CN, CHO, B(ОН)₂, C≡C-R₇ или CH=N-R₈;
R₇=H, F, низший алкил(C₁-C₆), CN, NO₂, OR₉, CO₂R₉ или COR₉;
R₈=Ph, ОН, OR₉, OCOR₉ или OB_n;
R₉ = низший алкил (C₁-C₆); и либо один ω, либо оба ω могут отсутствовать.

Структура A зависит от природы R в части B и от природы группы, к которой принадлежит полученное соединение.

Соединения Группы I
(a) R=H
A обозначает аминоацильную группу, полученную из α-аминокислоты, несущей циклоалифатическую боковую цепь (т.е. от C₄ до C₁₀, моно- или бициклическую), в которой кольцо может содержать один или более гетероатомов, например, L-циклогексилглицин, L-циклопентилглицин, L-декагидронафтилглицин, L-пиперидилглицин;
или
A представляет собой β -аминоацильную группу общей формулы

где p= 1-6, а кольцо может содержать один или более гетероатомов, замещающих группу(ы) CH₂.

Как α, так и β -аминоацильные группы в (a), указанном выше, могут содержать ненасыщенные связи в своих кольцах, т.е.

а также могут включать один или более гетероатомов.

(б) R=CN; C=C-R₇ или CH=N-R₈
A соответствует определению, данному ранее в (a), и может быть также получен из L-α- аминокислот, несущих липофильную боковую цепь, например, lle.

(в) R=CHO или B(OH)₂
A представляет собой β -аминоацильную группу, соответствующую определению, данному в (а). Полученные A-B соединения являются стабильными, непохожими на α -аминоацильные производные того же типа, которые подвергаются небольшой внутримолекулярной циклизации. В соединениях (В) В(ОН₂) может быть представлен в виде, например, боронатного эфира.

приведенные соединения лабильны в воде, образуя свободные борные кислоты.

Соединения Группы II
Когда R= H, C≡C-R₇ или CH=N-R₈, А является производным α -аминокислоты, боковая цепь которой несет функциональную группу, которая изменена таким образом, чтобы образовалась длинная цепь, терминирующая в различных группах R₃. А может иметь структуру, относящуюся к трем следующим типам:

или

где a = 1-5: D=G-(CH₂)_b-(R₄)_q-R₃; G=0, NH или NMe;
b = 0-12; q= 0-5;
D¹=D, где G ≠ 0;
R₄= Z-NH-(CH₂)_c- или NH-Z-(CH₂)_c-, где с = 1-12, a Z=CO, CH₂ или SO₂, и
R₃= CO₂H или его эфир [т.е. любой низший алкил, фторалкил или циклоалкил(C₁ - C₈), а также ароматический или гетероароматический (5- или 6-членные кольца, моно- или бициклические) эфир] , CONH₂; CONHNH₂; CONR₅R₆; CONHNR₅R₆, PO₃H (или его эфир, в соответствии с определением, данным для CO₂Н), SO₃H; SO₂NH₂, SO₂NR₅R₆, ОН, CR₅, арил или гетероарил (т.е. 5- или 6-членные кольца, моноциклические или бициклические) [включая замещенный арил или гетероарил с заместителями, выбранными из F, Cl, I, Br, ОН, OR₅, NO₂, SO₃H, SO₂NH₂, SO₂NR₅R₆, NH₂, NR₅R₆, CO₂R₅, CF₃, CN, CONH₂, CONR₅R₆,
NHCO₂R₅, CH(NR₅)NR₅R₆, NH-CH(: NR₅)NR₅R₆ и R₅] ; NH₂; NR₅R₆; NHCO₂R₅; NHSO₂NR₅R₆; NHCOR₅, NH-SO₂R₅; NH-CH(:NR₅)NR₅R₆; NHCONR₅R₆, сахар (который может присоединяться через эфирную или гликозидную связь); CO-аминосахар (присоединенный через -NH₂), например, глюкозамин или галактозамин; NHCO- аминосахар; или NHCS-аминосахар.

В вышеприведенном определении R₃ термин "сахар" относится к любому углеводу или олигосахариду, а R₅ и R₆ отбираются независимо друг от друга из H и алкильных, фторалкильных и циклоалкильных групп (до 8 атомов), арильных, гетероарильных и алкилгетероарильных групп (до 11 атомов) или R₅ и R₆ вместе составляют цепь (от C₃ до C₈)

или

где R¹= H, Me; кольцо может также содержать большее число гетероатомов;
E= J-(CH₂)_b-(R₄)_q -R₃, J=CO, CH₂ или SO₂; при этом a, b, q, R₃, R₄ соответствуют определению, данному в п. (i)


где R² = H или Me; кольцо может также содержать один или более гетероатомов,
L = (CH₂)_d-[CO] _r- (CH₂)_b- (R₄)_q-R₃ или (CH₂)_e-NR¹- (CH₂)_b-(R₄)_q-R₃; r = 0 или 1; d = 0-4; e = 2-4; b, q, R₃ и R₄ соответствуют определению, данному в п. (i).

Группа III
Соединения группы III определяются общей формулой:

где ω = CH₂, О, NH, CO, S, SO₂, Ph или NMe и независимо
ε = CH₂, О, NH, CO, S, SO₂, Ph или NMe.

Приведенные соединения представляют собой симметричные димеры. Они могут иметь любую B структуру, в соответствии с данным выше определением. А может отбираться из любой структуры группы II [(i), (ii) или (iii)], однако, в этом случае концевую группу R₃ в каждом остатке A удаляют и замещают защищенной симметричной группой [ε-ω-ε], которая связывает две половинки димера; ω может отсутствовать, и в этом случае оба ε соединяются вместе с образованием цепи, связывающей две A - B части; альтернативно, оба ε могут отсутствовать, и в этом случае только присоединяется к двум A - B частям.

Структура типа ε-ω-ε химически легко достижима, например, в виде NH-CO-NH, CO-NH-CO-, SO₂-NMe-SO₂; для каждого специалиста со средним уровнем знаний в данной области очевидно также, какие структуры недостижимы, например, типа -NH-NH-NH-. Конкретные примеры возможных соединений приведены в Таблице 7.

Во всех соединениях, описанных в Группе II и Группе III, определенные -CH₂-группы, имеющиеся в длинных цепях, могут быть замещены с соблюдением биоизостерии, например, с помощью -О-, т.е. без воздействия на ингибирующую или связывающую активность в отношении DP-IV. При наличии таких группировок, как, например, -CONHCH₂CH₂NHCO, они могут быть замещены приведенным ниже заместителем

Кроме того, в соединениях Групп I, II и III любая амидная связь, связывающая A и B или любой амид в боковых цепях A (в Группах II и III), может быть замещена с помощью известных методов соблюдения биоизостерии амидов, например:
замещают на





В Таблице 8 приведены примеры такого рода замещений.

Биохимия
Все соединения исследуют in vitro против чистой человеческой DP-IV (полученной от М & E, Копенгаген, Дания). Ингибирование DP-IV определяют с использованием флуоресцентного субстрата Ала-Про-AFC (K_m 0,8 мкМ) при трех концентрациях для каждого ингибитора. Типичный тест (общий объем 0,4 мл) включает натрий-Гепес 83,3 мМ, ЭДТА 1.67 мМ. БСА 1.5 мг мл^-1, pH 7,8, DP-IV 25 мкЕд.мл^-1 ингибитор (в 10 мМ ацетате, pH 4,0). Начало протекания реакции осуществляют добавлением субстрата и каждые 30 сек в течение 7,5 мин отмечают значения возбуждения при 395 нм и эмиссию при 450 нм. Значения K_i определяют с помощью графика Диксона.

Химия
На Таблицах 1 - 8, вслед за которыми идут схемы и описание экспериментальной методики получения различных структурных типов, приведены 152 Примера синтезированных соединений. Все конечные продукты охарактеризованы методом FAB масс-спектрометрии с оценкой степени их чистоты исследованием с помощью ВЭЖХ с обращением фаз; все промежуточные продукты охарактеризованы при исследовании методом ¹H ЯМР.

На Таблице 9 приведены избранные значения K_i в отношении DP-IV при определении их с ингибиторами различных структурных типов.

Схемы основных способов получения всех классов соединений представлены в табл. 1а - 11а.

Экспериментальные процедуры для конкретных примеров
Пример 1
2-(S)-циано-1-изолейцилпирролидин (11)

К раствору H-ProNH₂·HCI (225 мг, 1.50 ммоля) в сухом CH₂Cl₂ (15 см³) добавляют диизопропилэтиламин до тех пор, пока значение pH станет равным 9. Добавляют в виде одной порции BoclleONSu и перемешивают смесь в течение 16 часов в атмосфере азота. Затем выпаривают растворитель, а остаток обрабатывают стандартным способом, т.е. распределяют остаток между этилацетатом (60 см³) и 0,3 N раствором KHSO₄ (10 см³). Далее органический слой промывают насыщенным раствором NaHCO₃ (10 см³), водой (10 см³) и солевым раствором (5 см³). Раствор высушивают (Na₂SO₄) и выпаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт пропускают через короткую пробку силикагеля, элюируют с помощью смеси гексан : этилацетат (от 10:90 до 0:100) с получением 301 мг (92%) BoclleProNH₂, в виде бесцветной пены.

¹H ЯМР (CDCl₃) δ (ppm); 6,90 (1H, шс); 5,51 (1H, шс); 5,18 (1H, д., J = 9,6 Гц): 4,62 (1H, дд. , J=2,6, 7,0 Гц); 4.29 (1H, дд., J=8,4, 9,2 Гц); 3,79-3,58 (2H, м.); 2.36 (1H, м): 2.09-1.57 (5H, м); 1,43 (9H, с): 1.17 (1H, м); 0,95 (3H, д., J = 6,6 Гц); 0,90 (3H, т. J = 7.3 Гц)
К раствору BoclleProNH₂ в сухом пиридине (10 см³) в атмосфере азота добавляют имидазол (84 мг, 1.24 ммоля). Раствор охлаждают до температуры -35^oC, после чего добавляют по каплям POCl₃ (0,25 см³, 2,48 ммоля). Реакционную смесь перемешивают при температуре от -30 до -20^oC в течение 60 минут. Затем раствор выпаривают, а грубый остаток подвергают колоночной хроматографии (на силикагеле) с получением 180 мг (94%) 2-(S)-циано-1-[N-(т-бутоксикарбонил) изолейцил]-пирролидина в виде бесцветного масла.

¹H ЯМР (CDCl₃) δ (ppm); 5,14 (1H, д. J = 9,2 Гц); 4,80 (1H, дд., J = 2,6, 7,1 Гц); 4,22 (1H. дд., J=7,9, 9,1 Гц); 3,81 (1H, м); 3,71 (1H, м); 2,30-2,12 (4H, м); 1,75 (1H, м); 1,60 (1H, м); 1,42 (9H, с); 1,19 (1H, м); 0,97 (3H, д, J = 6,9 ГЦ); 0,91 (3H, т., J = 7,3 ГЦ).

¹³C ЯМР (CDCl₃) δ (ppm) 171,7; 155,6; 118,0; 79,6; 56,0; 46,5; 46,0; 37,8; 29,6; 28,1; 25,0; 24,2; 15,2; 10,9.

Снятие защиты осуществляют при перемешивании с трифторуксусной кислотой в течение 60 минут. Выпаривание и лиофилизация из воды дают 60 мг 2- (S)-циано-1-изолейцилпирролидина (11) в виде белого пушистого твердого вещества.

FAB Масс-спектр.: Расчет: 209,3, Найдено (М+H)⁺=210,2.

¹H ЯМР (D₂O) δ (ppm); 4,3 (1H, м); 3,64 (1H. д., J = 5,6 Гц); 3.16 (2H, м); 1,86-1,48 (5H, м); 0,98 (1H, м); 0,68 (1H, м); 0,51 (3H, д., J= 6,9 Гц); 0,38 (3H, т., J = 7,3 Гц).

¹³ЯМР (D₂O) δ (ppm); 169,7: 119,7: 57,3; 48,6: 48,1; 36,9; 30,2; 25,8; 24,5; 15,4; 11,5.

Пример 2
H-Glu (NH(CH₂)₇CONH(CH₂)₃NHZ] пирролидин (64)

К раствору BocGlu (OH) пирролидида (193 мг, 0,64 ммоля) и PyBop (500 мг, 0,96 ммоля) в CH₂Cl₂ (6 см³) добавляют диизопропилэтиламин для доведения значения pH раствора до 9. После перемешивания в течение 5 минут добавляют раствор бензил 8-амино-октаноата (200 мг, 0,77 ммоля) в CH₂Cl₂ (5 см³). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 16 часов. Реакционную смесь обрабатывают согласно процедуре, описанной в Примере 1. Грубый остаток подвергают колоночной хроматографии (от 1% до 3% метанола в этилацетате) с получением 344 мг (99%) BocGlu [NH(CH₂)₇ CO₂Bn] пирролидида в виде бесцветного твердого вещества.

¹H ЯМР (CDCl₃) δ (ppm); 7,35 (5H, с), 6,63 (1H, шт, J = 6.7 Гц); 5,65 (1H, д., J = 8,3 Гц); 5,11 (2H, с); 4,36 (1H, дт., J=2,6, 8,9 Гц); 3,55-3,20 (6H, м); 2,34 (2H, т. J=7,3 Гц); 2,26 (2H, дд., J=5,6. 7,3 Гц); 2.11-1,48 (10H, м): 1,43 (9H, с); 1,32-1,27 (6H, м).

Раствор BocGlu [NH(CH₂)₇CO₂Bn] пирролидида (230 мг, 0,43 ммоля) в этилацетате (10 см³), содержащем 10% палладия на угле (50 мг), барботируют водородом. Через 90 минут в реакционный сосуд продувают азот, раствор фильтруют через целит, а растворитель выпаривают с получением 187 мг (98%) BocGlu NH(CH₂)₇CO₂H] пирролидида в виде бесцветного масла.

К раствору BocGlu [NH(CH₂)₇CO₂H] пирролидида (125 мг, 0,28 ммоля) и PyBop (221 мг, 0,43 ммоля) в CH₂Cl₂ (10 см³) добавляют диизопропилэтиламин до pH 9. После перемешивания в течение 5 минут добавляют одной порцией раствор ZNH(CH₂)₃NH₂ · HCl (90 мг, 0,37 ммоля) и диизопропилэтиламина (38 мг, 0,37 ммоля). Раствор перемешивают в течение 18 часов и затем обрабатывают в соответствии со стандартной процедурой, описанной в примере 1. Грубый остаток подвергают колоночной хроматографии (от 2% до 15% метанола в этилацетате) с получением 151 мг (85%) BocGlu [NH(CH₂)₇ CONH(CH₂)₃NHZ] пирролидида в виде бесцветного масла.

¹H ЯМР (CDCl₃) δ (ppm); 7,35 (5H, с.); 6,60 (1H, шт., J = 7,2 Гц); 6,14 (1H, шт. , J = 7,2 Гц); 5,63 (1H, д., J = 8,3 Гц); 5.39 (1H, шт., J = 5,6 Гц); 5,10 (2H, с); 4,38 (1H, дт., J=2,3, 9,2 Гц); 3,52-3,13 (10H. м); 2,26 (2H, т. , J = 6,9 Гц); 2.17 (2H, т., J = 7,6 Гц): 1,98-1,48 (12H, м); 1,44 (9H, с); 1,38-1,23 (6H, м).

Раствор BocGlu [NH(CH₂)₇CONH(CH₂)₃NHZ]пирролидида (14 мг, 0,022 ммоля) в 4N HCl/диоксане перемешивают в течение 45 минут. Растворитель выпаривают, а остаток растворяют в воде, фильтруют и лиофилизируют с получением 13 мг H-Glu [NH(CH₂)₇CONH (CH₂)₃NHZ]-пирролидида (64) в виде бесцветного масла.

FAB Масс-спектр.: Вычислено: 531,3, Найдено (М+H)⁺= 532,3
Пример 3
H-Lys[CO(CH₂)₃NHSO₂Pfp)пирролидид (110)

ZNH(CH₂)₃CO₂NSu (570 мг, 1,7 ммоля) добавляют в виде одной порции к раствору 1-[N-(т-бутоксикарбонил) лизил] пирролидина (745 мг, 2.2 ммоля) в сухом CH₂Cl₂. Значение pH доводят до 9 с помощью диизопропилэтиламина, а смесь перемешивают в течение 60 минут. Растворитель выпаривают, а остаток обрабатывают по стандартной процедуре, описанной в примере 1. Колоночная хроматография (от 100% этилацетата до 15% метанола в этилацетате) дает 620 мг (68%) BocLys-[CO(CH₂)₃NHZ] пирролидида.

¹H ЯМР (CDCl₃) δ (ppm); 7,42 (5H, с); 6,31 (1H, шт., J = 6,5 Гц); 5,58 (1H, д. , J = 8,9 Гц); 5.39 (1H. шт., J = 6.9 Гц); 5.17 (2H, с); 4,44 (1H, м); 3,72-3,20 (8H, м); 2,29 (2H, т., J = 7,3 Гц); 2,14-1,83 (8H, м); 1,78-1,41 (4H, м); 1.43 (9H, с).

Водородом барботируют смесь BocLys[Co(CH₂)₃NHZ] пирролидида (620 мг, 1,16 ммоля) и 10% палладия на угле в метаноле (10 см³), содержащую один молекулярный эквивалент 2N HCl. По прошествии 60 минут через реакционную смесь пропускают азот и фильтруют ее через целит. Выпаривание растворителя дает 282 мг (49%) BocLys [Co(CH₂)₃NH₂ · HCl]пирролидида. Полученный продукт растворяют в CH₂Cl₂ (10 см³) и перемешивают в атмосфере азота. Перед внесением пентафторбензолсульфонил хлорида (45 мг, 0,17 ммоля) добавляют диизопропилэтиламин до pH 9. Смесь перемешивают в течение 16 часов. Растворитель выпаривают, а грубый материал обрабатывают по стандартной методике, описанной в примере 1. Колоночная хроматография (от 100% этилацетата до 10% метанола в этилацетате) дает 33 мг (31%) BocLys [CO(CH₂)₃NHSO₂Pfp]пирролидида в виде бесцветного масла.

¹H ЯМР (CDCl₃) δ (ppm); 7,19 (1H, шт., J = 6,3 Гц); 6,18 (1H, шт., J= 6,6 Гц), 5,50 (1H, д., J = 8,4 Гц), 4,38 (1H, м); 3,65-3,16 (8H, м); 2,36 (2H, т., J = 6,8 Гц); 2,01-1,82 (8H, м), 1,69-1,41 (4H, м); 1,43 (9H, с).

Описываемый продукт перемешивают в трифторуксусной кислоте (10 см³) в течение 30 минут. Растворитель выпаривают, а остаток растворяют в воде, фильтруют и лиофилизируют с получением 30 мг H-Lys[CO(CH₂)₃-NHSO₂Pfp]Prl (110) в виде бесцветного масла.

FAB Масс-спектр.: Вычислено 514,2; Найдено (М+H)⁺= 515,2.

Пример:
H-Thr[(CH₂)₅CH₃)пирролидид (143)

Пирролидин (0,88r, 12,4 ммоля) добавляют в раствор BocThrONSu (3,0 г, 9,5 ммоля) в сухом CH₂Cl₂ (30 см³) в атмосфере азота. Реакционную смесь перемешивают в течение 60 минут при комнатной температуре. Растворитель выпаривают, а остаток обрабатывают по стандартной методике, описанной в примере 1. Остаток подвергают колоночной хроматографии (гексан : этилацетат, 30:70) с получением 2,50 г (96%) 1-[N-(т-бутоксикарбонил)треонил]пирролидина в виде бесцветного масла.

¹H ЯМР (CDCl₃) δ (ppm): 5,52 (1H, д, J= 6,5 Гц). 4,30 (1H, д, J= 7,4 Гц); 4,16 (2H, м), 3,72 (1H, м); 3,46 (3H, м); 1,98-1,82 (4H, м); 1,43 (9H, с), 1,19 (3H, д. J= 7,1 Гц).

К раствору 1-[N-(т-бутоксикарбонил)треонил]пирролидина в сухом ТГФ при температуре 0^oC в атмосфере азота добавляют гидрид натрия (17 мг, 0,70 ммоль). Перед внесением н-гексил йодида (200 мг, 0,94 ммоля) смесь перемешивают в течение 16 минут. Затем реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 16 часов. Растворитель выпаривают, а остаток обрабатывают по стандартной методике, описанной в примере 1. Грубый продукт подвергают колоночной хроматографии (гексан : этилацетат, 40: 60) с получением 25 мг (10%) BocThr [(CH₂)₅CH₃]пирролидида (143).

¹H ЯМР (CDCl₃₎) δ (ppm), 5,50 (1H, д., J = 6,9 Гц); 4,48 (1H, м); 3,70- 3,32 (7H, м); 1,92-1,80 (6H, м); 1,52 (2H, м), 1,42 (9H, с); 1,30 (6H, м), 1,22 (8H, д., J= 6,9 Гц); 0,83 (3H, т., J = 7.9 Гц).

BocThr [(CH₂)₅CH₃] пирролидид (20 мг, 0,06 ммоля) перемешивают в 4N HCl/диоксане (5 см³) в течение 60 минут. Растворитель выпаривают, а остаток переносят в воду, фильтруют и лиофилизируют с получением H-Thr-[(CH₂)₅CH₃] пирролидида (20 мг) в виде оранжевого масла. Продукт чистят с помощью ВЭЖХ с обращением фаз, получая 15 мг (143) в виде бесцветного масла.

FAB Масс-спектр.: Вычислено: 256,2, Найдено (М+H)⁺ = 257,3.

Пример 5
H-lle-ϑ-[CH=CH)Пирролидид (149)

К раствору циклопентил трифенилфосфония бромида (287 мг, 0,69 ммоля) в сухом ТГФ (6 см³) в атмосфере азота при температуре -30^oC добавляют при перемешивании 1,6 N ⁿбутил лития (0,50 см³, 0,76 ммоля). Смесь перемешивают в течение 60 минут, после чего раствор охлаждают до температуры -50^oC с последующим добавлением по каплям раствора N-(т-бутоксикарбонил)-L-изолейцинала (125 мг, 0,58 ммоля, получен по методу Fehrentz and Castro, Synthesis, 1983, 676) в сухом ТГФ (4 см³). По окончании добавления температуру реакционной смеси медленно, в течение 3,5 часа доводят до комнатной.

Реакцию останавливают добавлением насыщенного раствора хлорида аммония (2 см³). Полученную смесь разбавляют водой (10 см³) и экстрагируют диэтиловым эфиром (3х20 см³). Объединенные эфирные слои промывают водой (10 см³), высушивают (Na₂SO₄) и выпаривают с получением 187 мг (> 100%) грубого продукта. Колоночная хроматография (90:10, гексан : Et₂O) дает 53 мг (34%) Boc-lle- ϑ [CH=CH]пирролидида в виде бесцветного масла
¹H ЯМР (CDCl₃) δ (ppm): 0,84 (3H, т., J = 6.9 Гц); 0,91 (3H, д., J = 7,3 Гц), 1,08 (1H, М); 1,44 (9H, с); 1,48 (1H, м): 1,64 (5H, м), 2,24-2,45 (4H, м): 4,08 (1H, шс); 4,41 (1H, шс), 5,12 (1H, дт., J = 2,3, 8,9 Гц).

¹³C ЯМР (CDCl₃) σ (ppm) 155,8; 147,4: 119.1; 79,2; 54,8; 40,1; 34,2; 29,6; 28,9; 26,8; 26,6; 26,1; 15,0; 12,1.

Обработка данного продукта с применением 4N HCl/диоксана в течение 35 минут удаляет Вос-защитные группы. Реакционную смесь выпаривают, остаток растворяют в воде, фильтруют и лиофилизируют с получением 24 мг (63%) H-lle-ϑ[CH=CH]пирролидида (149) в виде пенистого твердого вещества.

FAB Масс-спектр.: Вычислено 167,2, Найдено (М+H)⁺= 168,2.

Примеры 6 и 7
H-lle[(2R)-циано-ϑ (CH=CH)пирролидид] (150)
H-lle [(2S)-циано-ϑ (CH=CH)пирролидид] (151)


N-(т-бутоксикарбонил)-L-изолейцинал (2,40 г, 11,2 ммоля) и 2- окси-1-трифенилфосфоранциклопентан (4,61 г, 13,4 ммоля, приготовлен по методу H.O. House и H.Babed, J. Org. Chem. 1963, 28, 90) нагревают при температуре кипячения с обратным холодильником в толуоле в атмосфере азота. Через 15 часов смесь охлаждают, а растворитель выпаривают. Колоночная хроматография (80:20, гексан : этилацетат) грубого остатка дает 2,33 г (74%) Boclle - ϑ [CH=CH] пирролидин-2-оне в виде бесцветного масла
¹H ЯМР (CDCl₃) δ (ppm); 6,29 (1H, дт., J=2,6, 9,2 Гц), 4,59 (1H, шд), 4,17 (1H, м); 2,82 (1H, м), 2,66-2,50 (2H, м); 2,34 (2H, т., J = 7,8 Гц), 1,96 (2H, к. , J = 7,6 Гц); 1,44 (1H, м); 1,43 (9H, с); 1,12 (1H, м); 0,89 (3H, д., J = 5,3 Гц); 0,88 (3H, т., J = 6,9 Гц).

К раствору Boclle-ϑ[CH= CH]пирролидин-2-она (180 мг, 0,64 ммол) и LiCN (0,5 М в ДМФ, 3,84 см³, 1,92 ммоля) в сухом ДМФ (2 см³) в атмосфере азота добавляют диэтилцианофосфоноацетат (0,30 см³, 1,92 ммоля). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 минут. Смесь разбавляют водой (20 см³) и затем экстрагируют этилацетатом (2·30 см³). Объединенные органические слои промывают водой (5·10 см³), высушивают (Na₂SO₄) и выпаривают с получением 360 мг (> 100%) грубого продукта. Порцию такого грубого цианофосфоната (284 мг, 0,64 ммоля) растворяют в сухом ТГФ и перемешивают в атмосфере азота. Вносят трет-бутанол (47 мг, 0,64 ммоля), затем добавляют по каплям раствор йодида самария (II) (0,1 М в ТГФ, 19,2 см³, 1,92 ммоля). После окончания добавления реакционную смесь перемешивают еще в течение 30 минут и затем добавляют 2N HCl (20 см³). Смесь экстрагируют диэтиловым эфиром (3·30 см³). Объединенные эфирные слои промывают 10% раствором Na₂S₂O₃ (10 см³), водой (2·10 см³) и солевым раствором (2·10 см³). Раствор высушивают (Na₂SO₄), выпаривают, а полученный грубый остаток подвергают колоночной хроматографии (90: 10, гексан: этилацетат) с получением 122 мг (66%) смеси диастереомеров Boclle [2-(RS)- циано-ϑ(CH=CH)пирролидина] в виде бесцветного масла.

¹H ЯМР (CDCl₃) δ (ppm): 5,52 (1H, д., J = 9,6 Гц); 4,5 (1H, шс), 4,12 (1H, м): 3,35 (1H, м): 2,57 (1H, м); 2,38 (1H, м); 2,17 (1H, м): 1,91 (2H, м); 1,69 (2H, м), 1,53 (1H, м); 1,43 (9H, с); 1,12 (1H, м); 0,92 (1,5H, д., J=7,3 Гц); 0,91 (1,5H, д., J=7,3 Гц); 0,89 (1,5H, д., J = 6,6 Гц); 0,86 (1,5 H, т., J= 6,9 Гц).

Обработка полученной смеси диастереомеров 4N HCl/диоксаном в течение 60 минут удаляет защитные группы. Выпаривание растворителя и последующая ВЭЖХ с обращением фаз полученного остатка дает два чистых диастереомера.

(150), (47 мг, 60%) FAB Масс-спектр.: Вычислено 192,2, Найдено (М+H)⁺ = 193,2.

(151), (28 мг, 36%) FAB Масс-спектр.: Вычислено 192,2. Найдено (М+H)⁺ = 193,2
Препаративные методы, описанные применительно к таблицам 1-8 и к примерам от первого до седьмого, составляют часть настоящего изобретения.

Сокращения
Boc трет-бутилоксикарбонил
Bn бензил
BSA бычий сывороточный альбумин
ⁿBu н-бутил
Ch циклогексил
DMF, ДМФ диметилформамид
DMP десс-мартин периодан
EDTA, ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
FAB бомбардировка быстрыми атомами
Gua гуанидил
HPLC, ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
ⁿHx н-гексил
Масс-спектр. Масс-спектрометрия
mCPBA, мХПБК мета-хлорпербензойная кислота
Mol Wt, М.в. молекулярный вес
ONSu N-O-сукцинимид
Pfp. пентафторфенил
Ph фенил
Pip пиперидил
Prl пирролидид
Py пиридин
PyBop бензотриазол-1-ил-окси-трис-пирролидино-фосфония гексафторфосфат
WSCD, ВРКД водорастворимый карбодиимид
Z бензилоксикарбонил
Аналитическая высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) была предпринята на колонке Novapak C₁₈ с обращенной фазой (размер частиц 4 мк, 8х100 мм) с линейными градиентами возрастающих концентраций ацетонитрила в воде, с постоянной 0,1% концентрацией трифторуксусной кислоты; скорость тока 1,5 мл/мин.

Были использованы индивидуальные градиенты, представленные в табл. 9а и 10а.

Изучение токсичности у крыс см. в табл. 11а.

Формула изобретения

1. Ингибиторы процессов, связанных с DP-IV, выбранные из соединений с общей формулой A-B (группа I), где B означает

n равно 1 или 2;
m равно 0, 1 или 2;
X означает CH₂, S, SO, SO₂, O;
Y означает N,
R означает H, CN, CHO, B(OH)₂, A прикрепляется к Y, и
а) когда R означает H, A является альфа-аминоацильной группой, полученной из альфа-аминокислоты, несущей циклоалифатическую боковую цепь, или представляет собой бета-аминоацильную группу общей формулы

где p принимает значения от 1 до 6,
при этом кольцо в любом случае может содержать ненасыщенные связи и/или замещение гетероатомом; б) когда R означает CN, A соответствует определению, данному в (а), и, кроме того, может быть получен из любой L-альфа-аминокислоты, несущей липофильную боковую цепь, и в) когда R означает CHO или B(OH)₂, A означает бета-аминоацильную группу, определяемую в (а);
(группа II): B, n, m, X - как указано выше; R означает H, CN; A прикрепляется к Y, при этом A представляет собой

где a = 1 - 5;
D означает G-(CH₂)_b-(R₄)_q-R₃;
G означает NH или NMe;
b = 1 - 12;
q = 0 или 1;
R₄ означает Z-NH-(CH₂)_c или NH-Z-(CH₂)_c-,
где c = 1 - 12;
Z означает CO, CH₂;
R₃ = CO₂H или его эфир, CONH₂, CONR₅R₆, SO₂NH₂, SO₂NR₅R₆, OH, OR₅, замещенный или незамещенный арил, NH₂, NR₅R₆, NHCOR₅, NHSO₂R₅, NH-CH(: NR₅)NR₅R₆;
R₅ и R₆ выбирают, независимо друг от друга, из H, низших алкильных, фторалкильных групп, или R₅ и R₆, вместе с атомом азота, к которому они присоединены, составляют цепь C₃-C₈;
или A представляет собой (ii)

где R¹ = H, Me;
E = J-(CH₂)_b-(R₄)_q-R₃; J = CO;
a, b, q, R₃ и R₄ соответствуют определению, данному в (i);
или представляет собой (iii)

где R² = H, Me;
L означает (CH₂)_d-(CO)_r-(CH₂)_b-(R₄)_q-R₃, где
r = 1, d = 1 - 4;
b, q, R₃ и R₄ соответствуют определению, данному в (i).

2. Ингибиторы процессов, связанных с DP-IV по п.1, представляющие собой соединения с общей формулой: A-B (группа I), где B означает

n равно 1 или 2;
m равно 0, 1 или 2;
X означает CH₂, S, SO, SO₂;
R означает H, CN, CHO или B(OH)₂;
а) когда R означает H, A является альфа-аминоацильной группой, полученной из альфа-аминокислоты, несущей циклоалифатическую боковую цепь,
или представляет собой бета-аминоацильную группу общей формулы

где p принимает значения от 1 до 6,
при этом кольцо в любом случае может содержать ненасыщенные связи и/или замещение гетероатомом;
б) когда R означает CN, A соответствует определению, данному в (а), и, кроме того, может быть получен из любой L-альфа-аминокислоты, несущей липофильную боковую цепь, и в) когда R означает CHO или B(OH)₂, A означает бета-аминоацильную группу, определяемую в (а).

3. Ингибиторы по п.2, в которых B представляет собой 5-тичленное кольцо; n принимает значение 1; X означает CH₂ или S; Y означает N; R означает CN.

4. Ингибиторы по п.1, представляющие собой соединение с общей формулой A-B (группа II), где B означает

n равно 1 или 2;
m равно 0, 1 или 2;
X означает CH₂, O, S, SO, SO₂;
R означает H или CN, A прикрепляется к Y, при этом A представляет собой

где a означает 1 - 5;
D означает G-(CH₂)_b-(R₄)_q-R₃;
G означает NH или NMe;
b = 1 - 12;
q = 0 или 1;
R₄ означает Z-NH-(CH₂)_c или NH-Z-(CH₂)_c-, где c = 1 - 12, а Z означает CO, CH₂;
R₃ означает CO₂H или его эфир, CONH₂, CONR₅R₆, SO₂NH₂, SO₂NR₅R₆, OH, OR₅, замещенный или незамещенный арил, NH₂, NR₅R₆, NHCOR₅, NHSO₂R₅, NH-CH(: NR₅)NR₅R₆;
R₅ и R₆ выбирают, независимо друг от друга, из H, низших алкильных, фторалкильных групп или R₅ и R₆, вместе с атомом азота, к которому они присоединены, составляют цепь C₃-C₈;
или A представляет собой (ii)

где R¹ означает H, Me;
E означает J-(CH₂)_b-(R₄)_q-R₃;
J означает CO;
a, b, q, R₃ и R₄ соответствуют определению, данному в (i);
или A представляет собой (iii)

где R² означает H или Me;
L означает (CH₂)_d-(CO)_r-(CH₂)_b-(R₄)_q-R₃, где r = 1, d = 1 - 4;
b, q, R₃ и R₄ соответствуют определению, данному в (i).

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35