Набор для определения антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни птиц

 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Набор содержит очищенный и инактивированный антиген вируса ИББ, иммобилизированный на твердом носителе, сухую положительную сыворотку крови кур к вирусу ИББ, отрицательную сыворотку крови кур и сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащие карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2. Из неспецифических компонентов набор содержит трис-буферный раствор, фосфатно-цитратный буфер, краситель ортофенилендиамин или 2,2'-азино-ди[3-этил]бензтиазолинсульфоновую кислоту, детергент твин-20 и гидроперит. Набор обладает более высокой активностью и специфичностью. 11 з.п. ф-лы, 6 табл.

Изобретение относится к области диагностики, ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к получению наборов для обнаружения антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни (ИББ) птиц в иммуноферментном анализе (ИФА), и может быть использовано при диагностике ИББ в научно-исследовательских учреждениях, региональных и областных ветеринарных лабораториях и при изготовлении указанных наборов на предприятиях биологической промышленности.

ИББ птиц (болезнь Гамборо) - это вирусное высококонтагиозное заболевание, характеризующееся поражением фабрициевой сумки, почек, внутримышечными геморрагиями, диареей. В основном ИББ поражает В-лимфоциты фабрициевой сумки, вызывая атрофию ее лимфоидных фолликулов. Важными средствами борьбы против ИББ, причиняющей экономический ущерб за счет гибели 20-70% птиц при остром ее течении, снижения привесов и проявления вторичных инфекций на фоне иммунодепрессивного воздействия вируса на организм птиц, является своевременная диагностика заболевания и его вакцинопрофилактика. ИББ протекает остро, с характерной клиникой заболевания и субклинически. Широкое распространение имеет субклиническая форма. При острой форме болезни на первый план выступают клинические и патологоанатомические признаки, свойственные вторичным инфекциям, что создает затруднения при постановке диагноза. Диагноз на ИББ устанавливают на основании клинических, патолого-анатомических и эпизоотических данных, а также вирусологических и серологических исследований. Серологическая диагностика ИББ является наиболее распространенной, как в аспекте ретроспективного отслеживания возможных вспышек заболевания, так оценки эффективности его специфической профилактики. Для обнаружения вирусного антигена или специфических антител, свидетельствующих о контакте птиц с вирусом, используют различные серологические тесты, позволяющие выявлять комплексы антиген-антитело (иммунные комплексы). Такими тестами является: реакция диффузионной преципитации (РДП) и иммуноферментный анализ (ИФА). Иногда при диагностике ИББ применяют реакцию нейтрализации вируса (РН), реакцию иммунофлюоресценции (РИФ), латексной агглютинации и обратной пассивной гемагглютинации.

Сущность РДП состоит в том, что при взаимонаправленной диффузии антител и антигена в геле, имеющем определенную полимерную структуру, образуются иммунные комплексы, которые приводят к изменению оптической плотности по типу преципитата (1). Установлено, что в РДП преципитирующие антитела могут быть обнаружены в сыворотках крови через 5 дней после экспериментального заражения или вакцинации с последующим возрастанием их концентрации. Максимальная интенсивность реакции наблюдается к 21 дню и постепенно снижается. Эффект преципитации наблюдается еще до 20 недель. У цыплят, полученных от несушек, интенсивно реагирующих в РДП, преципитирующие антитела могут быть обнаружены до 5-6-дневного возраста (2).

ИФА в 1000-1400 раз более чувствительна, чем РДП. ИФА позволяет выявлять антиген в различных тканях птиц и эмбрионов, тогда как РДП способна обнаружить антиген ИББ только в ткани фабрициевых сумок на 2-6 день после инфицирования, т.е. в период максимального накопления вируса. Данное обстоятельство практически исключает возможность использования РДП для оценки концентрации антигена в сырье для производства вакцин.

Большинство методов, позволяющих контролировать уровень антител к вирусу ИББ в сыворотках крови кур, а также присутствие вируса или его антигена в биологических материалах, основано на ИФА. Для выявления антител к вирусу ИББ и определения их концентрации в сыворотках крови получил распространение непрямой вариант ИФА, в котором исследуемый образец взаимодействует с антигеном, иммобилизованным на планшете из оптически прозрачного полимера с 96 лунками. Далее антитела в составе иммунных комплексов реагируют с конъюгатом. Результаты анализа с высокой точностью фиксируют средствами спектрофотометрии. Для обнаружения и оценки титра антигена вируса ИББ в биологических материалах широко применяют непрямой сэндвич-вариант ИФА, при осуществлении которого исследуемый антиген вначале улавливается специфическими антителами, иммобилизованными на планшете, а затем выявляется детекторными антителами, с которыми взаимодействует конъюгат. Результаты анализа фиксируют также с помощью спектрофотометра.

Достоинством ИФА являются высокая чувствительность и специфичность, возможность проведения масштабных исследований в полевых условиях, оперативность проведения анализов, небольшие объемы исследуемых проб и возможность автоматизации практически всех стадий выполнения реакции, включая регистрацию и обработку получаемых результатов (3).

В настоящее время фирмы, специализирующиеся на производстве средств для молекулярно-биологической диагностики, выпускают специальные наборы для проведения ИФА с целью обнаружения сывороточных антител к вирусам, вызывающим различные заболевания кур, в том числе и ИББ.

Известен набор для определения антител к вирусам ИББ, НБ и ИБК у птиц в крови, сыворотке крови или яичном желтке (полуколичественный метод) в ИФА. Антигены вирусов ИББ, НБ и ИБК нанесены отдельно на пластиковую гребенку. Реакция протекает внутри ячеек проявляющих пластин. В состав набора включены 3 карточки гребенки "Immunocomb", 3 проявляющие пластины, 3 листка бумаги для образцов с предварительно нанесенными дисками, 4 ланцета для взятия проб крови, 1 пинцет, 1 калибровочная цветовая шкала "CombScale", 1 пробирка с сывороткой для положительного контроля, 1 пробирка с сывороткой для отрицательного контроля, график "CombScore". Набор используется для оценки эффективности вакцинации, определения наиболее приемлемых сроков вакцинации и периодического серологического анализа стад с целью быстрой и эффективной диагностики заболеваний (4).

Известен набор для определения антител к вирусу ИББ птиц в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген вируса ИББ, отрицательную сыворотку крови, антикуриный пероксидазный конъюгат, раствор для разведения и промывки сывороток и конъюгата, окрашивающий раствор 2,2'-азино-ди [3-этил] бензтиазолинсульфоновой кислоты (АБТС) и раствор, останавливающий окраску реакции - 5% SDS. Измерение оптической плотности проводят с использованием фильтра 405-410 нм. С помощью данного набора исследуют полевые сыворотки на наличие антител к вирусу ИББ и проводят количественную оценку титра антител (5).

Известен набор для определения антител к вирусу ИББ птиц в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген вируса ИББ, иммобилизованный на твердом носителе, положительную сыворотку крови кур к вирусу ИББ, отрицательную сыворотку крови кур к вирусу ИББ, щелочной фосфатазный конъюгат овечьих антител к куриным IgG, буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов (фосфатный буфер с белковыми стабилизаторами), субстратный буфер (диэтаноламиновый буфер с энзим-факторами), таблетки pNPP, останавливающий раствор. С помощью данного набора можно измерять уровень антител к вирусу ИББ в сыворотках крови кур (6).

Известен набор для определения антител к вирусу ИББ птиц в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген вируса ИББ, иммобилизованный на твердом носителе, положительную сыворотку крови кур к вирусу ИББ, отрицательную сыворотку крови кур к вирусу ИББ, препарат козьих антител к куриным IgG, конъюгированных с пероксидазой хрена, с гентамицином, буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов, буферный раствор для разведения концентрата субстрата ТМВ, останавливающий раствор.

Данный набор позволяет измерять уровень антител к вирусу ИББ в сыворотках крови кур (7).

Общим недостатком указанных наборов является то, что они импортные, что определяет высокую себестоимость соответствующих исследований.

Известен набор для определения антител к вирусу ИББ птиц в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген вируса ИББ, иммобилизованный на твердом носителе, положительную сыворотку крови кур к вирусу ИББ, отрицательную сыворотку крови кур к вирусу ИББ, лиофильно высушенный антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов, субстратный буфер, детергент твин-20, краситель, 5-аминосалициловую кислоту, гидроперит (8). Недостатки данного набора состоят в его низкой активности и специфичности, а также высокой себестоимости изготовления.

Известен также карбоксилсодержащий катионит КБ-4-П2, который является органическим ионообменным веществом слабокислотного типа в натриевой форме. Известно его применение для селективного удаления небольших количеств двухвалентных катионов из смесей с большими концентрациями одновалентных катионов, для очистки катионного обмена (9).

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является набор для определения антител к вирусу ИББ птиц в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген вируса ИББ кур, иммобилизованный на твердом носителе, сухие положительную сыворотку крови кур к вирусу ИББ, отрицательную сыворотку крови кур к вирусу ИББ и антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащие 5% сахарозы или желатозы, или лактозы, буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов, субстратный буфер, краситель, детергент и гидроперит (10, 11).

Недостатки набора - прототипа состоят в его низкой активности и специфичности, а также высокой себестоимости изготовления. Это объясняется тем, что в наборе-прототипе используются лиофилизированные биокомпоненты, сложность получения которых заключается в том, что для лиофилизации необходимо использовать оптимальные объемы нативного материала (минимум 0,5 см³), иначе невозможно получить нормальную таблетку. Даже используя для лиофилизации такие минимальные объемы, существует опасность размораживания материала при загрузке и потери активности при высушивании, особенно конъюгата и специфической сыворотки. Процесс лиофилизации с предварительным замораживанием продолжается около 3 суток. Кроме того, при регидратации таблеток и разведении конъюгата до рабочего состояния после использования излишки ценных биокомпонентов подвергают утилизации, так как они не подлежат хранению.

В задачу создания настоящего изобретения входила разработка набора для определения антител к вирусу ИББ птиц в ИФА, обладающего более высокой активностью и специфичностью и низкой себестоимостью изготовления.

Технический результат от использования изобретения заключается в повышении активности и специфичности набора и снижении себестоимости его изготовления.

Указанный технический результат достигнут созданием изобретения, охарактеризованного следующей совокупностью признаков: 1. Набор для определения антител к вирусу ИББ птиц в ИФА.

1.1. Очищенный и инактивированный антиген вируса ИББ кур, иммобилизованный на твердом носителе.

1.2. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИББ дополнительно содержит карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

1.2.1. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИББ и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%: Положительная сыворотка - 2 - 15 Катионит КБ-4П-2 - До 100 1.2.2. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИББ, полученная контактным обезвоживанием.

1.3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур дополнительно содержит карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

1.3.1. Сухая отрицательная сыворотка крови кур к вирусу ИББ и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%: Отрицательная сыворотка - 2 - 15 Катионит КБ-4П-2 - До 100 1.3.2. Сухая отрицательная сыворотка крови кур к вирусу ИББ, полученная контактным обезвоживанием.

1.4. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур дополнительно содержит карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

1.4.1. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%: Антивидовой иммунопероксидазный конъюгат - 2 - 15 Катионит КБ-4П-2 - До 100
1.4.2. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием.

1.5. Буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов.

1.5.1. В качестве буферного раствора для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов набор содержит трис-буферный раствор.

1.6. Субстратный буфер.

1.6.1. В качестве субстратного буфера набор содержит фосфатно-цитратный буфер.

1.7. Детергент.

1.7.1. Из детергентов набор содержит твин-20.

1.8. Краситель.

1.8.1. Из красителей набор содержит ортофенилендиамин (ОФД).

1.8.2. Из красителей набор содержит АБТС.

1.9. Гидроперит.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1. Набор для определения антител к вирусу ИББ птиц в ИФА.

1.1. Очищенный и инактивированный антиген вируса ИББ кур, иммобилизованный на твердом носителе.

1.2. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИББ дополнительно содержит карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

1.3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур дополнительно содержит карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

1.4. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур дополнительно содержит карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

1.5. Буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов.

1.6. Субстратный буфер.

1.7. Детергент.

1.8. Краситель.

1.9. Гидроперит.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы его выполнения или особые условия использования:
1. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИББ и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Положительная сыворотка - 2 - 15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
2. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИББ, полученная контактным обезвоживанием.

3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Отрицательная сыворотка - 2 - 15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
4. Сухая отрицательная сыворотка крови кур, полученная контактным обезвоживанием.

5. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Конъюгат - 2 - 15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
6. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием.

7. В качестве буферного раствора для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов набор содержит трис-буферный раствор.

8. В качестве субстратного буфера набор содержит фосфатно-цитратный буфер.

9. Из детергентов набор содержит твин-20.

10. Из красителей набор содержит ОФД.

11. Из красителей набор содержит АБТС.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый набор и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1. Набор для определения антител к вирусу ИББ птиц в ИФА.

2. Очищенный и инактивированный антиген ИББ кур, иммобилизованный на твердом носителе.

3. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИББ кур.

4. Сухая отрицательная сыворотка крови кур.

5. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур.

6. Буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов.

7. Субстратный буфер.

8. Детергент.

9. Краситель.

10. Гидроперит.

По сравнению с набором-прототипом существенными отличительными признаками предлагаемого набора являются:
1. Сухая положительная сыворотка крови кур дополнительно содержит карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

2. Сухая отрицательная сыворотка кур дополнительно содержит карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

3. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур дополнительно содержит карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы его выполнения или особые условия использования:
1. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИББ и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Положительная сыворотка - 2 - 15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
2. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИББ, полученная контактным обезвоживанием.

3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур к вирусу ИББ и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Отрицательная сыворотка - 2 - 15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
4. Сухая отрицательная сыворотка крови кур к вирусу ИББ, полученная контактным обезвоживанием.

5. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Антивидовой иммунопероксидазный конъюгат - 2 - 15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
6. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием.

7. В качестве буферного раствора для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов набор содержит трис-буферный раствор.

8. В качестве субстратного буфера набор содержит фосфатно-цитратный буфер.

9. Из детергентов набор содержит твин-20.

10. Из красителей набор содержит ОФД.

11. Из красителей набор содержит АБТС.

Предлагаемый набор обладает более высокой активностью и специфичностью и низкой себестоимостью изготовления.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволили установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемого набора, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. В результате поиска установлено следующее.

Известно использование карбоксилсодержащего катионита КБ-4П-2 для селективного удаления небольших количеств двухвалентных катионов из смесей с большими концентрациями одновалентных катионов, а также для очистки стрептомицина и других реакций катионного обмена (9). Для высушивания микроколичеств иммуноспецифических компонентов предлагаемого набора авторами использован впервые карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2, при этом авторами обнаружено новое, ранее неизвестное, свойство катионита КБ-4П-2 не изменять нативные характеристики иммуноспецифических компонентов при обезвоживании и одновременно повышать их специфичность и активность.

Результаты поиска показывают, что предлагаемое изобретение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены аналогичные решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата. Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Сущность изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1.

Набор для определения антител к вирусу ИББ птиц в ИФА содержит следующие компоненты: очищенный и инактивированный антиген вируса ИББ кур, штамм "БГ", нанесенный на пластиковый планшет (два планшета), дополнительно содержащие карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 сухие положительную сыворотку крови кур к вирусу ИББ (одна ампула), отрицательную сыворотку крови кур (одна ампула) и антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобинов кур (одна ампула), а также набор солей для приготовления трис-буферного раствора, используемого для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов и содержащего трис (оксиметил) аминометан в количестве 0,97 г, трис (оксиметил) аминометан гидрохлорид в количестве 6,61 г, хлористый натрий в количестве 11,7 г (три флакона), набор солей для приготовления субстратного буфера, содержащего натрий фосфорнокислый двузамещенный в количестве 5,37 г и лимонную кислоту в количестве 1,57 г (фосфатно-цитратный буфер - два флакона), ОФД (одна таблетка) или АБТС (одна таблетка), детергент твин-20 (один флакон), гидроперит (одна таблетка).

Пример 2.

Для изготовления антигена вируса ИББ используют производственный штамм "БГ". Вирус культивируют на 9-11-дневных SPF-эмбрионах кур при 37^oС и влажности 60%. Первый пассаж является матровой расплодкой, которую используют для получения необходимого количества вируссодержащего сырья. Вируссодержащий материал, включающий пенициллин - стрептомициновую смесь (200-300 Ед/см³), инокулируют в объеме 0,2 см³ на хориоаллантоиссную оболочку (ХАО) в области пуги. Инфицированные эмбрионы содержат при стандартных условиях. Специфическое действие вируса проявляется между 24 и 96 часами с момента заражения. В этот период производят овоскопию с интервалом 3-4 час. Эмбрионы с признаками остановки сердца (отсутствие кровенаполнения сосудов) и отбирают и охлаждают до 2-6^oС. На коллоидной мельнице или РТ-приборе из отобранных эмбрионов получают мелкодисперсный гомогенат тканей и жидкостей эмбрионов (30% суспензия на изотоническом фосфатно-буферном растворе (ФБР) со средним размером частиц 0,1-0,3 мм). Полученную суспензию замораживают при -70^oС, оттаивают и центрифугируют при 2000 g в течение 15 мин для осаждения крупнодисперсных компонентов. Супернатант используют в качестве вируссодержащего материала, который хранят в замороженном (при -70^oС) или лиофилизованном состоянии. Полученный вирус подвергают инактивации. Для этого в полученную вируссодержащую суспензию вносят аминоэтилэтиленимин до концентрации 0,2%. Инактивацию ведут при 27^oС в течение 24 час при периодическом перемешивании смеси. По окончании инактивации к полученному антигену добавляют 20% хлороформа и смесь шуттелируют в течение 10 минут. Полученную взвесь центрифугируют при 3000 g в течение 15-20 мин и отбирают супернатант. Для осаждения антигена к супернатанту добавляют 7,5% ПЭГ и выдерживают при 4^oС в течение 16 часов. Осадок собирают центрифугированием при 17000 g в течение 20 мин и ресуспендируют в ФБР из расчета 1/20 от исходного объема. Затем антиген фракционируют дополнительно в сформированном ступенчатом градиенте плотности хлористого цезия и сахарозы. Для этого в стаканах для ультрацентрифугирования образуют градиент, состоящий из равных объемов раствора CsCl раствора сахарозы. Инактивированную суспензию в объеме 1/5 от общего объема наносят на градиент и центрифугируют при 70000 g в течение 3 часов. Фракционирование градиента проводят на проточном спектрофотометре при длине волны 280 нм. Фракции, соответствующие пикам оптической плотности, объединяют и диализируют при ФБР при 4^oС в течение 12-18 час. Чистоту и гомогенность антигенных препаратов контролируют электронной микроскопией, спектрофотометрией и электрофорезом вирусных белков в SDS-ПААГе.

Полученный антиген контролируют на остаточную инфекционность. Для этого антиген восстанавливают пенициллин-стрептомициновой смесью на ФБР до объема, предшествующего процедуре концентрирования. Полученный материал исследуют на присутствие инфекционного вируса на куриных эмбрионах. В контроле используют не менее 30 эмбрионов, которые в течение 5 суток не должны проявлять специфических признаков развития инфекционного процесса, характерного для вируса ИББ. В случае сомнительного результата процедуру контроля повторяют.

Полученный антиген подвергают морфологическому контролю путем оценки структурного состояния вирионов с помощью электронного микроскопа. Содержание разрушенных или частично поврежденных вирусных частиц не должно превышать 1/3 от числа наблюдаемых вирионов.

Активность и специфичность полученного антигена определяют в непрямом варианте ИФА. Для этого антиген иммобилизуют на планшет в различных концентрациях (разведения от 1: 50 до 1:300) и исследуют в непрямом варианте ИФА. Определяют ту концентрацию (разведение), при которой специфичная к ИББ гипериммунная сыворотка кур демонстрирует титр не менее чем 1:12800. Исключают неспецифические реакции. Исследуемый антиген не должен специфически реагировать с сыворотками, имеющими антитела к вирусам: бронхита, ньюкаслской болезни, адено-, рео-, ларинготрахеита, а также к бактериальным антигенам: сальмонеллеза и пастереллеза.

Прошедший необходимые тесты препарат антигена вируса ИББ используют для иммобилизации на планшеты. Количество антигена, необходимое для изготовления партии наборов, размораживают и готовят рабочее разведение в буфере для разведения антигена. После инкубации в течение 18 часов при ^oС или 2 часов при 37^oС раствор антигена удаляют, планшеты промывают буфером и вносят по 0,1 см³ блокирующего раствора. Инкубируют 1 час при комнатной температуре и промывают 3 раза буфером. Планшеты высушивают на воздухе и упаковывают в полиэтиленовые пакеты поштучно.

Пример 3. Для получения положительной сыворотки в качестве доноров используют безлейкозных цыплят в возрасте 21-42 дней, которым инокулируют производственный штамм "БГ" вируса инфекционной бурсальной болезни кур с инфекционной активностью не ниже 10000 ЭИД₅₀/см³ в дозе 100 ЭИД₅₀/0,2 см³ интраназально. Через 21 сутки птицу подвергают гипериммунизации. Для гипериммунизации используют антиген вируса ИББ, полученный так, как описано в примере 1. Предварительно антиген эмульгируют 3-5минут в тканевом гомогенизаторе с равным объемом масляного адъюванта типа неполного адъюванта Фрейнда. Препарат вводят цыплятам внутримышечно в грудную мышцу или подкожно в область шеи в дозе 0,5 см³. Спустя 10 суток проводят пробное взятие крови для определения активности гипериммунной сыворотки в РДП. В случае, если она проявляется в разведениях не ниже 1:16, цыплят тотально обескровливают с соблюдением правил асептики и антисептики в увлажненные физиологическим раствором пробирки. Если активность сывороток ниже указанного максимального уровня, проводят дополнительную иммунизацию свежеприготовленным антигеном с адъювантом, а спустя 10 суток доноров тотально обескровливают. Индивидуальные пробы крови выдерживают сначала при +37^oС в течение 30-60 мин, а затем при +4^oС в течение суток. Отстоявшуюся сыворотку отсасывают в стерильные пробирки, не допуская попадания эритроцитов и других форменных элементов крови, инактивируют при +57^oС в течение 30 минут, консервируют хинозолом в соотношении 1:1000. Полученную сыворотку смешивают с карбоксилсодержащим катионитом КБ-4П-2 в соотношении, мас.%, 2:98-15:85 (указанные соотношения являются оптимальными) и подвергают контактному обезвоживанию.

Пример 4.

Проведены сравнительные испытания в ИФА сухой положительной сыворотки крови кур к вирусу ИББ, дополнительно содержащей карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученной контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
Положительная сыворотка - 2,0
Катионит КБ-4П-2 - 98,0.

Результаты испытаний представлены в таблице 1.

Представленные в таблице 1 данные свидетельствуют о том, что полученная методом контактного обезвоживания сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИББ превосходит по активности и специфичности таковую прототипа, полученную методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.

Пример 5.

Проведены сравнительные испытания в ИФА сухой положительной сыворотки крови кур к вирусу ИББ, дополнительно содержащей карбоксилсодержащий катионит КП-4П-2 и полученной контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
Положительная сыворотка - 7,0
Катионит КБ-4П-2 - 93,0
Результаты испытаний представлены в таблице 2.

Представленные в таблице 2 данные свидетельствуют о том, что полученная методом контактного обезвоживания сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИББ превосходит по активности и специфичности таковую прототипа, полученного методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.

Пример 6.

Проведены сравнительные испытания в ИФА сухой положительной сыворотки крови кур к вирусу ИББ, дополнительно содержащей карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученной контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет мас.%:
Положительная сыворотка - 15,0
Катионит КБ-4П-2 - 85,0
Результаты испытаний представлены в таблице 3.

Представленные в таблице 3 данные свидетельствуют о том, что полученная методом контактного обезвоживания сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИББ превосходит по активности и специфичности таковую прототипа, полученную методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.

Пример 7.

Используемую в качестве компонента набора отрицательную сыворотку крови кур к вирусу ИББ получают от здоровой безлейкозной птицы. К полученной сыворотке добавляют карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 в соотношении, мас.%, 2: 98-15: 85 (указанные соотношения являются оптимальными) и подвергают контактному обезвоживанию.

Пример 8.

В предлагаемом наборе используют антивидовые коммерческие конъюгаты, выпускаемые НИИЭМ имени Н.Ф.Гамалея, представляющие собой глобулиновую фракцию, выделенную из антисыворотки, полученной иммунизацией кур и меченную пероксидазой хрена. К конъюгату добавляют карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 в соотношении, мас.%, 2:98-15:85 (указанные соотношения являются оптимальными) и подвергают контактному обезвоживанию.

Пример 9.

Проведены сравнительные испытания в ИФА сухого антивидового иммунопероксидазного конъюгата против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащего карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученный контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
Конъюгат - 2,0
Катионит КБ-4П-2 - 98,0
Результаты испытаний представлены в таблице 4.

Представленные в таблице 4 данные свидетельствуют о том, что полученный методом контактного обезвоживания сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат превосходит по активности и специфичности таковой прототипа, полученный методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.

Пример 10.

Проведены сравнительные испытания в ИФА сухого антивидового иммунопероксидазного конъюгата против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащего карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученного контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
Конъюгат - 7,0
Катионит КБ-4П-2 - 93,0.

Результаты испытаний представлены в таблице 5.

Представленные в таблице 5 данные свидетельствуют о том, что полученный методом контактного обезвоживания сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат превосходит по активности и специфичности таковой прототипа, полученный методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.

Пример 11.

Проведены сравнительные испытания в ИФА сухого антивидового иммунопероксидазного конъюгата против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащего карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученного контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
Конъюгат - 15,0
Катионит КБ-4П-2 - 85,0
Результаты испытаний представлены в таблице 6.

Представленные в таблице 6 данные свидетельствуют о том, что полученный методом контактного обезвоживания сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат превосходит по активности и специфичности таковой прототипа, полученный методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:
- набор для определения антител к вирусу ИББ кур в ИФА, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов %;
- набор для определения антител к вирусу ИББ кур в ИФА, приготовленный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой активностью и специфичностью, а также низкой себестоимостью изготовления.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации
1. Manual of standards for diagnostic tests and Vaccines. Office International des Epizooties, world Organisation for Animal Health. Paris, 1966, 723 p.

2. Cullen G.A., Wyeth P.J. Quantitation of antibodies to infectious bursal disease. Vet. Rec., 1975, 97, 315.

3. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я. и др. Вирусные болезни животных. М., ВНИТИБП, 1998, 65-84.

4. Временное наставление по применению диагностического набора "Иммунокомб IBD/ND/IBV для определения антител против возбудителей инфекционной бурсальной болезни (ИББ), болезни Нью-Кастла (БН) и инфекционного бронхита (ИБ) у птиц (фирма "Биогал", Израиль). Одобрено Советом по ветеринарным препаратам. Протокол 2 от 27.03.96, 10 с.

5. Infectious bursal disease antibody test fcit. Instruction. Catalog 54-81-01/КРL (Kirkegaard and Perry Laboratories), US, 2 Cessna Court Gaithersburg Maryland 20879, 8006383167.

6. Infectious bursal disease antibody test kit. Instruction. Catalog Code CK 113. BioChek C.V. Weth, Venteweg. 143.2805 J N Gonda, Holland.

7. IDEXX's instruction for an enzyme immunoassay for the detection of antibody in chicken serum. IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, USA, 1996, 30 р.

8. Временное наставление по выявлению антител к вирусу ИББ кур иммуноферментным анализом. Утверждено Департаментом ветеринарии МСХП РФ 05.06.98, 13-7-2/1262.

9. Краткая химическая энциклопедия. М., ГНИ "Сов. энциклопедия", 1963, т.2, 299-306.

10. Инструкция по изготовлению и контролю диагностикумов и наборов для определения антител против вируса ИББ иммуноферментным методом, утвержденная директором ВНИИЗЖ 06.12.99.

11. ТУ 9388-028-00495527-99 на "Набор для определения антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни иммуноферментным методом" (прототип).

Формула изобретения

1. Набор для определения антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни птиц иммуноферментным анализом, содержащий очищенный и инактивированный антиген вируса инфекционной бурсальной болезни, иммобилизованный на твердом носителе, сухую положительную сыворотку крови кур к вирусу инфекционной бурсальной болезни, сухую отрицательную сыворотку крови кур и сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, а также буферный раствор для разведения и промывки, субстратный буфер, детергент, краситель и гидроперит, отличающийся тем, что сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу инфекционной бурсальной болезни, сухая отрицательная сыворотка крови кур и сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур дополнительно содержат карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

2. Набор по п.1, отличающийся тем, что сухая положительная сыворотка и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Положительная сыворотка - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
3. Набор по п.1, отличающийся тем, что он содержит сухую положительную сыворотку крови кур к вирусу инфекционной бурсальной болезни, полученную контактным обезвоживанием.

4. Набор по п. 1, отличающийся тем, что сухая отрицательная сыворотка крови кур к вирусу инфекционной бурсальной болезни и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Отрицательная сыворотка - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
5. Набор по п.1, отличающийся тем, что он содержит сухую отрицательную сыворотку крови кур к вирусу инфекционной бурсальной болезни, полученную контактным обезвоживанием.

6. Набор по п.1, отличающийся тем, что сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Конъюгат - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
7. Набор по п.1, отличающийся тем, что он содержит сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием.

8. Набор по п.1, отличающийся тем, что в качестве буферного раствора он содержит трис-буферный раствор.

9. Набор по п.1, отличающийся тем, что в качестве субстратного буфера он содержит фосфатно-цитратный буфер.

10. Набор по п.1, отличающийся тем, что из детергентов он содержит твин-200.

11. Набор по п.1, отличающийся тем, что из красителей он содержит ортофенилендиамин.

12. Набор по п. 1, отличающийся тем, что из красителей он содержит 2,2'-азино-ди[3-этил]бензтиазолинсульфоновую кислоту.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3