Способ получения биологически активных пептидов каудальной нейросекреторной системы (кнсс) позвоночных

 

Изобретение относится к медицине и касается способа получения активных веществ, а именно пептидов КНСС из сырья животного происхождения, обладающих антиандрогенной и антиэстрогенной активностью. Пояснично-крестцовый отдел спинного мозга животных гомогенизируют в растворе хлорида натрия при соотношении 1:10, 1:15, экстрагируют экстракт, дважды насыщают сульфатом аммония и поэтапно центрифугируют в течение 25-30 мин при 6000-9000 об/мин, при первом осадок отбрасывают, а при втором его растворяют в 0,8-1%-ном растворе хлорида натрия, обессоливают, хроматографируют в УФ-спектре в пределах 220-280 нм и целевой продукт лиофилизируют. Технический результат: способ экологически безвреден, нетрудоемок, экономичен, сокращает время экстрагирования и получения осадка и позволяет получить активные пептиды высокой чистоты. 2 табл.

Изобретение относится к медицине и касается способа получения биологически активных веществ, а именно пептидов КНСС [1] из сырья животного происхождения.

Известен способ получения биологически активного вещества из сырья животного происхождения, обладающего антиандрогенной и антиэстрогенной активностью [2]. Он включает гомогенизацию спинного мозга, экстрагирования биологически активного вещества раствором хлорида натрия, центрифугирования водной взвеси мозга, осаждения вещества сульфатом аммония, растворения осадка в растворе хлорида натрия, обессоливания, хроматографирования и лиофильной сушки вещества.

Недостатком данного способа является получение смеси других веществ вместе с биологически активными пептидами КНСС, что при их применении в медицинской практике может вызвать нежелательные побочные эффекты. Кроме того, получение активного вещества из осадка достигалось фильтрованием, значительно удлиняющим время выделения конечного продукта.

Задача изобретения: получение биологически активных пептидов КНСС позвоночных, очищенных от других веществ.

Достигается это путем гомогенизации пояснично-крестцового отдела спинного мозга позвоночных, экстрагирования биологически активных пептидов раствором хлорида натрия, осаждением пептидов сульфатом аммония, растворением осадка в растворе хлорида натрия, обессоливания, хроматографирования в УФ-спектре и лиофильной сушке пептидов.

Способ осуществляется следующим образом: гомогенизируют пояснично-крестцовый отдел спинного мозга позвоночных и экстрагируют пептиды при 10-15^oС в течение, например, 25-30 минут в 0,8-1% растворе хлорида натрия в сочетании 1:10-1:15 с добавлением ЭДТА до 0,05%. Центрифугируют взвесь мозга в течение 25-30 минут при 6000-9000 об/мин при 5-10^oС, дважды осаждают сульфатом аммония при 5-10^oС.

При первом 9% насыщении осаждают высокомолекулярные белки, отбрасывают их и повторным насыщением экстракта сульфатом аммония до 39-40% осаждают биологически активные пептиды, растворяют осадок в 0,85-1%-ном растворе хлорида натрия, обессоливают, хроматографируют в УФ-спектре с получением очищенных пептидов, лиофилизируют их. Выход активных пептидов составляет 250 мкг на 1 кг сырья. Полученные таким способом пептиды обладают выраженной антиандрогенной (табл. 1) и антиэстрогенной (табл.2) активностью. Они имеют молекулярную массу 1300, что подтверждено методом тонкослойной хроматографии. Пептиды разрушаются протеазами, инактивируются при кипячении или содержании их в термостате при 37^oС в течение 1 часа. Они осаждаются депротеинизирующими средствами: хлоридом натрия, сернокислым аммонием, тетрауксусной кислотой.

При использовании в качестве сырья пояснично-крестцового отдела спинного мозга предлагаемые в способе параметры температуры, среды, концентрации эстрагена, его соотношение с гомогенатом мозга, скорость центрифугирования являются оптимально допустимыми. Так использование мозга на всем протяжении увеличивает долю балластных веществ, энергии, объема исходного гомогената и времени получения конечного продукта. Экстрагирование ниже 10^oС ведет к возрастанию времени экстракции пептидов более 1,5 часа, а выше 15^oС происходит частичная их инактивация.

Концентрация раствора хлорида натрия менее 0,8% снижает степень экстракции пептидов, их выход и увеличивает время этого процесса, а выше 1% способствует осаждению части пептидов, снижая их выход.

Соотношение эстрагена с гомогенатом мозга менее 1:10 уменьшает степень экстракции пептидов и их выход, а увеличение больше чем 1:15 не дает положительного эффекта.

Центрифугирование взвеси мозга при скорости ниже 6000 об/мин ухудшает осаждение взвешенных частиц мозга и увеличивает время этого процесса до 1 часа, а скорость более 9000 об/мин не повышает эффективность отделения взвешенных частиц мозга.

Центрифугирование при 5-10^oС необходимо для сохранения активности термолабильных пептидов. Снижение температуры менее 5^oС удлиняет время осаждения взвешенных частиц до 1 часа, выше 10^oС - приводит к снижению активности пептидов.

Пример 1. Берут 100 г свежего или замороженного спинного мозга животного на протяжении пояснично-крестцового отдела, гомогенизируют на волчке. Гомогенат заливают 10 частями 0,8% раствора хлорида натрия с добавлением 0,05% ЭДТА. Экстракцию проводят при 10^oС в течение 30 мин при постоянном встряхивании. Центрифугируют взвесь мозга в течение 25 мин на рефрижераторной центрифуге при 10^oС со скоростью 9000 об/мин, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость дважды насыщают сульфатом аммония при 15^oС. Первым 9% насыщением сульфата аммония осаждают высокомолекулярные белки, которые отделяют центрифугированием при 6000 об/мин на рефрижераторной центрифуге при 10^oC в течение 20 мин и отбрасывают. Надосадочную жидкость вновь насыщают до 39% сульфатом аммония, осаждая биологически активные пептиды КНСС. Осадок получают путем центрифугирования при 10^oС на рефрижераторной центрифуге в течение 30 мин со скоростью 9000 об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают. Полученный осадок растворяют в 0,85% растворе хлорида натрия, обессоливают, хроматографируют в УФ-спектре в пределах от 220 до 280 нм и лиофилизуют чистые пептиды. Выход активного вещества составляет 25 мкг, т.е. 250 мкг на 1 кг сырья.

Пример 2. Берут 100 г свежего или замороженного спинного мозга животного на протяжении пояснично-крестцового отдела, гомогенизируют на волчке. Гомогенат заливают 15 частями 0,9%-ного раствора хлорида натрия с добавлением 0,05% ЭДТА. Экстракцию проводят при 12^oС в течение 30 мин при постоянном встряхивании. Центрифугируют взвесь мозга в течение 30 мин на рефрижераторной центрифуге при 5^oС со скоростью 8000 об/мин, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость дважды насыщают сульфатом аммония при 15^oС. Первым 10% насыщением сульфата аммония осаждают высокомолекулярные белки, которые отделяют центрифугированием при 6000 об/мин на рефрижераторной центрифуге в течение 25 мин и отбрасывают. Вторым - 40% насыщением сульфатом аммония осаждают биологически активные пептиды КНСС. Осадок получают центрифугированием при 8000 об/мин при 7^oС на рефрижераторной центрифуге в течение 30 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают. Полученный осадок растворяют в 0,9%-ном растворе хлорида натрия, обессоливают, хроматографируют в УФ-спектре в пределах от 230 до 280 нм и лиофилизуют чистые пептиды. Выход активного вещества составляет 25 мкг, т.е. 250 мкг на 1 кг сырья.

Пример 3. Берут 100 г свежего или замороженного спинного мозга животного на протяжении пояснично-крестцового отдела, гомогенизируют на волчке. Гомогенат заливают 15 частями 1%-ного раствора хлорида натрия с добавлением 0,05% ЭДТА. Экстракцию проводят при 15^oС в течение 25 мин при постоянном встряхивании. Центрифугируют взвесь ткани мозга в течение 28 мин на рефрижераторной центрифуге при 8^oС со скоростью 7000 об/мин, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость дважды насыщают сульфатом аммония при 14^oС. Первым 10% насыщением сульфата аммония осаждают высокомолекулярные белки, которые отделяют центрифугированием при 7000 об/мин на рефрижераторной центрифуге в течение 30 мин и отбрасывают. Вторым 39% насыщением надосадочной жидкости сульфатом аммония осаждают биологически активные пептиды КНСС. Осадок получают центрифугированием при 9000 об/мин при 10^oС в течение 25 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают. Полученный осадок растворяют в 0,85%-ном растворе хлорида натрия, обессоливают, хроматографируют в УФ-спектре в пределах от 250 до 280 нм и лиофилизуют чистые пептиды. Выход активных пептидов составляет 25 мкг, т.е. 250 мкг на 1 кг сырья.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет сократить время выделения, сэкономить энергию и получить биологически активные пептиды КНСС позвоночных в высокой степени чистоты.

Источники информации 1. Бахтинов А. Инкреторная функция каудального отдела спинного мозга и его физиологическое значение // Мед. Газета - 1997. - 22 - С.7 2. Бахтинов А.П. Патент РФ 2074726 на изобретение "Способ получения биологически активного вещества, обладающего антиандрогенной и антиэстрогенной активностью".

Формула изобретения

Способ получения биологически активных пептидов каудальной нейросекреторной системы позвоночных, обладающих антиандрогенной и антиэстрогенной активностью, заключающийся в том, что пояснично-крестцовый отдел спинного мозга животных гомогенизируют с 0,8-1%-ным раствором хлорида натрия при соотношении 1:10, 1:15, экстрагируют в нем в течение 25-30 мин при 10-15°С, экстракт дважды насыщают сульфатом аммония и поэтапно центрифугируют 25-30 мин при 6000-9000 об/мин, при первом осадок отбрасывают, а при втором его растворяют в 0,8-1%-ном растворе хлорида натрия, обессоливают, хроматографируют в УФ-спектре в пределах 220-280 нм и целевой продукт лиофилизируют.

РИСУНКИ

Рисунок 1