Способ определения функциональной активности компонента c2 комплемента человека

 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и касается способа определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах. Сущностью способа является определение функциональной активности компонента С2 системы комплемента человека на основе иммуноферментного метода, основанного на способности функционально активного компонента С2 образовывать С3-конвертазу, количество которой определяют по количеству связавшегося активированного С3. Техническим результатом является упрощение способа определения функциональной активности компонента С2 комплемента человека, хорошая воспроизводимость результатов, отсутствие необходимости использования плохо сохраняемых и трудно стандартизуемых компонентов. 1 табл.

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Однако имеющиеся на сегодня методы иммуноферментного анализа белков комплемента позволяют определять лишь их содержание как антигена. Тем не менее наиболее информативной является оценка функциональной активности этих белков, которая и характеризует развитие патологического процесса. Что касается определения функциональной активности компонента С2 комплемента, то практически единственным является гемолитический метод [1], не отличающийся высокой степенью воспроизводимости и неохотно используемый клиницистами из-за трудностей, связанных с приготовлением гемолитической системы на основе эритроцитов барана.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа, позволяющего определять функциональную активность компонента С2 системы комплемента человека на основе иммуноферментного метода.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения, который предусматривает сорбцию в лунках микропланшета иммуноглобулина G, затем внесения в лунки микропланшета реагента R2 (сыворотки человека, лишенной компонента С2 с сохранением активностей остальных компонентов комплемента, получаемой, например, прогреванием ее в течение 30 мин при 50^oС [1]) и анализируемой пробы, содержащей компонент С2 с неизвестной активностью, и проведения инкубации для активации комплемента, в ходе которой происходит формирование на сорбированном иммуноглобулине С3-конвертазы (С4bС2а) в количествах, зависящих от концентрации функционально активного определяемого компонента С2, а также активация этой конвертазой компонента С3 и ковалентное связывание последнего на молекулах сорбированного иммуноглобулина. Таким образом, количество связавшегося С3 зависит от количества С3-конвертазы, т.е. количества определяемого компонента С2. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента С3 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к С3-фракции иммуноглобулинов G, конъюгированных с ферментом. Способ основан на способности функционально активного компонента С2 образовывать С3-конвертазу, количество которой определяется по количеству связавшегося в лунках активированного С3. Тем самым достигается определение функциональной активности С2 иммуноферментным методом, пригодным для стандартизации.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка упрощенного способа определения функциональной активности компонента С2 комплемента человека, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов и отсутствием необходимости использования таких плохо сохраняемых и трудно стандартизуемых компонентов, какими являются эритроциты.

Пример 1. Определение функциональной активности препарата С2. Растворяют иммунохимически чистый IgG в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, в концентрациях белка 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4^oС. Два раза отмывают планшет вероналовым буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Са²⁺ и 0,5 мМ Mg²⁺ (VBS²⁺), заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета ряда вносят по 100 мкл раствора VBS²⁺ содержащего 10 мкл реагента R2 (R2 - сыворотка крови человека, прогретая при 50^oС в течение 35 мин) и анализируемую пробу, содержащую компонент С2 с неизвестной активностью. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oС, двукратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% Твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента С3 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oС, двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (10 мг ортофенилендиамина в 25 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Функциональную активность препарата С2 рассчитывают по стандартной кривой. Этим методом проведено определение активности С2 в 6 образцах сывороток крови человека и стандартным гемолитическим методом [1]. Полученные результаты сравнения двух методов (в мг/мл активного компонента С2) приведены в таблице.

Из данных таблицы следует, что результаты, полученные двумя методами, согласуются между собой, т.е. заявленным способом действительно определяется функциональная активность компонента С2. Небольшие расхождения, наблюдаемые в отдельных результатах, объясняются тем, что при определении активности С2 гемолитическим методом в процессе задействованы все стадии активации комплемента и о функциональной активности С2 судят по конечной стадии лизиса эритроцитов, при этом на все стадии процесса и на эритроциты могут оказывать влияние другие составляющие сыворотки крови экспериментальной пробы. Определение функциональной активности компонента С2 иммуноферментным методом включает только начальные стадии каскада активации комплемента и поэтому менее подвержено влиянию других компонентов реальных сывороток, в которых проводится определение С2.

Источник информации 1. Козлов Л.В., Крылова Ю.И., Чих В.П., Молчанова Н.Н. Модифицированные методы определения функциональной активности факторов комплемента С2, С3, С4 и С5. Биоорганическая химия. 1982. Т. 8. 5. С. 652-659.

Формула изобретения

Способ определения функциональной активности компонента С2 комплемента человека, отличающийся тем, что сорбируют в лунках микропланшета иммунохимически чистый иммуноглобулин G, затем в лунки микропланшета вносят раствор, содержащий реагент R2 (сыворотку крови человека, лишенную активности компонента С2), и анализируемую пробу, содержащую компонент С2 комплемента человека с неизвестной активностью, проводят инкубацию и после осушения планшета и отмывки в лунки вносят конъюгат фермента с антителами против компонента С3 человека и субстрат этого фермента, после чего проводят расчет активности С2 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.

РИСУНКИ

Рисунок 1