Синтетический мутантный ген rb (варианты), синтетический мутантный ген p53, плазмида (варианты), способ ингибирования клеточной пролиферации (варианты)

 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано для ингибирования клеточной пролиферации. Ген Rb, кодирующий функционально активный ретинобластомный белок, мутируют путем изменения в консервативной области гомологии Р5 или ген Rb мутируют путем изменения нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислоту, расположенную в сайте фосфорилирования белка. Мутантный ген р53 получают путем изменения в консервативной области гомологии Р5. Плазмиды, содержащие мутантный ген Rb или р53, экспрессируют активный мутантный белок, способный подавлять клеточную пролиферацию. Изобретение позволяет разрабатывать способы лечения нераковых клеточно-пролиферативных заболеваний. 7 с. и 5 з.п. ф-лы, 9 ил., 2 табл.

Данное изобретение касается в общем области регуляции роста клеток и связанных с пролиферацией клеток заболеваний. Более конкретно, данное изобретение касается мутантов генов RP-1 и р53 и применений таких мутантов в терапии.

Описание родственной области знаний Регуляция пролиферации клеток является сложным процессом, включающим в себя многочисленные взаимодействующие компоненты. Наличие роста клеток или его отсутствие зависит от баланса экспрессии отрицательно действующих на рост и положительно действующих на рост регуляторных генов. Отрицательно действующими на рост регуляторными генами являются те гены, которые при экспрессии в клетке или при предоставлении клетке приводят к супрессии клеточного роста. Положительно действующими на рост регуляторными генами являются те гены, которые при экспрессии в клетке или при предоставлении клетке стимулируют ее пролиферацию.

Недавно были идентифицированы несколько отрицательно действующих на рост регуляторных генов, названных опухолевыми супрессорными генами, которые оказывают отрицательное действие на пролиферацию клеток. Эти гены включают в себя ген ретинобластомы человека, RB-1 и ген р53, но не ограничены ими. Отсутствие или инактивация некоторых из этих отрицательно действующих на рост регуляторных генов коррелировали с некоторыми типами рака.

Ген ретинобластомы человека, RB-1, является прототипом этого класса опухолевых супрессорных генов, в котором отсутствие обоих аллелей этого гена в клетке или ингибирование экспрессии гена или продукта гена приводит к опухолевой или патологической клеточной пролиферации. На молекулярном уровне утрата или инактивация обоих аллелей RВ-1 участвует в клинической манифестации опухолей, таких как ретинобластома и клинически родственные опухоли, такие как остеосаркомы, фибросаркомы, саркомы мягких тканей и меланомы. Кроме того, утрата функции RB-1 была также ассоциирована с другими типами первичного рака, такими как первичный мелкоклеточный рак легких, рак мочевого пузыря, карциномы молочной железы, карциномы шейки матки и карциномы предстательной железы.

Опухолевые супрессорные гены Rb и р53 подавляют пролиферацию раковых и нераковых клеток Было показано, что повторное введение кДНК дикого типа ДВ-1 или р53 частично восстанавливает нормальную регуляцию роста клеток, так как введенные гены индуцируют остановку роста или задержку роста во многих различных типах опухолевых клеток. Обозначение Rb гена как опухолевого супрессорного гена берет свое начало из факта, что инактивация аллеля Rb гена провоцирует развитие рака. Однако подавляющее рост действие Rb гена не ограничивается опухолевыми клетками. Нормальные клетки, имеющие 2 копии, могут обнаруживать остановку или замедление роста при введении дополнительных копий Rb гена при определенных условиях для роста. Также хорошо документирована способность гена р53 дикого типа подавлять рост нераковых клеток. Таким образом, Rb и р53 могут не прямо влиять на онкогенный фенотип, но скорее воздействовать на стадии, регулирующие одинаково рост опухолевых и нормальных клеток.

Механизмы патологической пролиферации нормальных клеток Существует большое разнообразие патологических пролиферативных клеточных состояний, для которых необходимы новые методы, обеспечивающие терапевтическую пользу. Эти патологические состояния могут встречаться почти во всех клеточных типах, способных к аномальной пролиферации клеток. Среди клеточных типов, проявляющих патологический или атипичный рост, находятся (1) фибробласты, (2) эндотелиальные клетки сосудов, (3) эпителиальные клетки. Из вышесказанного можно видеть, что необходимы способы для лечения местных или диссеминированных патологических состояний во всех или почти всех системах органов и тканей индивидуума.

Например, только в глазу новые методы могут быть использованы для лечения большого разнообразия патологических состояний, которые обусловлены аномальной пролиферацией нормальных, доброкачественных или злокачественных клеток или тканей, в том числе (но не только) следующих патологических состояний: фибропролиферативных, вазопролиферативных и/или опухолевых заболеваний глаза: ретролетальной фиброплазии, пролиферативной витреоретинопатии, пролиферативной диабетической ретинопатии, капиллярной гемангиомы, хороидальных неоваскулярных сетей, субретинальных неоваскулярных сетей, старческой дегенерации пятна сетчатки и роговицы, вызываемой субретинальной неоваскуляризацией (новообразованием сосудов), корнеальной неоваскуляризацией, сморщивания пятна, вызываемого профилерацией эпиретинальной мембраны, катаракты взрослых, вызываемой ядерным склерозом, фиброзного врастания после травмы или хирургии, глиомы зрительного нерва, ангиоматоза сетчатки, неоваскулярной глаукомы, кавернозной гемангиомы, покраснения радужной оболочки (rubeosis iridis), пролиферативной ретинопатии с образованием менискоцитов, эпителиальных выростов после хирургии или повреждения глаза, пленки после катаракты, папилломы, новообразования сосудов в сетчатке при талассемии, субретинальной неоваскуляризации, вызываемой эластичной псевдоксантомой (pseudoxanthoma elasticum), и нейрофиброматоза типа I и II, ретинобластомы, увеальной меланомы глазницы. Другие доброкачественные клеточные пролиферативные заболевания, для которых полезно данное изобретение, включают (но не ограничиваются ими) псориаз, ихтиоз, папилломы, базалиомы, плоскоклеточный рак и синдром Стивенса-Джонсона.

Следует заметить, что в случае нормальных клеток уже имеются два нормальных аллеля каждого из генов Rb и р53 и все же соответствующие этим генам белки дикого типа не могут предотвращать пролиферацию клеток при предоставлении им факторов роста, например, в условиях роста в культуре ткани. Такая неконтролируемая пролиферация обычно покоящихся клеток в патологических состояниях также обусловлена экспонированием этих клеток факторам роста, индуцируемым этими патологическими состояниями (см. ниже). Например, неконтролируемая пролиферация кровеносных сосудов в глазу при талассемии может привести к отслоению сетчатки, если пролиферация не будет остановлена. Введение дополнительных копий гена Rb или гена р53 в такие клетки может быть, но может и не быть достаточной для подавления клеточного роста. Действительно, введение экзогенного гена Rb в клетки многих опухолей только задерживало скорость роста этих клеток вместо полной остановки роста. Сообщенные ранее клеточные линии, такие как Saos-2 и DU 145, являются хорошими примерами этого феномена. Возможна необходимость введения значительно большего числа копий этого гена, и, с одной стороны, трудно контролировать число копий, которые должны быть введены или могли бы быть введены, а с другой стороны, экспозиция с факторами роста может приводить к инактивации экспрессируемых геном Rb белков.

Регуляция активности белка Rb фосфорилированием Если инактивация ростовых супрессорных генов является существенной стадией в удалении влияния на рост клеток, должны быть механизмы, посредством которых ативности этих генных продуктов регулируются таким образом, что клетки могут пролиферировать контролируемым образом. Понятно, что экспрессия данного ростового супрессорного гена может регулироваться количественно или качественно. В случае гена Rb отношение уровня этого белка в устойчивом состоянии (steady state) к объему клетки является постоянным в течение всего клеточного цикла. Это отсутствие изменений в концентрации белка предполагает, что должны существовать другие механизмы, посредством которых клетка может регулировать активность этого белка. Существует несколько линий доказательств, которые могут показать, что активность Rb белка (рRb) регулируется состоянием его фосфорилированности. Различные стимулирующие или ингибирующие рост факторы оказывают свое действие путем изменения фосфорилирования продуктов супрессорных генов роста, таких как Rb белок. Доказательство роли стимулирующих рост факторов в индуцировании фосфорилирования Rb белков было получено из наблюдения, что Rb белки существуют в виде недостаточно фосфорилированных форм в покоящихся клетках. Кроме того, при стимулировании пролиферации покоящихся клеток выдерживанием с сывороткой или факторами роста, такими как EGF (эпидермальный фактор роста), вместе с инсулином и трансферином, преобладающая форма Rb белка была недостаточно фосфорилированной в G1, но становилась гиперфосфорилированной, когда клетки входили в пограничную фазу G1/S.

Эти данные предполагают, что Rb белок является мишенью пути трансдукции сигнала, индуцируемого сывороткой или факторами роста. Наконец, стареющие фибробластные клетки человека, не способные отвечать на стимулирующее пролиферацию действие факторов роста, также неспособны фосфорилировать Rb белок.

Имеется также доказательство роли ингибирующих рост факторов в отрицательной регуляции фосфорилирования Rb белков, Было обнаружено, что при обработке активно растущих клеток лейкоза или нейробластомы ретиновой кислотой или витамином D3, DМSO или другими индуцирующими дифференциацию агентами, белки являются недостаточно фосфорилированными перед наступлением остановки клеточного роста в ранней G-1 фазе и индуцируются к дифференциации. Кроме того, обработка эпителиальных клеток легких паракринными ингибирующими рост полипептидами трансформирующим фактором роста бета 1 (TGF β1) приводила к отрицательной регуляции фосфорилирования Rb белка и сопутствующей остановке клеточного роста в поздней G1. Взятые вместе, эти данные предполагают, что недостаточно фосфорилированная форма Rb белка активно подавляла клетки, препятствуя их пересечению границы С1/S и что киназа (S), активируемая в G1, может активировать Rb белок таким образом, что клетки могут переходить в фазу S.

Тогда как перманентное удаление Rb гена делецией или мутацией в опухолевых клетках делало возможным рост клеток, удаление возможности влияния на рост в нормальных клетках, имеющих нормальную экспрессию Rb гена, достигается зависимой от клеточного цикла посттрансляционной модификацией продукта этого гена, т.е. Rb белка (pRb). Белок pRb существует в мультифосфорилированных формах, и имеющиеся данные предполагают, что активной формой является недостаточно фосфорилированная форма.

Например, большой Т антиген (супер-Т-антиген) SV 40 предпочтительно связывается с недостаточно фосфорилированной формой Rb белка. Фосфорилирование Rb белка освобождает его от большого Т-антигена SV40 и только недостаточно фосфорилированные рRb связываются с Е2 промотором и ингибируют транскрипцию от Е2 промотора. Таким образом, недостаточно фосфорилированная форма Rb белка активно подавляет клеточный рост, в то время как пролиферация клеток связана с гиперфосфорилированием Rb белка. Различные стимулирующие или ингибирующие факторы могут оказывать свое действие, влияя на фосфорилирование Rb белка. Поэтому, хотя нормальная клетка может экспрессировать Rb белки, она может быть индуцирована для роста при экспонировании с подходящими факторами роста, так как это может быть обнаружено в различных условиях роста, в том числе в патологических состояниях. При некоторых патологических состояниях нормальная в других условиях клетка может быть индуцирована к нежелательной пролиферации. Пролиферация покоящихся в норме фибробластов в глазах при диабетической ретинопатии является примером такой нежелательной индукции клеточного роста. При отсутствии лечения пролиферирующие фибробласты со временем присоединятся к сетчатке и приведут к ее быстрому отслаиванию.

Активация белка р53 Подобно Rb гену инактивация или мутация р53 гена часто наблюдалась в опухолевых и неопухолевых клеточных линиях. Белок р53 дикого типа также отрицательно регулируется при связывании его с вирусными антигенами, такими как большой Т-антиген SV 40. Белок р53 функционирует как фактор транскрипции и связывается со специфическими последовательностями ДНК. Способность белка р53 дикого типа связываться с ДНК является критической для его правильного функционирования. В мутантном р53 способность белка связываться со специфическими последовательностями-мишенями ДНК или активировать транскрипцию потеряна, что позволяет предположить, что эти активности важны для супрессорной функции этого белка. Однако недавно было также показано, что активность связывания со специфической последовательностью ДНК белка р53 является загадочной. Вновь синтезированный белок р53 является неактивным в том смысле, что он не может связываться со специфической для него последовательностью ДНК, если он не модифицирован. Одним из сайтов для модификации являются аминокислотные остатки 365-393 при С-конце. Этот район является сайтом присоединения РНК, а также связывания с бактериальными белками теплового шока dnaK. Связывание антитела Pab421 с аминокислотными остатками 365-393 активирует белок путем изменения его конформации таким образом, что он приобретает способность связываться с его специфической последовательностью ДНК.

Различие в способе функционирования pRb и р53 Хотя как Rb, так и р53 считаются опухолевыми супрессорными генами, способы их действия являются очень разными. Ранее было получено доказательство, что эти два гена могут действовать различными путями. Мыши, не имеющие гена Rb, обнаруживают летальность на стадии эмбрионов, тогда как мыши, не имеющие гена р53, развиваются нормально, хотя они более восприимчивы к развитию рака. На клеточном уровне раковые клетки, не имеющие р53, могут иметь остановку или замедление роста при избыточной экспрессии гена Rb даже в отсутствие экзогенного р53. С другой стороны, клетки, не имеющие Rb, чувствительны к супрессии роста геном р53. На молекулярном уровне р53 и pRb взаимодействуют с различными белками-мишенями и последовательностями ДНК (прямо или косвенно).

Применение генов Rb и р53 в терапии Хотя эти два белка различны в способах их действия, они сходны в одном аспекте, т. е. избыточная экспрессия (сверхсинтез) активных форм этих двух белков при экспериментальных условиях приводит к супрессии или задержке роста клеток. Поскольку известно, что рост клеток регулируется экспрессией супрессорных генов, таких как Rb и р53, и что их белки должны быть в активных конформациях для успешного функционирования, желательно иметь активные формы этих генов для генной терапии. В случае pRb вновь синтезированные белки являются недостаточно фосфорилированными и активными. Инактивация может происходить при экспонировании этих клеток с факторами роста. Было бы желательно иметь мутантные формы pRb, которые оставались бы в активной форме и были устойчивы к инактивации посредством фосфорилирования. В случае р53 вновь синтезированный белок является неактивным в том смысле, что он не может связываться с ДНК не будучи модифицированным. В генной терапии было бы крайне желательно иметь мутантные формы гена р53, экспрессирующие белок, который активен даже без дальнейшей модификации. Наконец, поскольку эти два белка имеют различные способы действия, было бы желательно использовать комбинацию генов Rb и р53 в терапии таким образом, что мутации или условия роста, которые делают клетку устойчивой к супрессорному действию одного гена, могли быть восприняты вторым геном.

В предшествующих исследованиях не была продемонстрирована мутация опухолевого супрессорного гена таким образом, что генный продукт (белок) является перманентно активным и может функционировать даже при экспонировании клетки с факторами роста. Более конкретно, прежние работы не смогли продемонстрировать эффективных и функциональных мутированных форм генов р53 и Rb. Прежние исследования не продемонстрировали также одновременного применения генов Rb и р53 дикого типа или их мутантных форм в лечении пролиферативных заболеваний раковых и нераковых клеток.

Краткое изложение сущности изобретения В одном аспекте данное изобретение обеспечивает обобщенный подход к лечению нежелательного или патологического клеточного роста, такого, который наблюдается в нераковых клеточно-пролиферативных заболеваниях, а также в раковых клеточно-пролиферативных заболеваниях. Более конкретно, данное изобретение обеспечивает способы лечения патофизиологических клеточно-пролиферативных заболеваний путем введения мутированного ростового супрессорного гена и/или продуктов гена.

В одном варианте данного изобретения обеспечена выделенная молекула ДНК, причем эта молекула представляет собой функционально активную форму мутированного ростового супрессорного гена или комбинацию различных мутированных ростовых супрессорных генов.

В другом варианте данного изобретения обеспечена новая плазмида, содержащая функционально активный мутант гена ретинобластомы (Rb) или р53 гена.

Еще в одном варианте данного изобретения обеспечен способ последовательного или одновременного введения генов Rb и р53 дикого типа и/или активных мутантов генов Rb, и р53 для терапевтических целей.

В других вариантах данного изобретения обеспечены способы лечения патологических клеточно-пролиферативных заболеваний, предусматривающие совместное или последовательное введение в нераковую пролиферирующую клетку мутированного гена Rb и мутированного гена р53.

Дополнительно обеспечен способ лечения злокачественных клеточных заболеваний индивидуумов, предусматривающий совместное или последовательное введение в пролиферирующую раковую клетку мутированного гена Rb и мутированного гена р53.

Другие и дополнительные аспекты, особенности и преимущества данного изобретения будут ясны из следующего далее описания предпочтительных в настоящее время вариантов этого изобретения, даваемых с целью раскрытия изобретения.

Краткое описание чертежей Фиг. 1 показывает обнаружение района гомологии между рRb и р53 иммунопреципитацией клеточных белков при помощи поликлональных антител против Rb RB1-Ab 18 и 20.

Фиг.2 показывает подтверждение района гомологии между pRb и р53 иммунопреципитацией клеточного белка при помощи поликлональных антител против Rb RB1-Ab 18 и 20.

Фиг.3 показывает способность P1, Р3, Р5 мутантных р53 белков связываться со специфическими последовательностями ДНК в отсутствие Раb421.

Фиг. 4 показывает двухмерное картирование распределения фосфорилирования мутантных Rb белков по сравнению с белками дикого типа, (А) меченых in vivo белков, (В), меченых in vitro белков.

Фиг.5 показывает связывание ретинобластомного белка (Rb) с большим Т-антигеном SV 40 и диссоциацию этого комплекса фосфорилированием.

Фиг. 6 показывает двухмерное картирование двух различных форм фосфорилированного ретинобластомного белка (тех, которые связаны большим Т-антигеном SV 40, и тех, которые не связаны).

Фиг. 7 показывает двухмерный анализ изменения в распределении фосфорилирования ретинобластомного белка при различных условиях роста.

Фиг. 8 показывает способность m89 Rb мутанта подавлять рост нормальной клетки W S1.

Фиг. 9 показывает способность m89 Rb мутанта подавлять рост линии опухолевых клеток мочевого пузыря TCCSVP.

Детальное описание изобретения
Определения
Термин "функциональная экспрессия гена" включает в себя супрессию транскрипции гена, деградацию генного транскрипта (предшественника информационной (матричной) РНК), ингибирование сплайсинга, разрушение информационной РНК, предотвращение трансляции информационной РНК, предотвращение посттрансляционных модификаций белка, разрушение белка или ингибирование нормальной функции белка.

Термин "трансфицируемая плазмида" включает в себя бактериальную плазмиду, содержащую мутированный ретинобластомный ген или р53 ген для переноса (трансфицирования) в выбранную клетку.

Термин "генная терапия" обозначает введение части или всего гена, конструкции ДНК, РНК или генного продукта в клетку, группу клеток, ткань, патологическое повреждение, орган или организм для модулирования экспрессии генов и/или функции генного продукта.

Термин "профилактическая генная терапия" обозначает гены, которые могут быть использованы для частичного или полного ингибирования или предотвращения заболевания или распространения заболевания, а также гены, которые могут быть использованы для дополнения или замены отсутствующего или недостаточного отрицательного роста в клетках, тканях или линиях эмбриональных клетках.

Термин "клеточно-пролиферативное заболевание" обозначает любое заболевание или нарушение человека или животного, действующее на любой орган или любую комбинацию органов, полости или части тела, которое характеризуется одиночным или множественными местными атипичными пролиферациями клеток, групп клеток или ткани (тканей); доброкачественных или злокачественных.

Термин "прокариоты" включает в себя все бактерии, которые могут быть трансформированы ДНК для экспрессии рекомбинантных молекул данного изобретения.

Термин "эукариоты" включает в себя все дрожжи, грибы, клетки животных и растений, которые могут быть трансформированы ДНК для экспрессии рекомбинантных молекул данного изобретения.

ДНК для конструкций ДНК данного изобретения может быть синтетической или может быть получена из любого вида млекопитающих. Все, что требуется, это то, чтобы генетическая последовательность генов Rb или р53 была функционально экспрессируемой в прокариотическом или эукариотическом организме. Предпочтительна синтетическая ДНК.

Рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую конструкции ДНК данного изобретения, можно применять для трансформации хозяина при помощи любого из способов, обычно известных специалистам обычной квалификации в этой области.

Способы получения слитых, оперативно соединенных генов и их экспрессии в бактериях известны и показаны, например, в US Patent 4366246, включенном здесь в виде ссылки. Генетические конструкции и способы, описанные в нем, можно применять для конструирования конструкций ДНК данного изобретения и трансфекции в прокариотические или эукариотические хозяева.

Прокариотическими хозяевами могут быть грамположительные, а также грамотрицательные бактерии, такие, как E. coli, S. tymphimurium, Serratia marcescens и Bacillus subtilis.

Эукариотическими хозяевами могут быть дрожжи, такие как Pichia pastoris или клетки млекопитающих.

Как правило, используют экспрессирующие векторы, содержащие промоторные последовательности, облегчающие эффективную транскрипцию встроенного фрагмента ДНК, в связи с хозяином. Экспрессирующий вектор в типичном случае содержит начало репликции, промотор (промоторы), терминатор (терминаторы), а также специфические гены, способные обеспечить фенотипический отбор в трансформированных клетках. Трансформированные хозяева можно ферментировать и культивировать согласно способам, известным в качестве пригодных для достижения оптимального роста клеток.

Примерами промоторов, которые можно использовать в этом изобретении, являются (но не только) промотор β-актина человека, промотор металлотионина, начало репликации SV40, ММТV LTR промотор и MULV LTR промотор. Примеры некоторых плазмид или бактериофага, которые можно использовать в этом изобретении, перечислены в Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories 1982, и другие, известные специалистам в этой области, и могут быть легко установлены.

Ген представляет собой последовательность ДНК, кодирующую через посредство его матричной или информационной РНК, последовательность аминокислот, характерную для специфического пептида. Термин кДНК включает в себя гены, из которых удалены промежуточные последовательности. Термин "рекомбинантная ДНК" (рДНК) включает молекулу, которая была рекомбинирована сплайсингом кДНК или геномных последовательностей ДНК in vitro.

Клонирующий вектор представляет собой плазмидную или фаговую ДНК или иную последовательность ДНК, которая способна реплицироваться в клетке-хозяине и которая характеризуется одним сайтом узнавания эндонуклеазой или небольшим числом сайтов узнавания эндонуклеазами, при которых такие последовательности ДНК могут быть разрезаны детектируемым образом без потери основной биологической функции этой ДНК, и которая содержит маркер, пригодный для использования в идентификации трансформированных клеток. Маркерами являются, например, устойчивость к тетрациклину или неустойчивость к ампициллину. Для клонирующего переносчика иногда используют слово "вектор".

Экспрессирующим переносчиком (вектором) является вектор, сходный с клонирующим переносчиком (вектором), но способный экспрессировать конкретный структурный ген в хозяине, обычно под контролем определенных регуляторных последовательностей.

Термин "индивидуум" включает животных и человека.

Термин "биологическое ингибирование" или "ингибирование" роста пролиферирующих клеток обозначает частичное или полное ингибирование роста, а также уменьшение в скорости пролиферации или роста клеток. Биологически ингибирующая доза мутантов данного изобретения может быть определена оценкой влияний тестируемого элемента на рост целевых злокачественных или атипично пролиферирующих клеток в культуре ткани, на рост опухоли в животных или клеточной культуре или каким-либо иным способом, известным лицам с обычной квалификацией в этой области.

В применении здесь термин "консервативный район гомологии" относится к аминокислотному району, который гомологичен между Rb и р53, как иллюстрируется в таблице 1.

Белки данного изобретения могут вводиться топически, внутриглазным, парентеральным, пероральным, интраназальным, внутривенным, внутримышечным, подкожным или любым другим пригодным способом. Предпочтительным способом введения для лечения глазных заболеваний является внутриглазное или окологлазное введение. Предпочтительным способом введения для лечения кожных клеточно-пролиферативных заболеваний является топическое нанесение или подкожная инъекция.

В другом варианте конструкции ДНК данного изобретения могут доставляться непосредственно к очагу пролиферативного заболевания. В случае глазного пролиферативного заболевания конструкции ДНК данного изобретения могут вводиться непосредственно в глаз. Конструкции ДНК данного изобретения можно доставлять непосредственно к очаговым сайтам заболевания во внутренних органах, полостях тела и т.п. с применением томографических устройств, применяемых для направления иглы для инъекции непосредственно к очагу заболевания. Конструкции ДНК данного изобретения можно вводить также к местам заболевания во время хирургического вмешательства.

Вводимая доза ДНК зависит от возраста, клинического состояния и степени заболевания или генетического предрасположения индивидуума типа сопутствующей обработки (лечения), если она имеется, и природы патологического или злокачественного состояния. Эффективная система доставки, применимая в способе данного изобретения, может быть применена в таких формах, как капсулы, таблетки, жидкие растворы, суспензии или элексиры, для перорального введения, или стерильные жидкие формы, такие как растворы, суспензии или эмульсии. Предпочтительно использование инертного носителя, такого как солевой раствор, или солевой раствор с фосфатным буфером, или любой такой носитель, в котором соединения, используемые в способе данного изобретения, имеют приемлемые свойства растворимости.

Предпочтительно для внутриглазного введения и для доставки к другим локализованным местам заболевания системы доставки, используемые в способе данного изобретения, могут быть применены в таких стерильных жидких формах, как растворы, суспензии или эмульсии. Для топического применения они могут быть использованы в таких формах, как мази, кремы и спреи. Предпочтительно применяют любой инертный носитель, такой как солевой раствор, или солевой раствор с фосфатным буфером, или любой такой носитель, в котором соединения, применяемые в способе данного изобретения, имеют приемлемые свойства растворимости.

Для местного введения в клетки можно применять любой способ, известный специалистам в этой области (но не только), такой как трансфекция, электропорация, микроинъекция клеток, или в носителях, таких как липосомы, липофектин, или в виде незащищенной ДНК или РНК. ДНК данного изобретения может быть доставлена при помощи известных систем доставки генов, таких как (но не только) ретровирусные векторы (Gilboa (1982) J. Virology 44:845; Hocke (1986) Nature 320:275; Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014), система вируса коровьей оспы (Chakrabarty et al., (1985) Mol. Cell Biol. 5: 3403) или при помощи других эффективных систем доставки ДНК (Yates et al., 1985) Nature 313: 812), известных специалистам в этой области. Эти ссылки приводятся лишь в качестве примеров. Для специфической доставки или переноса в клетки, которые аномально пролиферируют, и для сохранения неделящихся клеток предпочтительно применять ретровирусную систему доставки, известную специалистам в этой области. Поскольку для интеграции ретровирусной ДНК необходима репликация ДНК хозяина и ретровирус не сможет самореплицироваться вследствие отсутствия ретровирусных генов, необходимых для его жизненного цикла, использование такой ретровирусной системы доставки данного изобретения будет иметь мишенью указанные антипролиферативные элементы патологически размножающихся клеток и не будут попадать в неделящиеся нормальные клетки.

Мутантные белки данного изобретения можно вводить в любом биологически эффективном носителе. Биологически эффективные носители могут включать в себя ретровирусы, липосомы и использовать любой другой механизм трансфекции, способный вводить чужеродные белки в геном клетки. Такие механизмы трансфекции известны специалистам в данной области. Носитель может также включать в себя любой агент или растворитель, с которыми совместимы конструкции данного изобретения и которые нетоксичны для индивидуумов или клеток, подвергаемых обработке (лечению), при вводимых количествах.

Подвергаемые лечению патологические клеточно-пролиферативные состояния
Существует большое разнообразие патологических раковых и нераковых клеточно-пролиферативных состояний, для которых способ данного изобретения может обеспечить терапевтические преимущества. Эти патологические состояния могут встречаться почти во всех клеточных типах, способных к отклоняющейся от нормы пролиферации. Среди типов клеток, проявляющих патологический или атипичный рост, находятся (1) фибробласты, (2) эндотелиальные клетки сосудов и (3) эпителиальные клетки. Из вышесказанного видно, что способ данного изобретения применим в лечении локальных или диссеминированных патологических состояний во всех или почти во всех системах органов или тканей индивидуума.

Например, только в глазу способ данного изобретения может быть использован для лечения большого разнообразия патологических болезненных состояний, вызываемых аномальной пролиферацией нормальных (доброкачественных) или злокачественных клеток или тканей, в том числе (но не только) следующих фибропролиферативных, вазопролиферативных и/или опухолевых заболеваний глаза: ретролетальной фиброплазии (синдрома Терри), пролиферативной витреоретинопатии, пролиферативной диабетической ретинопатии, капиллярной гемангиомы, хороидальных неоваскулярных сетей, субретинальных неоваскулярных сетей, старческой дегенерации пятна роговицы, вызываемой субретинальной неоваскуляризацией (новообразованием сосудов), корнеальной васкуляризацией, сморщивания пятна, вызываемого пролиферацией эпиретинальной мембраны, катаракт взрослых, вызываемых ядерным cклерозом, фиброзного врастания после травмы или хирургии, глиом зрительного нерва, ангиоматоза сетчатки, неоваскулярной глаукомы, кавернозной гемангиомы, покраснения радужной оболочки (rubeosis iridis), пролиферативной ретинопатии с образованием менискоцитов, эпителиальных выростов после хирургии глаза или повреждения, пленок после катаракты, папилломы, новообразования сосудов в сетчатке при талассемии, субретинальной васкуляризации, вызываемой эластичной псевдоксантомой (pseudoxanthoma elasticum) и нейрофиброматоза типа I и II, ретинобластомы, увеальной меланомы глазницы. Другие доброкачественные клеточно-пролиферативные заболевания, для которых полезно данное изобретение, включают в себя (но не ограничиваются ими) псориаз, ихтиоз, папилломы, базалиомы, плоскоклеточный рак и синдром Стивенса-Джонсона.

В общем данное изобретение применимо ко всем формам рака, в том числе (но не только) к ракам, в которых принимает участие инактивация гена Rb и/или гена р53, таким как остеосаркома, саркомы мягких тканей, меланомы, фибросаркома, ретинобластома, карцинома молочной железы, мочевого пузыря, шейки матки, легких, толстой кишки, яичника, почки, поджелудочной железы и предстательной железы.

Обнаружение определяющего конформацию консервативного домена, сохраняемого в pRb и р53
Данное изобретение описывает консервативный гомологичный структурный домен, контролирующий конформации двух опухолевых супрессорных генных продуктов, Rb и р53, что позволяет создание мутантов этих генов и способов их применения. Так, данное изобретение обеспечивает выделенную молекулу ДНК, которая представляет собой мутированный ростовой супрессорный ген. Мутированный ростовой супрессорный ген данного изобретения может быть любым геном, ингибирующим пролиферацию клеток. В одном предпочтительном варианте данного изобретения мутированный супрессорный ген представляет собой ген Rb. В другом предпочтительном варианте данного изобретения мутированный ростовой супрессорный ген представляет собой мутированный ген р53.

Для выяснения взаимодействия между рRb и его клеточными мишенями получали антитела к различным гидрофильным районам Rb белка. Поскольку различные районы Rb белка могут взаимодействовать с различными белками, было необходимо получить антитела ко многим различным районам так, чтобы некоторые из этих антител связывались с белковым комплексом между Rb белком и его мишенями без нарушения их взаимодействия. Из панели поликлональных антител против Rb, полученных против синтетических пептидов с последовательностями, соответствующими различным гидрофильным доменам, два из них (Rb1-Аb 18 и Rb1-Аb 20) стойко осаждали, кроме Rb белка, белок с мол. массой 53 кД (фиг. 1А, дорожки 1,2, 8 и 9). Оказалось, что эти же два антитела вырабатываются против одного и того же синтетического пептида, р5. Появление белка 53 кД специфично для антисывороток, выработанных против р5. Антисыворотки против других районов, например Rb-Ab В (фиг.1, дорожки 4-5) и Rb1-Ab С (фиг.1, дорожки 6-7), не иммуноосаждали белок 53 кД, хотя они все еще узнавали белок Rb. Вследствие сходства по мол. массе этого белка и р53 кажется, что этот белок был самим белком р53. Иммунопреципитация клеточных линий при помощи Раb 122, мноклонального антитела против р53 показала, что р53 действительно имеет ту же самую точно совпадающую мол. массу, что и белок 53 кД (дорожка 10). Кроме того, если р53 сначала удаляли из клеточного лизата при помощи Раb 122, то ни Rb1-Аb 18, ни Rb1-Ab 20 не могли иммунопреципитировать белок 53 кД, хотя они все еще могли осаждать Rb белок (дорожка 11). Для дальнейшего подтверждения, что белок 53 кД действительно является белком р53, проводили иммунопреципитацию на нескольких клеточных линиях, которые не экспрессировали эндогенный р53 и/или Rb белок. Во всех случаях (дорожки 1-20) эти антитела действительно могут узнавать р53 белок в соответствии с состоянием присутствия или отсутствия гена р53 в этих клеточных линиях. Кроме того, иммунопреципитация р53 не зависит от присутствия или отсутствия Rb белка, что позволяет предполагать, что комплекс не был образован и что белок р53 узнавался этим антителом непосредственно.

Для того чтобы окончательно доказать, что р53 белок имеет общий антигенный домен с Rb белком, был начат поиск аминокислотной последовательности р53 белка, соответствующей Р5 району Rb белка. Если информация о трехмерной структуре сохранялась в этих двух белках и в Р5 пептиде, то может быть соответствующий район на р53 белке. Кроме того, пептид с таким сохраненным (консервативным) доменом должен блокировать иммунопреципитацию р53 антителами RB1-Ab 18 или RB1-Ab 20.

Иммунопреципитацию белков Rb и р53 антителом Rb1-Ab 18 (фиг.2А) проводили в присутствии различных количеств этих пептидов. Один такой р53 пептид, F19, полностью блокировал иммунопреципитацию р53 антителом Rb1-Аb 18 при самой низкой концентрации (10 мкг/мл) из испытанных концентраций (фиг.2А, дорожки 12-14). Такой же была концентрация Rb пептида, р5, примененного для блокирования преципитации (дорожки 1 и 2). В противоположность этому все другие р53 пептиды не смогли блокировать иммунопреципитацию р53 антителом Rb1-Ab 18 даже при использовании в 50-100 раз больших концентраций (дорожки 3-11).

Районы р5 и F19 являются не единственными районами, обнаруживающими структурную гомологию между Rb и р53 белками. По меньшей мере два других района были обнаружены при помощи визуального и компьютерного поиска. Для сравнения гомологичные районы Rb и р53 показаны в таблице 1.

Хотя эти районы, по-видимому, могут быть короткими, те аминокислоты, которые являются гомологичными и общими для рRb и р53, являются также наиболее эволюционно консервативными в р53 (нет доступных данных для последовательности Rb в различных видах). Эта высокая степень гомологии между двумя ростовыми супрессорными белками предполагает, что эти районы могут иметь важные функции. Схематический рисунок положений районов гомологии на рRb и р53 показан на фиг.2В. В р53 все три района собраны в виде кластера в С-конце белка, а в pRb районы 1 и 3 собраны в N-концевой половине, тогда как Р5 район находится в С-концевой половине. Однако как в р53, так и в pRb эти три района расположены вне доменов, известных в качестве доменов, важных для супрессорной функции белков. Если эти районы не ответственны за физическое взаимодействие с их подавляемыми мишенями, то может быть они ответственны за регуляцию процесса этого взаимодействия. Точно так же, как важно иметь активные Rb и р53 белки для подавления недопустимого роста клеток, важно иметь средства для отрицательной регуляции их активностей, чтобы клетка могла размножаться. Присутствие в этих двух супрессорных генных продуктах консервативных доменов может обеспечивать их координированную регуляцию. Действительно, как показано ниже, эти гомологичные районы, по-видимому, образуют домен, который определяет конформацию этих двух белков. Характерно, что разрушение этого домена мутацией при консервативных аминокислотных остатках (подчеркнутых в таблице 1) любого из этих трех районов приводило к активной конформации двух белков. В противоположность этому мутации при неконсервативных аминокислотах в этих районах не оказывали такого действия.

Район Р1, Р3, Р5 контролирует конформацию р53 и его способность связывать ДНК
Способность р53 активировать транскрипцию тесно связана с его способностью связывать ДНК. Мутантный р53, обнаруженный в раковых клеточных линиях, не был способен связываться с ДНК и активировать транскрипцию. Белок р53 способен связываться со специфической последовательностью ДНК в присутствии антитела Pab 421. Тщательное исследование эпитопа Pab 421 выявило, что он перекрывается с РЗ районом. Эпитоп, узнаваемый Pab 421 (см. фиг.3), представляет собой последние четыре аминокислотных остатка в РЗ районе. По-видимому, блокирование этого всего Р3 района антителом (Раb 421) достаточно изменяло конформацию белка, позволяя белку р53 связываться со специфической последовательностью ДНК. Таким образом, анализ связывания ДНК обкспечил подходящий способ определения роли РЗ и других гомологичных районов Р1 и Р5 в регуляции конформации р53 белка. Как показано на фиг.3, в то время как р53 дикого типа не был способен связываться со специфической последовательностью ДНК (дорожка 1), он действительно связывался с ней в присутствии антитела Pab 421 (дорожка 2). При мутировании консервативных аминокислот любого из районов Р1 (дорожка 3), Р3 (дорожки 5 и 7) или Р5 (дорожка 9) полученные мутантные р53 белки были способны связываться с ДНК даже в отстутствие РАb 421. Образующийся комплекс дополнительно смещался при связывании с Pab 421 (дорожки 4, 8 и 10 для P1, Р3, Р5 соответственно).

Это дополнительное перемещение является указанием на то, что Р3 район в этих мутантах все еще способен связываться с антителами и что способность этих мутантов связывать ДНК в отстутствие Pab 421 не была обусловлена мутацией Р3 района. В самом деле, связывание антител Раb 1801 вне этих С-концевых доменов также вызывало дополнительное перемещение комплекса. Мутант, примененный в дорожках 7 и 8, был мутирован при первых 4 аминокислотных остатках Р3 района и это, по-видимому, не влияло на связывание Раb 421 с этим белком. Мутант, примененный в дорожках 5 и 6, был мутирован при консервативных аминокислотах последних 4 остатков в РЗ районa, и это снимало связывание Раb 421 с этим белком. Мутация при неконсервативных аминокислотах не оказывала действия, белки вели себя по существу так же, как белки дикого типа. Таким образом, конформация мутантных р53 белков переключается в активную форму, когда гомологичные районы разрушены мутацией.

Изменения в контроле фосфорилирования Rb белков, мутированных в районе гомологии
Имеются несколько способов различения между активной и неактивной конформациями рRb белка. Активный Rb белок недостаточно фосфорилирован и может подавлять рост клетки. Неактивный Rb белок сильно фосфорилирован. Если домен гомологии влияет на активную и неактивную конформацию рRb, мутация в районах Р1, Р3, Р5 должна влиять на способность этого белка подавлять рост клеток и на его фосфорилирование согласованно. Районы Р1, Р3 и Р5 рРb были отдельно мутированы при консервативных аминокислотных остатках и исследовали способность этих мутантов подавлять рост клеток. Все мутанты были способны подавлять рост трансфицированных клеток. Способность Rb мутанта m89-0, мутированного при консервативных остатках Р5 района, подавлять рост нормальных и раковых клеток представлена в двух примерах ниже. Поскольку активность pRb регулируется фосфорилированием, если консервативный район предназначен для поддержания рRb в неактивном состоянии, то мутация Р5 района должна оказывать ингибирующее действие на фосфорилирование мутантного рRb, чтобы белок был активным. Имеются клеточные линии, не имеющие экспрессии pRb вследствие мутации обоих аллелей RB-1, и эти клеточные линии также были подвергнуты другим мутациям, сообщающим им устойчивость к ингибирующему действию трансфицированного Rb гена. Линия клеток рака шейки матки С33А и субпопуляция Sаоs/2 являются двумя такими клеточными линиями. Таким образом, эти клеточные линии позволили бы мутантным белкам экспрессироваться, и клетки оставались бы жизнеспособными, что позволяет экстрагировать большие количества этого белка для исследования состояния фосфорилирования. Поэтому Р5 мутант НuβАсPr-1-neo-Р5С, мутированный при консервативных аминокислотных остатках в Р5 районе, трансфицировали в эти клетки и получали стабильные клеточные линии при помощи одной очистки клеток. Распределение фосфорилирования мутантного pRb, выделенного из очищенной мутантной клеточной линии Saos-2 89, сравнивали с распределением фосфорилирования pRb дикого типа, выделенного из трансфицированной Rb дикого типа и очищенной клеточной линии Saos-2 84. Иммунопреципитация pRb из S фазы Saos-2 84 (дикий тип) и Saos-2 89 (мутант) показала, что pRb дикого типа был сильно фосфорилирован, в то время как мутантный pRb был недостаточно фосфорилирован. Это предполагает, что Р5 мутант pRb остается в активной конформации, даже когда клетки находятся в S фазе. Таким образом, Р5 мутант, по-видимому, имеет конформацию, которая устойчива к фосфорилированию при определенных сайтах. Следует заметить, что этот белок был все еще фосфорилирован при других функционально несущественных сайтах.

Поскольку одномерный анализ при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) выявил только, что белок был недостаточно фосфорилирован, но не природу недостаточного фосфорилирования, проводили двухмерный анализ фосфопептидов ³²Р-меченого pRb с применением двух различных протеаз, трипсина и химотрипсина. Сравнение 2-D карт выявило, что имеются 2 сайта, S10а и S10b, которые стойко нефосфорилированы в мутанте по сравнению с диким типом (фиг.4А). Чтобы показать, что это различие в распределении фосфорилирования было вызвано внутренним различием в конформации этих белков, а не изменением в специфичности фермента in vivo, сравнивали распределение фосфорилирования белков in vitro. Белок рRb дикого типа и мутантный pRb фосфорилировали с применением препарата киназы, состоящего из связанных с циклином киназ. Мечение in vitro зависело от связанной с циклином киназы, так как против этой киназы блокировали фосфорилирование. Фосфорилированные in vitro рRb анализировали 2-D пептидным картированием и, как показано на фиг. 4В, те же самые сайты не были фосфорилированы в мутанте. Следовательно, даже при предоставлении больших количеств ферментов и оптимальных условий фосфорилирования, в которых рRb дикого типа был полностью фосфорилирован, мутантный pRb был совершенно устойчив к фосфорилированию сайтов S10А и S10b. Такое изменение в фосфорилировании S10а и S10b вызвано, следовательно, внутренним различием в конформации белков дикого типа и мутанта, а не вариациями в специфичности фермента in vivo.

Демонстрация того, что мутированные в районе гомологии белки представляют собой активные формы
(А) Корреляция между фосфорилированием при S10а и S10b и активностью pRb
Данные, представленные ниже, показывают, что изменение в фосфорилировании при S10а и S10b коррелирует со способностью pRb связывать большой Т-антиген SV40. Для исследования фосфорилирования in vitro белок Rb выделяли из Sf 9 клеток, инфицированных рекомбинантным Rf-бакуловирусом, в котором ген полиэдрина был частично заменен Rf геном. Было замечено, что при условиях высокого инфекционного титра, хотя большая часть экстрагированного Rb белка была неспособна связываться с большим Т-антигеном SV40 в результате фосфорилирования, небольшая часть Rb белка была связана с большим Т-антигеном. Это связывание показано на фиг.5. Rb белок и большой Т-антиген SV40 получали из ³⁵S-меченых Sf 9 клеток, инфицированных соответствующими бакуловирусами и обработанными киназами in vitro.

Дорожка 1 показывает, что Rb белки, экстрагированные при этом, состояли из недостаточно фосфорилированных, а также из гиперфосфорилированных форм и некотоорая часть этих белков была связана с большим Т-антигеном SV40. Большой Т-антиген мог связываться только с недостаточно фосфорилированной формой белка (дорожка 2 и дорожка 3). Фосфорилирование комплекса большой T:Rb различными количествами Rb-киназы (дорожки 3-6) отделяло большую часть Rb белка от большого Т-антигена. Эта форма Rb белков может быть названа RВ-Е (Е= открытый критический сайт). Однако приблизительно 20-30% Rb белка (названного RB-H) (Н=скрытый критический сайт) оставались прочно связанными с большим Т-антигеном и весь комплекс не мог быть осажден антителами против большого Т-антигена. Наиболее важно, что хотя увеличивающееся количество Rb-киназы могло фосфорилировать Rb белок вплоть до его наиболее медленно мигрирующей формы (сравни дорожки 4-6 и дорожки 8-10), гиперфосфорилированный Rb белок оставался связанным с большим Т-антигеном. То, что осаждение этих Rb белков не было обусловлено неспецифической адсорбцией с протеин А-агарозой, показано сравнением дорожки 6 с дорожкой 2. Приблизительно 70% Rb белка отсоединялось от большого Т-антигена. То, что этот высвобождающийся Rb белок не происходил из неспецифической деградации этого белка, показано тем фактом, что если реакцию иммунопреципитации проводили с антителами против Rb, то осаждались все Rb белки (как показано в дорожках 8, 9 и 10). Способность различных форм Rb белка связываться с большим Т-антигеном SV40 показана также в дорожках 8, 9 и 10, в которых меньшее количество большого Т-антигена осаждалось Rb белком.

Эти результаты согласуются с присутствием двух классов сайтов фосфорилирования на Rb белке, один из которых является критическим для инактивации Rb белка таким образом, что он не может связываться с большим Т-антигеном, тогда как другие сайты могут фосфорилироваться без влияния на это связывание. Имеется 17 потенциальных сайтов фосфорилирования (S/ТРХХ) для Rb-киназного комплекса. Для демонстрации, что эти сайты фосфорилирования важны для инактивации Rb белка, проводили 2-D анализ картирования на Rb белке, который оставался связанным с большим Т-антигеном SV40 (RB-H), и на Rb белках, которые не содержали большого Т-антигена SV40 после фосфорилирования (RВ-Е). Должно существовать различие в сайтах фосфорилирования между этими двумя формами Rb белка, если диссоциация Rb от большого Т-антигена является результатом фосфорилирования. Как показано на фиг.6, было обнаружено, что S10а и S10b не являются фосфорилированными в pRb, который остается связанным с большим Т-антигеном SV40.

Мутация при консервативных аминокислотах Р5 района придает белку активную конформацию. Фосфорилирование при S10а и S10b зависит от клеточного цикла и коррелирует со способностью клетки к пролиферации.

(В) Корреляция между фосфорилированием при S10a и S10b pRb и условиями роста клеток
Представленные ниже данные показывают, что изменение в фосфорилировании при S10а и S10b регулируется зависимым от клеточного цикла образом.

Хорошо документировано, что экспозиция клеток, нормальных или раковых, с TGFβ часто приводит к остановке роста. Роль рRb в супрессии клеточного роста была описана ранее. Для понимания роли TGFβ в фосфорилировании pRb использовали линию клеток карциномы молочной железы, в которой может быть остановлен рост путем обработки ее TGFβ. Состояние пролиферации наблюдали по поглощению тритированного тимидина и по распределению фосфорилирования ³²Р-меченого рRb, анализируемого 2-D пептидным картированием. Существенно, что рRb из клеток с остановленным при помощи TGFβ ростом не были фосфорилированы при S10а и S10b (фиг.7). Однако при отделении клеток от TGFβ S10а и S10b были вновь фосфорилированы. Таким образом, pRb белок, который активен в клетках с остановленным ростом, не был фосфорилирован при S10а и S10b. То, что это обратимое фосфорилирование не было связано только с подавляющим рост действием TGFβ, показано тем фактом, что похожий характер фосфорилирования S10а и S10b был также обнаружен в рRb, выделенном из клеток, рост которых был остановлен депривацией (удалением) сыворотки. При повторном предоставлении либо сыворотки, либо факторов роста S10а и S10b сразу же вновь фосфорилировались. Кроме того, S10а и S10b не были фосфорилированы в pRb, выделенном из клеток, рост которых был остановлен ретиноевой кислотой. Таким образом, функционально критические сайты S10а и S10b в белке рВb могут подвергаться обратимому фосфорилированию при различных условиях роста.

Мутанты Rb гена и р53 гена
Таким образом, как в случае рRb, так и в случае р53, мутация района гомологии приводила к белкам с конформациями, делающими их активными. Примеры конформационно активных мутантов Rb и р53 и их применений в супрессии роста клеток даны ниже. Для Rb белка описаны два класса мутантов, (1) мутанты с мутациями в регуляторном районе или районе гомологии и (2) мутанты с мутациями в сайтах фосфорилирования. Для р53 белка описаны мутанты районов гомологии.

Мутанты Rb гена
Анализ фосфоаминокислот гиперфосфорилированных Rb белков выявил, что фосфорилируются аминокислоты серин и треонин. В Rb белке присутствуют 79 остатков серина и 55 остатков треонина. Из них 17 обнаружены в мотиве (S/TPXX), потенциальном сайте фосфорилирования для сdс2-киназы. Известно, что сdс2-киназа и родственные киназы способны фосфорилировать Rb белок.

По-видимому, имеются два класса сайтов фосфорилирования на Rb белке, один из которых является критическим для инактивации Rb белка таким образом, что он не может связываться с большим Т-антигеном, в то время как другие могут фосфорилироваться без влияния на связывание. Поскольку имеются по меньшей мере 17 потенциальных сайтов фосфорилирования (S/ТРХХ) для Rb-киназного комплекса, некоторые могут быть существенны для инактивации Rb белка. Этими 17 сайтами фосфорилирования являются Т005, S230, S249, Т252, Т356, Т373, S567, S612, Т773, S780, S788, S795, S807, S811, Т821, Т826, где Т и S обозначают треонин и серин соответственно, а числа обозначают номера остатка аминокислоты в Rb белке.

Мутированный ретинобластомный ген предпочтительно мутирован одним из двух различных способов, причем оба влияют на способность белка фосфорилироваться. Во-первых, ген может быть мутирован изменением аминокислот в районах консервативной гомологии Rb гена. Предпочтительно район консервативной гомологии Rb гена выбирают из группы, состоящей из P1, P3 и Р5, как описано здесь. Репрезентативные примеры мутированных Rb генов, кодирующих мутированный Rb белок, показаны в EOQ1D 1 и 2. Специалист с обычной квалификацией в этой области, со знанием важности консервативных доменов гомологии для фосфорилирования белка мог бы легко сконструировать другие мутированные Rb гены, кодирующие другие желательные мутированные Rb белки.

Вторым способом предотвращения фосфорилирования и тем самым инактивации Rb белка является мутирование посредством изменения аминокислот в сайтах фосфорилирования. Предпочтительно сайты фосфорилирования выбирают из группы, состоящей из Т005, S230, S249, Т252, Т373, S567, S608, S612, Т773, S780, S788, S795, S807, S811, Т821 и Т826. В этих сокращениях для сайтов фосфорилирования S обозначает серин, Т обозначает треонин, а числа обозначают расположение аминокислоты в последовательности Rb белка. Для описанных здесь мутантов фосфорилирования каждый из остатков треонина или серина был мутирован в аланин в отдельных плазмидах. Как указано выше, имеются по меньшей мере 2 класса сайтов фосфорилирования, один из которых важен для инактивации pRb. Поэтому один или более мутантов, созданных, как описано выше, должен уменьшать фосфорилирование мутантного рRb и предотвращать его инактивацию.

В других вариантах данного изобретения обеспечены также плазмиды, содержащие ДНК, кодирующую мутированные Rb белки. Кроме того, обеспечена также плазмида, приспособленная для экспрессии в рекомбинантной клетке, содержащая ДНК, кодирующую мутирсванный Rb белок SEQ 1D 1, и регуляторные элементы, необходимые для экспрессии этой кДНК в клетке, и плазмида, приспособленная для экспрессии в рекомбинантной клетке, содержащая ДНК, кодирующую мутированный Rb белок SEQ 1D 2, и регуляторные элементы, необходимые для экспрессии этой кДНК в клетке.

Мутанты р53 гена
В другом варианте данного изобретения мутированным супрессорным геном роста является мутированный р53 ген. Предпочтительно р53 ген мутирован изменением аминокислот в консервативных районах гомологии р53 гена (подчеркнутых в таблице 1). Также консервативный район гомологии р53 гена выбран из группы, состоящей из P1, P3 и Р5. Мутанты могут иметь мутации при Р1, P3 или Р5, отдельно или в любом сочетании (в том числе возможны мутации всех трех районов). Кроме того, мутанты, в которых С-концевые аминокислотные остатки 295-393 были делегированы, были все еще активны в связывании со специфической последовательностью ДНК.

Применение pRb и р53 мутантов для супрессии клеточного роста
Данное изобретение описывает также новые трансфицированные клетки, например, трансфицированную клетку, содержащую выделенную молекулу ДНК пункта 1 формулы изобретения, кодирующую мутированный Rb белок. Данное изобретение обеспечивает также стабильно трансфицированные клетки, экспрессирующие мутированный Rb ген, кодирующий мутированный Rb белок. Предпочтительно трансфицированные клетки данного изобретения содержат мутированный Rb ген, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую мутированный Rb белок, показанный в SEQ 1D 1 или SEQ 1D 2. Кроме того, данное изобретение обеспечивает стабильно трансфицированную клетку, экспрессирующую мутированный р53 ген, кодирующий мутированный р53 белок.

Данное изобретение обеспечивает также способ лечения патологических клеточно-пролиферативных заболеваний, предусматривающий введение в нераковую пролиферирующую клетку молекулы ДНК мутированного ростового супрессорного гена. Вводимой молекулой в одном варианте является мутированный Rb или р53 ген. Этот ген мутирован изменением аминокислот в консервативных районах гомологии Rb гена, или этот ген мутирован изменением аминокислот в сайтах фосфорилирования. Консервативные районы гомологии и сайты фосфорилирования являются такими же, какие описаны выше.

В общих чертах этот способ можно применять для лечения любого клеточно-пролиферативного заболевания. Типичными примерами неракового клеточно-пролиферативного заболевания являются псориаз, доброкачественные пролиферативные кожные болезни, ихтиоз, папиллома, базалиома, плоскоклеточный рак, фибропролиферативные заболевания, вазопролиферативные заболевания и дерматопролиферативные заболевания.

Данное изобретение обеспечивает также способ лечения злокачественных клеточно-пролиферативных заболеваний в индивидуумах, предусматривающий введение в пролиферирующую раковую клетку молекулы ДНК мутированного Rb или р53 гена. Эти мутированные гены сконструированы, как описано выше.

В общих чертах способ лечения злокачественных клеточно-пролиферативных заболеваний сходен с лечением нераковых клеточно-пролиферативных заболеваний. Типичные примеры заболеваний, вызываемых пролиферацией раковых клеток, включают в себя (но не ограничиваются ими) остеосаркому, фибросаркому, ретинобластому, карциному молочной железы, мочевого пузыря, шейки матки, легкого, толстой кишки, яичника, почки, поджелудочной железы и предстательной железы.

Согласно способу данного изобретения можно манипулировать процессом пролиферации клеток посредством введения мутантного Rb или р53 белка для предотвращения или ингибирования атипичной пролиферации в большом разнообразии клеточно-пролиферативных заболеваний. Манипулирование пролиферативным процессом можно выполнять путем введения в пролиферирующую клетку-мишень конструкции ДНК, кодирующей мутантный ДНК, или р53 белковый элемент.

Данное изобретение обеспечивает также способ лечения очаговых клеточно-пролиферативных заболеваний, предусматривающий введение мутированного Rb или р53 гена в пролиферирующие клетки. В общем, пролиферирующая клетка может быть причиной таких типичных заболеваний, как фибропролиферативные, вазопролиферативные и неопластические (опухолевые) заболевания в глазу.

В другом варианте сайт фосфорилирования Rb гена подвергают мутагенезу перед его введением в клетку. Имеется 17 потенциальных сайтов фосфорилирования на Rb белке. Мутация кодирующих серин или треонин последовательностей в кДНК Rb в кодирующие аланин или валин или другие аминокислоты последовательности приводила бы, таким образом, к образованию перманентно активного Rb белка, который не может быть инактивирован фосфорилированием, т.е. клетка-хозяин не была бы способна инактивировать Rb белок фосфорилированием. Введение такого мутированного Rb гена в клетку приведет, следовательно, к остановке роста. Все эти мутанты были субклонированы в векторе промотора β-актина человека. Для субклонирования кДНК полную открытую рамку считывания лигировали с синтетическим линкером, содержащим сайт Bam-H1 CGGATCCGCGTC на 5'-конце и синтетическим линкером, содержащим ААТААА и сайт Ваm Н1 на 3'-конце. Полученный фрагмент Вam H1 субклонировали в Ваm Н1 сайт этого вектора и отбирали клон с правильной ориентацией.

ПРИМЕР 1
Получение р5 мутантов m 89-0 и m 88-0
Для получения мутанта m 89-0 синтезировали пару ДНК-олигонуклеотидных праймеров (Рm1 и QM1), содержащих мутируемый район "Р5", и пару олигонуклеотидов, фланкирующих район "Р5" (Р3 и Q3), с использованием синтезатора олигонуклеотидов АВ1 РСR-mate согласно инструкциям изготовителя. С применением кДНК Rb дикого типа в качестве матрицы выполняли 40 циклов полимеразной цепной реакции (РСЕ) с праймерами Р3 и Qm1. Во второй пробирке проводили 40 циклов полимеразной цепной реакции с праймерами Рm1 и Q3. После завершения реакции брали небольшую аликвоту реакционного продукта из первой пробирки и проводили 80 циклов PCR в присутствии избытка Р3 праймера. Подобным образом проводили 80 циклов РСR в присутствии избытка Q3 праймера во второй пробирке. Затем комбинировали преимущественно одноцепочечные продукты реакции из этих двух пробирок и удлиняли праймер в течение 20 циклов. Полученный двухцепочечный продукт, содержащий теперь мутированный Р5 район, субклонировали в экспрессирующую Rb плазмиду HuBAcpr-1-neo-PQ (m 89-0) при Мlu 1 и Hind 3 сайтах. Полученная плазмида имеет мутированный Р5 район, показанный ниже, с подчеркнутыми мутированными аминокислотами. К870 и Н890 обозначают аминокислотные остатки лизина и гистидина в положениях 870 и 890 соответственно в Rb белке. Подобным образом получали m88-0.

Rb дикого типа: K₈₇₀PLKKLRFDIEGSDEADGSKH₈₉₀
Мутантный m89-0 Rb: - K₈₇₀PLKKLRFDIEASAEVDASIH₈₉₀ (SEQ ID N 2)
Мутантный m88-0 Rb: - K₈₇₀LLIKPRYDTEGSDEADGSKH₈₉₀ (SEQ ID N 1)
ПРИМЕР 2
Действие трансфицированных плазмид на линию фибробластных клеток человека
Действие кДНК Rb на рост клеток было видно, когда мутант m89-0 трансфицировали в линию нормальных фибробластных клеток человека WS1. Ген большого Т-антигена SV40 применяли в качестве контроля для трансфекции. Затем плазмиду pPVUO-neo, содержащую ген большого Т-антигена SV40 и ген устойчивости к неомицину, трансфицировали для наблюдения эффективности трансфекции. Кроме того, неактивную мутантную форму Rb гена, "HuBAcpr-1-neo-P16" использовали в качестве контроля. Для трансфекции 100 мкг каждой из плазмидных ДНК смешивали с 107 находящихся в экспоненциальной фазе роста WS1 клеток в конечном объеме 0,8 мл среды RPM1 1640 (Gibco) с 10%-ной фетальной телячьей сывороткой (FСS) в камере для электропорации Cell-Porator TM (BRL). Электропорацию выполняли при 200 вольтах и 1180 мкФ. Электропорированные клетки выдерживали при комнатной температуре в течение 10 минут и затем разбавляли средой RРМ1 1640 с 10%-ной FСS и высевали на чашки 60 мм при плотности клеток 2•10 клеток/см². Клеткам давали прикрепиться и расти в той же самой среде в течение 2 дней. После этого среду заменяли свежей средой RPM1 1640 с 10%-ной FСS и 15 мкг/мл G418 (Gibco). Каждые три дня брали чашки (из двух повторностей) для гистоиммунохимического окрашивания при помощи либо кроличьих поликлональных антител против белка Rb RВ1-АВА1 (фиг. 8А), либо при помощи мышиных моноклональных антител против большого Т-антигена SV40 Pab 101 (фиг. 8В). Как можно видеть из фиг. 8А, через 13 дней после трансфекции и отбора в среде G418 WSI клетки, которые экспрессировали трансфицированный содержащий кДНК Rb плазмидный m 89-0, окрашивались интенсивно антителами против белка Rb. Однако клетки, которые экспрессировали Rb белок, оставались в виде одиночных клеток и не делились. В противоположность этому клетки, которые экспрессировали трансфицированный большой Т-антиген SV40 (SVLT), продолжали делиться с образованием колоний, как показано группами клеток, окрашенными положительно мышиными анти-SVLT антителами, на фиг. 8В. Таким образом, избыточная экспрессия кДНК m 89-0 Pb в клетке приводила к полной остановке роста клеток линии нормальных клеток WSI. Клетки, трансфицированные неактивной формой Rb HuβAcpr-1-neo-Р16, не были подавленными и делились с образованием колоний клеток.

ПРИМЕР 3
Действие трансфицированных плазмид на линию клеток рака мочевого пузыря человека ТССSUР
Мутант m 89-0 и HuβAspr-1-neo-Р16 плазмиду также трансфицировали в клетки рака мочевого пузыря человека TCCSUP, не имеющие эндогенного Rb белка, при помощи процедур, описанных выше. Применяемые плазмиды, методы трансфекции и иммуноокрашивания идентичны описанным выше.

Как можно видеть на фиг. 9А, клетки, экспрессирутощие трансфицированную кДНК m 89-0, не могли делиться. В противоположность этому клетки, экспрессирующие трансфицированную HuβAcpr-1-neo-Р16, делились с образованием колоний (фиг. 9В). Избыточная экспрессия кДНК Rb m 89-0 приводила к серьезной задержке роста опухолевых клеток in vitro.

ПРИМЕР 4
Кроме мутантов Rb с мутациями при районах, гомологичных между Rb и р53, получали мутации в р53 белке. Таблица II дает частичную аминокислотную последовательность р53 дикого типа и полученных мутантов с мутациями в консервативных аминокислотах. Кроме того, таблица II дает последовательность ДНК, соответствующую мутантной аминокислотной последовательности. Для получения этих мутантов синтезировали два праймера и гибридизовали друг с другом. PCR проводили, как описано выше. Как показано выше, изменение районов Р1, Р3 и Р5 приводит к изменению в конформации р53 белка таким образом, что теперь он способен связываться непосредственно с его ДНК-последовательностью - мишенью.

ПРИМЕР 5
Получение рекомбинантного ретровируса, содержащего мутантный Rb ген
Фрагмент Hind 111/Bam H1, содержащий весь кодирующий район мутантного Rb 89, субклонировали в сайты Hind 111/ Bgl 11 в ретровирусном векторе. Полученные плазмидные векторы трансфицировали в клеточную линию Psi-2. Среду, применяемую для культивирования трансфицированных клеток, инфицировали другой клеточной линией РА317. Клетки, продуцирующие рекомбинантный вирус, отбирали в G418, и ретровирус собирали из среды и концентрировали и очищали при помощи сахарозного градиента. Мутанты р53 гена испытывали описанным выше образом.

ПРИМЕР 6
Действие вируса G1N aSVRb 89 на пролиферацию клеток в глазах
Экспериментальную пролиферацию витреоретинопатию (PVR) в кроликах индуцировали инъекцией кроличьих фибробластов и индуцированием локализованной раны. Эта процедура состоит в индуцировании раны в лимбе и инъецировании 2•10⁵ кроличьих фибробластов в стекловидное тело при общей анестезии. Постоперационно кролик получает содержащую антибиотики мазь для топического нанесения.

Рекомбинантные ретровирусы с мутантным Rb или р53 геном инъецируют в стекловидное тело (2•10⁵ клеток/кролика) животного при общей анестезии. Сначала локальную переносимость вирусрв испытывают оценкой максимальной дозы вируса (концентрации вируса и объема инъекции вируса). Ретровирусы уже применяли для инъекции под сетчатку у мышей, причем не сообщались побочные действия (Turner and Cepko, Nature 328:132, 1987). Максимальная доза, не дающая побочных действий, должна применяться для всего последующего лечения.

Рост клеток in vivo наблюдали посредством фотографии. Степень отслоения сетчатки сравнивали с контролями, в которых инъецировали только ретровирус, содержащий ген l-галактозидазы. Кроме того, рост клеток in vivo наблюдали мечением при жизни бромдезоксиуридином. За час перед эвтаназией кролику давали 50 мг/кг бромдезоксиуридина (Brdu) внутривенно для мечения пролиферирующих клеток. После эвтаназии клетки анализировали на включение BrdU в их DНК при помощи иммуноокрашивания антителами к BrdU. Одновременно проводили также иммунное окрашивание этих клеток с антителами против Rb или р53 белка или l-галактозидазного белка для оценки эффективности инфицирования.

Оптимальное время для подавления ретровирусом роста инъецированных клеток определяли инъекцией вируса при различном времени после индуцирования PVR. Определяли также влияние стекловидного тела на эффективность инфицирования в фибробластах кролика. Определяли также временную задержку для добавления этих вирусов на фибробластах кролика. Кроме того, определяли временную задержку для добавления этих вирусов на фибробластах кролика, которые стимулировались факторами роста фибробластов для увеличения скорости роста.

Все патенты и публикации, упоминавшиеся в этой заявке, предназначены для специалистов в области, к которой относится данное изобретение. Все патенты и публикации включены в виде ссылок так, как если бы каждая отдельная публикация была указана отдельно и специально в виде ссылки.

Специалист в данной области легко поймет, что данное изобретение хорошо приспособлено для достижения целей и получения указанных результатов и преимуществ, а также других, связанных с данным изобретением. Даваемые примеры вместе со способами, процедурами, обработками, молекулами и специфическими соединениями, описанными здесь, представляют собой типичные предпочтительные варианты, являются образцами и не предназначены для ограничений сферы действия изобретения. Изменения в них и другие применения могут быть придуманы специалистами в этой области, но эти изменения находятся в пределах сущности изобретения, определенного объемом формулы изобретения.

Формула изобретения

1. Синтетический мутантный ген Rb, кодирующий мутантный функционально активный ретинобластомный белок, где указанный ген мутирован путем изменения нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, представленную в таблице 1, в консервативной области гомологии Р5 белка Rb, которая гомологична области Р5 белка р53.

2. Синтетический мутантный ген по п. 1, где указанный ген кодирует аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 1 и 2.

3. Синтетический мутантный ген Rb, кодирующий мутантный функционально активный ретинобластомный белок, где указанный ген мутирован путем изменения нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислоту, расположенную в сайте фосфорилирования белка, выбранную из группы, состоящей из Т005, S230, S249, Т252, Т373, S567, S608, S612, Т773, S780, S788, S795, S807, S811, Т821 и Т826, где указанное вторым число означает номер аминокислотного остатка в последовательности Rb, мутация которого предотвращает фосфорилирование указанного белка Rb с приданием указанному белку конститутивной активности в подавлении клеточной пролиферации.

4. Синтетический мутантный ген р53, кодирующий мутантный функционально активный белок р53, где указанный ген мутирован путем изменения нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, представленную в таблице 1, в консервативной области гомологии Р5 белка р53, которая гомологична области Р5 белка Rb.

5. Плазмида, содержащая ген, охарактеризованный в п. 1, предназначенная для экспрессии кодируемого указанным геном белка в рекомбинантной клетке млекопитающего.

6. Плазмида, содержащая ген, охарактеризованный в п. 3, предназначенная для экспрессии кодируемого указанным геном белка в рекомбинантной клетке млекопитающего.

7. Плазмида по п. 5, где указанный ген кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

8. Плазмида по п. 6, где указанный ген кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

9. Способ ингибирования клеточной пролиферации, включающий введение в незлокачественную пролиферирующую клетку плазмиды, охарактеризованной в п. 5.

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что указанные незлокачественные пролиферирующие клетки находятся в организме пациента, страдающего заболеванием, выбранным из группы, состоящей из псориаза, доброкачественных пролиферативных кожных заболеваний, ихтиоза, папилломы, фибропролиферативных заболеваний, вазопролиферативных заболеваний и дерматопролиферативных заболеваний.

11. Способ ингибирования клеточной пролиферации, включающий введение в незлокачественную пролиферирующую клетку плазмиды, охарактеризованной в п. 6.

12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что указанные незлокачественные пролиферирующие клетки находятся в организме пациента, страдающего заболеванием, выбранным из группы, состоящей из псориаза, доброкачественных пролиферативных кожных заболеваний, ихтиоза, папилломы, фибропролиферативных заболеваний, вазопролиферативных заболеваний и дерматопролиферативных заболеваний.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20