Синтетический индуцибельный эукариотический промотор для регуляции транскрипции гена (варианты)

 

Изобретение может быть использовано в биотехнологии для создания индуцибельных систем экспрессии млекопитающих. Синтетический индуцибельный эукариотический промотор для регуляции транскрипции гена получают путем встраивания в природный промотор hМТ-11А, содержащий природный элемент, отвечающий на индукцию металлом (МОЭ), одного и более элемента, отвечающего на индукцию глюкортикоидом (ГОЭ). Синтетический промотор на основе природного промотора ММТ V-LTR, содержащего природный элемент, отвечающий на глюкокортикоиды (ГОЭ), получают путем встраивания одного или более МОЭ в природный промотор. Изобретение позволяет обеспечить синергический уровень экспрессии гена в эукариотической системе экспрессии. 2 с. и 11 з.п.ф-лы, 1 ил., 4 табл.

Настоящее изобретение относится к созданию усовершенствованных индуцибельных систем экспрессии млекопитающих.

Предпосылки создания изобретения Системы экспрессии млекопитающих широко используются для получения, с помощью рекомбинантной технологии, белков, модифицированных после трансляции. Эти системы могут быть или конститутивными, или индуцибельными. Рекомендуется использовать индуцибельные системы для экспрессии потенциально цитотоксических белков.

Ключевым элементом, определяющим, какой является система, конститутивной или индуцибельной, является промотор. Охарактеризовано несколько промоторов млекопитающих, которые могут быть индуцированы в экспериментальных системах, при этом особенно широко исследовались промоторы, присутствующие в генах металлотионеина (МТ) и в длинном концевом повторе вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV - LTR).

Лучшими индукторами для МТ промотора являются ионы тяжелых металлов, таких как кадмий (Cd) и цинк (Zn). Индукция промотора опосредована факторами транскрипции, которые после активации металлами связываются с элементами, ответственными за индукцию металлом (МОЭ). Данный промотор содержит также несколько конститутивных (неиндуцибельных) элементов, которые связываются с факторами транскрипции, которые не нужно активировать и которые ответственны за основной уровень генной экспрессии. В результате присутствия этих конститутивных элементов уровень экспрессии МТ промотора без экспрессии достаточно значителен, а коэффициент индукции (коэффициент отношения индуцибельной экспрессии к основному уровню экспрессии) обычно не выше, чем 5-10 раз. Были предприняты попытки снизить основной уровень экспрессии за счет удаления некоторых конститутивных элементов МТ промотора. Однако, удаление этих элементов снижает также уровень индуцибельной экспрессии.

Нативный человеческий МТ-11А промотор содержит, помимо МОЭ и конститутивных элементов, единичный элемент, ответственный за индукцию глюкокортикоидами (ГОЭ), и глюкокортикоиды, такие как дексаметазон (dex), индуцируют низкие уровни экспрессии с МТ-11А промотора в его нативном окружении.

Нативный MMTV - LTR промотор содержит четыре индуцибельных ГОЭ и может быть в значительной мере индуцирован глюкокортикоидами. Основной уровень экспрессии ниже, чем в случае с человеческим МТ-11А промотором, но абсолютный уровень индуцибельной экспрессии не столь высок.

Последовательности нуклеиновой кислоты, такие как индуцибельные элементы, участвующие в регуляции генной экспрессии, могут быть расположены в направлении 5'к, 3'к или внутри регулирующего гена.

Краткое изложение сущности изобретения Согласно данному изобретению предлагается синтетический индуцибельный эукариотический промотор для регуляции транскрипции гена, включающего не менее двух различных классов индуцибельных элементов. Классы индуцибельных элементов, к которым относится данное изобретение, включают элементы, отвечающие на гормон (включающие и ГОЭ), элементы, отвечающие на металл (МОЭ), элементы, отвечающие на тепловой шок, элементы, отвечающие на интерферон, и элементы, отвечающие на цитокин.

По одному из вариантов, предлагаемый здесь синтетический промотор получается из нативного промотора, а один из различных классов индуцибельных элементов представляет собой нативный индуцибельный элемент, тогда как другой предлагаемый здесь получается либо за счет инсерции в нативный промотор, либо за счет активации неактивного в нормальном состоянии элемента нативного промотора. При этом в общем случае в новом синтетическом промоторе данного изобретения присутствуют два различных класса индуцибельных элементов, однако, при желании, можно получить в результате комбинации три и более элемента.

Использование различных классов индуцибельных элементов позволяет добиться синергического эффекта в индукции экспрессии генного продукта в эукариотичеокой системе экспрессии, особенно в системе экспрессии млекопитающих. Так, уровень генной экспрессии, достижимый при совместной индукции различными классами индуцибельных элементов, выше, чем сумма отдельных уровней экспрессии, полученных при индукции каждым индивидуальным классом индуцибельных элементов. К тому же при этом может быть увеличен общий уровень генной экспрессии.

Предлагаемые здесь синтетические промоторы обычно получаются из натуральных в результате модификации, более детально описанной ниже, хотя такие промоторы могут также быть синтезированы.

Как отмечалось выше, индуцибельные промоторы могут содержать по крайней мере, один конститутивный элемент, который обеспечивает основной уровень генной экспрессии в отсутствии индукции.

По одному из вариантов, предлагаемых в изобретении, хотя бы один такой конститутивный элемент имеет функциональные нарушения, выражающиеся в снижении основного уровня генной экспрессии и в увеличении коэффициента отношения индуцированной экспрессии гена к основной экспрессии гена в сравнении с немодифицированным промотором. Такие функциональные нарушения могут быть вызваны делецией нативного промотора и/или инсерцией индуцибельного элемента.

В настоящем изобретении предлагается, как наиболее предпочтительный, вариант, использующий усовершенствованные индуцибельные эукариотические промоторы, содержащие не только нативные ГОЭ и/или МОЭ, но также дополнительные ГОЭ и/или МОЭ. В таком усовершенствованном промоторе конститутивные элементы могут иметь и не иметь делецию. Усовершенствованный промотор может быть подвергнут синергической индукции ионами тяжелого металла и глюкокортикоидом (таким, как дексаметазон) при их одновременном использовании в случае присутствия хотя бы одного МОЭ и хотя бы одного ГОЭ. Синергическая индукция выражается в повышении уровней генной экспрессии в сравнении с немодифицированными промоторами, такими как МТ-11А или MMTV - LTR. Новые промоторы могут также содержать меньшее количество конститутивных элементов, чем немодифицированные промоторы, что сказывается на снижении основного уровня генной экспрессии.

Немодифицированный промотор может быть как человеческим, так и промотором MMTV - LTR. Ответственные элементы могут содержать обобщающую типичную последовательность, например: 5'-ГАТЦТТГЦГЦЦЦГГЦЦЦГ-З' (SEQ ID N 2) содержит обобщающая типичная последовательность МОЭ и 5' -ГАТЦТГГТАЦАГГАТГТТЦТАГЦТАЦГ-3'(SEQ ID N1) содержит типичная обобщающая последовательность ГОЭ, используемые в методиках настоящего изобретения.

К плюсам настоящего изобретения относятся: а) высокий общий уровень генной экспрессии, в) сниженный уровень основной генной экспрессии, с) синергическая индукция экспрессии гена,
д) промоторы ранжируются относительно их коэффициента индукции или в соответствии со способностью отвечать на подходящий индуктор.

Краткое описание рисунков
На чертеже представлена генетическая карта hMT-11A промотора и модифицированного промотора с различными модификациями, воздействующими на hMT-11A промотор в соответствии с методикой настоящего изобретения.

Общее описание изобретения
Как отмечалось выше, предлагаемый здесь новый промотор может быть получен из нативного промотора. В предпочтительном варианте, предлагаемом в настоящем изобретении, промотор содержит не менее одного нативного индуцибельного элемента, которым является МОЭ, и как минимум один другой индуцибельный элемент, отвечающий на гормон, в частности, элемент, отвечающий на глюкокортикоид (ГОЭ), получаемый в результате инсерции нативного промотора.

Такие ГОЭ-вставки могут представлять собой синтетическую молекулу, включающую пару комплементарных олигонуклеотидов, содержащих типичную обобщающую последовательность ГОЭ. В нативный промотор может быть вставлено множество ГОЭ в виде мультимерного самолигирующего элемента в направлении "голова-хвост".

В наиболее предпочтительном варианте реализации изобретения предлагается промотор человеческого мелаллотионеинового гена (hМТ-11А), модифицированный так, что содержит как минимум один индуцибельный ГОЭ и МОЭ и при этом достигается синергизм генной экспрессии при индукции индуцибельных ГОЭ и МОЭ в эукариотической системе экспрессии в сочетании, как правило, с общим повышенным уровнем экспрессии генного продукта. В таком наиболее предпочтительном варианте в нативный hMT-11A промотор могут быть вставлены мультимерные "голова-к-хвосту" ГОЭ.

Предпочтительно также нарушить функционирование хотя бы одного конститутивного элемента в нативном hMT-11A промоторе, в частности, за счет делеции и/или инсерции не менее одного ГОЭ. В одном из примеров, иллюстрирующих данное изобретение, используются как делеция конститутивных элементов, так и инсерция единственных или множественных ГОЭ с целью нарушения функционирования конститутивных элементов.

В другом предпочтительном варианте промотор содержит как минимум один нативный гормональный индуцибельный элемент, в частности, элемент, отвечающий на глюкокортикоид (ГОЭ) и как минимум один другой индуцибельный элемент, которым является МОЭ, получаемый в результате инсерции.

Такой вставленный МОЭ может представлять собой синтетическую молекулу, включающую пару комплементарных олигонуклеотидов, содержащих обобщающую типичную последовательность МОЭ. В нативный промотор может быть вставлено множество МОЭ в виде мультимерного самолигирующего элемента в направлении "хвост-голова".

В наиболее предпочтительном варианте реализации изобретения предлагается длинный концевой повтор промотора в вирусе опухоли молочной железы мышей (MMTV - LTR промотора), модифицированный так, что содержит как минимум один индуцибельный МОЭ и при этом достигается синергизм генной экспрессии при индукции ГОЭ и МОЭ в эукариотической системе экспрессии в сочетании с повышением общего уровня генной экспрессии. В этом предпочтительном варианте в нативный промотор MMTV - LTR могут быть вставлены мультимерные МОЭ в направлении "голова-хвост".

Новый синтетический индуцибельный эукариотический промотор, предлагаемый в настоящем изобретении, может быть включен в вектор для эукариотической экспрессии генного продукта, особенно, если он связан оперативно с геном, подвергающимся экспрессии в данной системе. Такая система экспрессии может включать эукариотические клетки, содержащие вектор, в частности, клетки млекопитающих, такие как Vero, CHO, Hela, Rat II фибробласты и эпителиальные клетки кишечника.

Описание способа проведения предпочтительного варианта
На чертеже показаны различные версии нового промотора, включающего различные модификации в соответствии с предложенными здесь методами. Новые серии промоторов получаются с использованием следующей методики, Ks pI фрагмент ДНК, содержащий 800 пар оснований, в 5' регионе промотора человеческого МТ-11А гена (основания от -740 до +60) был выделен из плазмиды, содержащей человеческий МТ-ПА ген (см. Karin et al., (1982) Nature, 299, 797-802). После создания липких концов добавляются Hind II линкеры, и фрагменты вставляются в pSV OATCAT, плазмиду, содержащую ген хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT), используемый как считываемый ген в направлении от 5'-сайта Hind III до CAT гена. Два конститутивных элемента (АР1 и АР2 - см. верхнюю карту, фиг. 1) исходного МТ-ПА промотора имеют делеции в результате удаления Xma III фрагмента (основания от -79 до -129).

Была синтезирована пара комплементарных олигонуклеотидов, содержащих обобщающую типичную последовательность ГОЭ, 5' Bam HI сайт и 3' Bgl II сайт. "Плюс" цепь олигонуклеотидной последовательности была следующей:
5' -ГАТЦТГГТАЦАГГАТГТТЦТАГЦТАЦГ-3' (SEQ /D NI)
Мультимерные ГОЭ "голова-хвост" были приготовлены самолигированием синтетических ГОЭ олигонуклеотидов в присутствии Bam HI и Bg II. Единичные и множественные ГОЭ были вставлены в Sac II и сайт промотора (у основания - 175) или в Xma III сайт промотора (у основания - 129) (См. нижнюю карту на фиг. 1). Инсерция в Sac II элемент разрушает второй АР2 сайт.

Пара комплементарных олигонуклеотидов, содержащих обобщающую типичную последовательность МОЭ, 5' Bam HI сайт и 3' Bgl II сайт, затем были синтезированы. "Плюс" цепь нуклеотидной последовательности была следующей:
5' -ГАТЦТТГЦГЦЦЦГГЦЦЦГ-3' (SEQ ID N 2)
Такие олигонуклеотиды могут использоваться для синтеза мультимерных элементов "голова-хвост", при этом аналогичным способом единичные или множественные МОЭ могут быть вставлены в bМТ-ПА промотор, как и в случае с ГОЭ.

MMTV -CAT вектор для создания подобных инсерций в ГОЭ и/или МОЭ и делении конститутивных элементов MMTV -CAT промотора был получен на основании плазмиды р201 (Majors et al., 1981, Nature, 283, 253-258) с использованием Pst I и после образования липких концов, включается в Hind III сайт на pSV ОАТСАТ.

Новые промоторы тестировались в опыте по временной экспрессии CAT с использованием РАТП фибробластов, CНО (яйцеклетки китайского хомячка), VERO (фибробласты обезьяны) и Hela (цервикальные опухолевые клетки человека) при экспрессии глюкокортикоидного рецептора. Представленные в примерах ниже результаты показывают, что такие новые промоторы характеризуются очень высоким уровнем экспрессии как в случае нормальной экспрессии глюкокортикоидного рецептора, так и после транcфекции гена глюкокортикоидного рецептора при одновременной индукции ионами тяжелых металлов или дексаметазоном. Получаемые с помощью таких промоторов уровни индуцированной экспрессии оказываются гораздо выше таковых в случае промоторов дикого человеческого МТ-ПА или MMTV - LTR. В то же самое время основной уровень экспрессии значительно ниже, чем получается при использовании дикого типа человеческого МТ-ПА промотора.

Примеры
Приведенное выше раскрытие описывает изобретение в общих чертах. Более полное понимание может быть достигнуто за счет приведения соответствующих специфических примеров. Такие примеры приводятся исключительно с целью иллюстрации и никоим образом не претендуют на то, чтобы сузить область данного изобретения в рамках этих примеров. Изменение формы или замещение эквивалентов допускаются на основании их целесообразности в соответствующих условиях. Хотя здесь и приводятся исключительно с целью иллюстрации и никоим образом не претендуют на то, чтобы сузить область данного изобретения в рамках этих примеров. Изменение формы или замещение эквивалентов допускаются на основании их целесообразности в соответствующих условиях. Хотя здесь и будут применяться специфические термины, они используются исключительно с описательной целью.

Пример 1
Этот пример иллюстрирует конструирование модифицированных hMT-ПА промоторов, содержащих дополнительные ГОЭ.

Все векторы МТ экспрессии являются производными от pSV OATCAT, плазмиды, содержащей ген хлорамфеникол-ацетилтрансфераза (CAT ген) без регуляторной последовательности (Gorman et al., Mol. Cell. Biol. 2, 1044, 1982). МТ-САТ, контрольная плазмида, в которой CAT ген находится под контролем человеческого МТ-ПА промотора (hMT-ПА) дикого типа, получается по способу, описанному ниже. Фрагмент Ksp1 в 800 пар оснований промоторного региона hMT-ПА (основания от -740 до +60) выделяется в соответствии с этой методикой (фиг. 1). После образования липких концов добавляются Hind III линкеры и фрагмент вставляется в Hind III сайт на pSV OATCAT в положении 5' CAT гена. Плазмида МТ-САТ -ΔX создается за счет удаления Xma III фрагмента (основания от -79 до -129) из МТ промотора МТ-САТ, который содержит конститутивные АР1-АР2 элементы. Для того, чтобы вставить дополнительные ГОЭ, синтезируется пара комплементарных олигонуклеотидов, содержащих обобщающую типичную последовательность, 5' сайт Bam HI и 3' сайт Bgl II, далее за счет самолигирования этих синтетических последовательностей в присутствии Bam HI и Bgl II создаются мультимерные элементы в направлении "голова-хвост". Нуклеотидная последовательность "плюс" цепи соответствует SEQ ID N 1, определенной выше. Затем мономерные или мультимерные ГОЭ вставляются или в Sac II, или в Xma III сайт, МТ-САТ -ΔX вектора после образования липких концов (фиг. 1). Количество вставленных ГОЭ подтверждается результатами секвенирования ДНК.

Пример 2
Этот пример иллюстрирует использование вектора экспрессии, содержащего дополнительные ГОЭ.

В настоящем примере используется вектор SG2, являющийся производным от вектора pSV ОАТСАТ экспрессии CAT, содержащий модифицированный МТ-ПА промотор, в который вставлены два дополнительных ГОЭ в Sac II сайт на МТ-САТ -ΔX (Рис. 1). Пятнадцать μ г плазмидной ДНК переносится методом трансфекции в CHO клетки с использованием кальций-фосфатной процедуры (Graham et al., 1973, Virology, 52, 456-467). После инкубации в течение 5 часов при 37^oC клетки подвергли шоку с использованием 15% глицерина в PBS. Затем монослои инкубировались с различными индукторами (Cd Cl₂ и/или дексаметазон) в течение 16 часов, а далее получаются клеточные экстракты. После этого с использованием ¹⁴С-хлорамфеникола в качестве субстрата определяется CAT активность, при этом радиоактивный ацетилированный продукт экстрагируется с помощью ксилена. Радиоактивность промеряется в сцинтилляционном счетчике.

Вдобавок к этому, SG 2 вектор сравнивается с двумя другими векторами, которые сконструированы за счет инсерции МТ-Па промотора дикого типа и MMTV - LTR промотора в Hind III сайт плазмиды pSV ОАТСАТ. Поскольку CНО клетки не имеют глюкокортикоидных рецепторов, эти клетки были совместно трансфицированы 10 μ г вектора экспрессии глюкокортикоидного рецептора (Giguere et al., 1986, Cell, 46, 645-652). Исследование CAT экспрессии проводилось в квадрупликате, а стандартное отклонение не превышало 10%. Концентрация белка измерялась в каждом лизате клеток, и в эквивалентных количествах белка вычисляется активность CAT. Результаты этих экспериментов суммированы в табл.1.

Результаты, представленные в табл. 1, показывают, что синергическая индукция SG 2 промотора металлами и дексаметазоном приводит к повышению уровня экспрессии CAT гена в сравнении с диким типом МТ-ПА и MMTV - LTR промоторов. В то же самое время значительно улучшился и коэффициент индукции.

Пример 3
Этот пример также иллюстрирует использование вектора, содержащего дополнительные ГОЭ.

С использованием той же методики, что и в примере 1, мы сравнили активность SG2 промотора и таковой нативного промотора МТ-ПА в VERO клетках, в которых созданы условия для экспрессии глюкокортикоидного рецептора (Giguere et al., 1986, Cell, 46, 645-652). В этом примере клетки также были подвергнуты трансфекции вектором экспрессии, в котором ген β- галактозидазы считывается с помощью промотора, активность которого в экспериментальных условиях не зависит от тяжелых металлов и глюкокортикоидов. После трансфекции и индукции берется аликвота клеточного экстракта для определения активности β- галактозидазы (β- Gal). Полученная величина использовалась далее для стандартизации измерений CAT активности за счет учета эффективности трансфекции.

Полученные результаты представлены в табл.1, из которой видно, что они очень близки к тем, что получены с использованием СНО клеток и выявляют синергизм действия дексаметазона с ионами металла на модифицированный МТ-ПА (SG2) промотор.

Пример 4
Этот пример иллюстрирует возможности дальнейшей модификации вектора экспрессии и полученные при этом результаты. В hМТ-промотор с целью создания дополнительных ГОЭ и множественных МОЭ в SacII сайте и включения множества ГОЭ в Xma III сайте были произведены дополнительные модификации, как это описано детально на чертеже.

Полученная модифицированная плазмидная ДНК была включена в VERO клетки способом, описанным в примере 3, и далее была измерена активность CAT гена, как описано выше. Полученные результаты представлены дальше в табл.3.

Пример 5
Этот пример иллюстрирует конструирование и использование модифицированного MMTV - LTR промотора, содержащего дополнительные ГОЭ.

С использованием методики, аналогичной таковой в приведенных ранее примерах, в Bfr I сайт MMTV - LTR промотора были включены МОЭ, при этом указанный промотор ранее содержал 4 ГОЭ и не содержал МОЭ (Majors и Varmus, Nature 283, 253-258). Табл.4 показывает, что тогда как немодифицированный MMTV -LТR промотор не индуцируется Zn плюс Cd, модифицированный промотор (BM2-MMTV) проявляет 10-кратную индукцию. А когда проводится индукция дексаметазоном в сочетании с Zn и Cd наблюдается двукратная синергия экспрессии CAT.

Результаты экспериментов, представленных в примерах 1-5 и в табл.1 - 4, показывают, что синергической активации можно достичь за счет модификации hMT-ПА промотора при инсерции дополнительных индуцибельных элементов в форме ГОЭ и за счет модификации MMTV промотора при включении дополнительных индуцибельных элементов в виде МОЭ. Добавление ГОЭ к hMT-ПА промотору и МОЭ к MMTV промотору не повышает уровень основной экспрессии гена, однако по сравнению с диким исходным типом эти промоторы обладают повышенной индуцибельной и транскрипционной способностями. В противоположность общей тенденции, при инсерции четырех дополнительных МОЭ (вектор SМ4) в hMT-ПА были получены результаты, рассматриваемые как исключения, поскольку удалось достичь весьма умеренного повышения транскрипционной способности МТ промотора, причем это усиление сопровождалось значительным увеличением уровня основной экспрессии.

Немодифицированный hMT-ПА промотор в векторе МТ-САТ не мог подвергаться индукции дексаметазоном в VERO клетках, несущих в результате трансфекции ген глюкокортикоидного рецептора. Однако, включение хотя бы одного дополнительного ГОЭ было достаточно для генерации способности отвечать на индукцию глюкокортикоидом и к генной экспрессии.

Для анализа влияния на этот процесс числа дополнительных ГОЭ и сайта инсерции по методике, описанной в примерах, были созданы две серии модифицированных промоторов за счет добавления одного или больше ГОЭ в SacII сайт (SG серии) или в Xma III сайт (XG серии) на МТ-САТ -ΔX). Все векторы подвергались индукции CdCl₂ или глюкокортикоидами. Однако, для генерирования синергической индуцибельности при одновременной обработке CdCl₂ и дексаметазоном трансфицированных VERO клеток, независимо от сайта инсерции, необходимы как минимум два соседствующих ГОЭ.

Коэффициент индукции при использовании модифицированного hMT-ПА промотора увеличивался в 6 раз по сравнению с диким типом промотора. Тот факт, что инсерция дополнительных ГОЭ не увеличивает уровень основной экспрессии гена, например, в SG 3, очень важен, поскольку позволяет улучшить коэффициент индукции. Это наблюдение прибавляет дополнительные плюсы к предлагаемому в настоящем изобретении методу достижения синергической активации транскрипции за счет добавления различных классов индуцибельных элементов, а не конститутивных элементов.

Формула изобретения

1. Синтетический индуцибельный эукариотический промотор для регуляции транскрипции гена, который происходит от природного промотора hMT - IIA, содержащего природный элемент, отвечающий на индукцию металлом (МОЭ) и включающий по крайней мере один элемент, отвечающий на индукцию глюкокортикоидом (ГОЭ), встроенный в нативный промотор и обеспечивающий с природным МОЭ синергический уровень экспрессии гена в эукариотической системе экспрессии.

2. Промотор по п.1, отличающийся тем, что в нативный промотор встраивают множество ГОЭ.

3. Промотор по п.2, отличающийся тем, что множество связанных ГОЭ включают в указанный промотор в присутствии Bam HI и Bgl II в виде самолигирующего мультимерного элемента в направлении "голова-хвост".

4. Промотор по любому из пп.1 - 3, отличающийся тем, что включаемый ГОЭ представляет собой синтетическую молекулу, содержащую консенсусную последовательность ГОЭ и имеющую "плюс" цепь следующей нуклеотидной последовательности:
5'-ГАТЦТГГТАЦАГГАТГТТЦТАГЦТАЦГ-3' (SEQ ID N 1)
5. Промотор по любому из пп.1 - 4, отличающийся тем, что нативные конститутивные элементы АР1 и АР2 между основаниями - 79 и - 129 нативного промотора hMT - IIA делетированы.

6. Промотор по любому из пп.1 - 5, отличающийся тем, что по крайней мере одну последовательность ГОЭ встраивают в сайт Sac II (основание - 175) нативного промотора hMT - IIA, посредством чего нарушается конститутивный элемент АР2 в его локализации.

7. Промотор по п.6, отличающийся тем, что по крайней мере три связанные последовательности ГОЭ встраивают в сайт Sac II.

8. Промотор по любому из пп.1 - 7, отличающийся тем, что по крайней мере одну ГОЭ последовательность встраивают в сайт Xma III (основание - 129) природного промотора hMT - IIA.

9. Промотор по п.8, отличающийся тем, что две связанные ГОЭ последовательности встраивают в сайт Xma III.

10. Синтетический индуцибельный эукариотический промотор для регуляции транскрипции гена, который происходит из природного промотора MMTV - LTR, содержащего природный элемент, отвечающий на глюкокортикоиды (ГОЭ) и включающий по крайней мере один элемент, отвечающий на металлы (МОЭ), встроенный в природный промотор и обеспечивающий с нативным ГОЭ синергический уровень экспрессии гена в эукариотической системе экспрессии.

11. Промотор по п.10, отличающийся тем, что по крайней мере два связанных МОЭ встраивают в природный промотор.

12. Промотор по п.11, отличающийся тем, что множество МОЭ встраивают в природный промотор в виде самолигирующего мультимерного элемента "голова-хвост" в присутствии Bam HI и Bgl II.

13. Промотор по любому из пп.10 - 12, отличающийся тем, что указанный встроенный МОЭ является синтетической молекулой, содержащей консенсусную последовательность МОЭ и имеющей "плюс" цепь следующей нуклеотидной последовательности:
5'-ГАТЦТТГЦГЦЦЦГГЦЦЦГ-3' (SEQ ID N 2)

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6