Способ получения препарата гиалуронидазы

 

Изобретение относится к производству лекарственных средств из животного сырья. Производят измельчение семенников, экстракцию биомассы раствором уксусной кислоты, концентрирование, очистку концентрата и последующую доочистку сорбцией балластных примесей активированным углем. Очистку концентрата проводят 2-5 об. % хлороформа от объема концентрата в присутствии 0,5-1,0 моль/л хлористого натрия. Доочистку проводят активированным углем, предварительно обработанным 2-4% раствором хлористого натрия. Изобретение позволяет повысить выход и степень очистки продукта. 1 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к производству лекарственных средств, применяемых в медицинской практике, и касается получения препаратов из животного сырья.

Известен способ получения гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота (пат. RU 2054943, МПК6 A 61 K 35/48, опубл. 1996 г.), включающий измельчение семенников, экстракцию биомассы раствором уксусной кислоты, центрифугирование, ультрафильтрацию надосадочной жидкости, концентрирование, охлаждение, очистку концентрата 4-6 об.% хлороформом в присутствии 1 моль/л хлористого натрия и центрифугирование.

Такой способ не позволяет получить достаточно высокой степени очистки, вследствие чего целевой продукт обладает низкой удельной активностью, содержит значительное количество балластных белков, а в препарате присутствуют остатки хлороформа. Кроме того, недостаток способа - сложности с масштабированием процесса, возникающие при центрифугировании больших объемов субстратов.

Известен другой способ получения гиалуронидазы (пат. RU 2159284, МПК7 C 12 N 9/26, опубл. 2000 г.), включающий измельчение семенников убойных животных, экстракцию биомассы раствором уксусной кислоты, очистку концентрата замораживанием при температуре минус 5-20oС с оттаиванием, концентрирование методом ультрафильтрации и последующую доочистку сорбцией балластных примесей активированным углем.

Такой способ позволяет получить достаточно высокую степень очистки.

Однако такой способ нетехнологичен и непроизводителен, что объясняется необходимостью замораживания и последующего оттаивания концентрата. Для замораживания используется дорогостоящее энергоемкое оборудование, процесс очистки длителен и возникают сложности при масштабировании процесса, т.е. при обработке больших объемов (в условиях промышленного производства). Кроме того, в таком способе предусмотрено три стадии очистки: замораживание с последующим оттаиванием, удаление балластных примесей этакридина лактатом и доочистка активированным углем. На каждой стадии происходят потери очищаемого препарата. При замораживании теряется до 10% активности гиалуронидазы, а потери на последующих двух стадиях составляют до 20%.

Задачей предлагаемого изобретения является создание технологичного, производительного способа получения препарата гиалуронидазы, обеспечивающего высокую степень очистки и достаточно высокий выход целевого продукта.

Поставленная задача достигается за счет усовершенствования способа получения препарата гиалуронидазы, включающего измельчение семенников, экстракцию биомассы раствором уксусной кислоты, концентрирование, очистку концентрата и последующую доочистку сорбцией балластных примесей активированным углем.

Это усовершенствование заключается в том, что очистку концентрата проводят смесью 2-5 об. % хлороформа в присутствии 0,5-1,0 моль/л хлористого натрия, а доочистку проводят активированным углем, предварительно обработанным 2-4% раствором хлористого натрия.

Кроме того, предварительную обработку активированного угля можно выполнять замачиванием его в растворе хлористого натрия не менее 4 часов с последующим автоклавированием.

Проведение очистки концентрата смесью 2-5 об.% хлороформа в присутствии 0,5-1,0 моль/л хлористого натрия позволяет удалять высокомолекулярные примеси, в том числе - гемпигменты. При этом хлороформ переводит балластные белки в нерастворимое, взвешенное состояние, а добавление хлористого натрия способствует осаждению нерастворимых белков.

Концентрация хлороформа меньше 2 об.% не обеспечит требуемой степени очистки от высокомолекулярных примесей, включая гемпигменты.

Увеличение концентрация хлороформа выше 5 об.% нецелесообразно, так как приводит к повышению расхода хлороформа и загрязнению целевого продукта.

Содержание хлористого натрия в смеси меньше 0,5 моль/л не обеспечит требуемого эффекта, а больше 1,0 моль/л нецелесообразно, так как приводит к повышению расхода хлористого натрия и загрязнению целевого продукта.

Проведение доочистки активированным углем, предварительно обработанным 2-4% раствором хлористого натрия, обеспечивает удаление низкомолекулярных примесей. Предварительная обработка угля 2-4% раствором хлористого натрия повышает его способность адсорбировать низкомолекулярные примеси, что необходимо для увеличения удельной активности целевого продукта.

Выполнение предварительной обработки активированного угля замачиванием его в растворе хлористого натрия не менее 4 ч с последующим автоклавированием позволяет быстро и просто получить активированный уголь с требуемыми адсорбционными свойствами, лишенный пирогенных свойств.

Способ осуществляют следующим образом.

Семенники крупного рогатого скота очищают от оболочек и подвергают измельчению на электромясорубке. Для экстракции в полученную биомассу добавляют раствор уксусной кислоты. Экстракцию проводят в течение 62 ч при постоянном перемешивании. Гомогенат фильтруют через миткаль с целью отделения прозрачного раствора, содержащего гиалуронидазу, от ткани семенников. Полученный экстракт концентрируют ультрафильтрацией на полых волокнах (ВПУ 15) до конечного объема 1/4-1/5 от исходного. К полученному концентрату добавляют хлороформ (2-5%), смесь интенсивно перемешивают, прибавляют хлористый натрий (0,5-1,0 моль/л) и выдерживают в течение 1,0-1,5 ч, затем осадок отделяют фильтрацией через миткаль. В прозрачный фильтрат добавляют специально обработанный 2-4% раствором хлористого натрия активированный уголь марки ОУ-Б, тщательно перемешивают в течение 1 ч. Затем смесь фильтруют на нутч-фильтре через миткаль. Фильтрат собирают в мерник, определяют концентрацию натрия хлористого, при необходимости проводят диафильтрацию на полых волокнах (ВПУ-15) до конечной концентрации хлористого натрия не более 0,9%. Раствор фильтруют на трехрамном фильтре через пластины типа Zeta plus марки 60SP, затем 90SP. Полученный фильтрат подвергают стерилизующей фильтрации, разливают в ампулы по 0,5 мл из расчета 64-128 УЕ на ампулу, лиофилизируют.

Пример 1. 100 кг замороженных семенников крупного рогатого скота измельчают на электромясорубке, добавляют в фарш 150 л 0,1 н. раствора уксусной кислоты. Смесь экстрагируют в течение 4 ч. По окончании экстракции гомогенат фильтруют через миткаль. Полученный экстракт в объеме 180 л концентрируют методом ультрафильтрации до объема 45 л (1/4 от исходного). К полученному концентрату медленной струей приливают 900 мл хлороформа (2 об.%), интенсивно перемешивают. Затем к полученной смеси прибавляют хлористый натрий в количестве 1,300 кг (0,5 моль/л). Раствор выдерживают в течение 1 ч, затем фильтруют через миткаль. Осадок удаляют, а в прозрачный раствор в объеме 44,0 л добавляют предварительно подготовленный активированный уголь марки ОУ-Б в количестве 3,520 кг (из расчета 80 г/л).

Активированный уголь предварительно замачивают в 2% растворе хлорида натрия на 4 ч, затем автоклавируют при t 132oC, р=2 атм в течение 1 ч, охлаждают до 30-40oС, надосадочный слой декантируют.

Смесь раствора гиалуронидазы с углем фильтруют на нутч-фильтре через миткаль, затем на трехрамном фильтре, заправленном пластинами марки 60SP, 90SP, фильтрат собирают в мерник. В результате получают 42 л очищенной тестикулярной гиалуронидазы с активностью 170 УЕ/мл и содержанием белка 10 мг/мл, содержание хлористого натрия в растворе 0,8%. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации, разливают в ампулы по 0,5 мл. Гиалуронидазная активность лиофилизированного препарата 85 УЕ в ампуле, удельная активность 17 УЕ/мг белка.

Пример 2. 150 кг замороженных семенников крупного рогатого скота измельчают на электромясорубке, добавляют в фарш 250 л 0,1 н. раствора уксусной кислоты. Смесь экстрагируют в течение 4 ч. По окончании экстракции гомогенат фильтруют через миткаль. Полученный экстракт в объеме 350 л концентрируют методом ультрафильтрации до объема 70 л (1/5 от исходного). К полученному концентрату медленной струей приливают 3500 мл хлороформа (5 об.%), интенсивно перемешивают. Затем к полученной смеси прибавляют хлористый натрий в количестве 4,060 кг (1,0 моль/л). Раствор выдерживают в течение 1 ч, затем фильтруют через миткаль. Осадок удаляют, а в прозрачный раствор в объеме 68 л добавляют предварительно подготовленный активированный уголь марки ОУ-Б в количестве 6,8 кг (из расчета 100 г/л).

Активированный уголь предварительно замачивают в 5% растворе хлорида натрия на 4 ч, затем автоклавируют при t 132oC, р=2 атм в течение 1 ч, охлаждают до 30-40oС, надосадочный слой декантируют.

Смесь раствора гиалуронидазы с углем фильтруют на нутч-фильтре через миткаль, затем на трехрамном фильтре, заправленном пластинами марки 60SP, 90SP, фильтрат собирают в мерник. В результате получают 65 л очищенной тестикулярной гиалуронидазы с активностью 166 УЕ/мл и содержанием белка 9,2 мг/мл. Содержание хлористого натрия в растворе 1,6%, поэтому раствор подвергают диафильтрации на полых волокнах до конечной концентрации хлористого натрия не более 0,9%. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации, разливают в ампулы по 0,5 мл. Гиалуронидазная активность лиофилизированного препарата 83 УЕ в ампуле, удельная активность 18 УЕ/мг белка.

Таким образом, предлагаемое изобретение обеспечивает достаточно высокую степень очистки препарата гиалуронидазы при высоком выходе (на 10% выше, чем у прототипа) технологичным, производительным способом за счет исключения операции замораживания - оттаивания.

Формула изобретения

1. Способ получения препарата гиалуронидазы, включающий измельчение семенников, экстракцию биомассы раствором уксусной кислоты, концентрирование, очистку концентрата и последующую доочистку сорбцией балластных примесей активированным углем, отличающийся тем, что очистку концентрата проводят смесью 2-5 об.% хлороформа в присутствии 0,5 - 1,0 моль/л хлористого натрия, а доочистку проводят активированным углем, предварительно обработанным 2-4% раствором хлористого натрия.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что предварительную обработку активированного угля выполняют замачиванием его в растворе хлористого натрия не менее 4 ч с последующим автоклавированием.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине, в частности к способам получения гиалуронидазы стрептококковой бактериального происхождения, используемой при диагностике стрептококковых инфекций

Изобретение относится к производству лекарственных средств и заключается в получении препарата тестикулярной гиалуронидазы

Изобретение относится к производству лекарственных средств, применяемых в медицинской практике, и касается получения препаратов из животного сырья
Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано для гидролиза сахарозы и получения инвертного сахара

Изобретение относится к новым полипептидным соединениям общей формулы [I] где R1 - водород; ариламино(низший)алканоил, который может иметь один или несколько подходящих заместителей; ароил, замещенный гетероциклической группой, которая может иметь один или несколько подходящих заместителей; ароил, замещенный арилом, имеющим высший алкил; ароил, замещенный арилом, имеющим низший алкил; арил(С2-С6)алканоил, замещенный арилом, имеющим низший алкил; низший алканоил, замещенный ненасыщенной конденсированной гетероциклической группой, которая может иметь один или несколько подходящих заместителей; низший алканоил, замещенный пиридилом, который может иметь один или несколько подходящих заместителей; аминозащитная группа; гексилнафтоил; ароил, замещенный гетероциклилкарбамоилом, который может иметь один или несколько подходящих заместителей; низший алканоил, замещенный цикло(низшим)алкилом, который может иметь один или несколько подходящих заместителей; низший алканоил, замещенный тиенилом, имеющим гетероциклическую группу, которая может иметь один или несколько подходящих заместителей; или низший алкеноил, замещенный гетероциклической группой, которая может иметь один или несколько подходящих заместителей; R2 - водород или гидрокси; R3 - гидрокси, гидроксисульфонилокси или низший алкокси; R4 - гидрокси или низший алкокси, или их солям, обладающим противогрибковой активностью; двум способам получения соединений общей формулы I; фармацевтической композиции, обладающей противогрибковой активностью, и способу профилактического и/или терапевтического лечения инфекционных заболеваний, вызванных грибками

Изобретение относится к новым производным бензотиадиазолов, бензоксазолов и бензодиазинов формулы I в форме свободного основания или в форме фармацевтически приемлемой кислотно-аддитивной соли, которые могут быть использованы в качестве анксиолитического средства при лечении любого состояния, которое связано с повышенным эндогенным уровнем CRF или при котором нарушается регуляция НРА (система гипоталамус - гипофиз), или различных болезней, которые вызваны CRF1 или проявлению которых способствует CRF1, такие как артрит, астма, аллергия, состояние тревоги, депрессии и т.д

Изобретение относится к новым производным бензотиадиазолов, бензоксазолов и бензодиазинов формулы I в форме свободного основания или в форме фармацевтически приемлемой кислотно-аддитивной соли, которые могут быть использованы в качестве анксиолитического средства при лечении любого состояния, которое связано с повышенным эндогенным уровнем CRF или при котором нарушается регуляция НРА (система гипоталамус - гипофиз), или различных болезней, которые вызваны CRF1 или проявлению которых способствует CRF1, такие как артрит, астма, аллергия, состояние тревоги, депрессии и т.д

Изобретение относится к новым производным бензотиадиазолов, бензоксазолов и бензодиазинов формулы I в форме свободного основания или в форме фармацевтически приемлемой кислотно-аддитивной соли, которые могут быть использованы в качестве анксиолитического средства при лечении любого состояния, которое связано с повышенным эндогенным уровнем CRF или при котором нарушается регуляция НРА (система гипоталамус - гипофиз), или различных болезней, которые вызваны CRF1 или проявлению которых способствует CRF1, такие как артрит, астма, аллергия, состояние тревоги, депрессии и т.д

Изобретение относится к новым производным 2-аминопиридинов ф-лы (1), где С обозначает незамещенные или замещенные фенил, пиридил, тиенил, тиазолил, хинолил, хиноксалин-2-ил или их бензоаннелированные производные; D - незамещенные или замещенные фенил, пиридил, тиенил, пиримидил, индолил, тиазолил, имидазолил, хинолил, триазолил, оксазолил, изоксазолил или их бензоаннелированные производные при условии, что С и D не имеют одновременно следующие значения: С - фенил и D - фенил, С - фенил и D - пиридил, С - пиридил и D - фенил, С - пиридил и D - пиридил; R1 - R4 - водород, NO2 или NH2

Изобретение относится к -замещенным производным карбоновой кислоты, охарактеризованным общими формулами (I), (II), (III) и (IV) или их фармакологически приемлемым (С1-С6)-алкильным эфирам, или их фармакологически приемлемым амидам, или их фармакологически приемлемым солям

Изобретение относится к производным амида формулы I где R3 представляет собой (1-6С)алкил или галоген; m равно 0, 1, 2 или 3; R1 представляет собой гидрокси, галоген, трифторметил, нитро, амино, (1-6С)алкил, (2-6С)алкенил, (2-6С)алкинил, (1-6С)алкокси, (1-6С)алкиламино, ди-[(1-6С)алкил] амино, амино-(2-6С)алкиламино, (1-6С)алкиламино-(2-6С)алкиламино и т.д

Изобретение относится к ариламидам ацетоуксусной кислоты общей формулы где R обозначает водород или один или несколько заместителей из группы, включающей алкил, алкокси и галоген, в виде застывшего расплава с влагосодержанием в пределах от 5 до 15 мас.% в технически применимой и удобной для использования форме; способу их получения путем взаимодействия дикетена с соответствующим ароматическим амином в присутствии воды или водных смесей растворителей или в присутствии водного маточного раствора, состоящего, по меньшей мере, на 80 мас.% из воды

Изобретение относится к области медицины, а именно к препаратам интерферона, которые могут применяться для лечения вирусных и онкологических заболеваний

Изобретение относится к производству лекарственных средств из животного сырья

Наверх