Способ получения человеческого интерферона

 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам получения и очистки генно-инженерных препаратов интерферона человека. Способ, включающий в себя культивирование клеток микроорганизмов Pseudomonas putida, лизис клеток с одновременной их дезинтеграцией, обработку клеток полиэтиленимином, отделение нуклеиновых кислот, высаливание белков серно-кислым аммонием, трехстадийную хроматографию на катионгидрофобном сорбенте Солоза КГ, на анионите Сфероцелл-QAE и на гидрофобном сорбенте Сфероцелл ЛП-М, концентрирование методами ультрафильтрации и гель-фильтрацией на Сефадексе G-100. Технический результат: предлагаемая схема очистки позволяет повысить выход интерферона до 30%.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам получения и очистки генно-инженерных препаратов интерферона человека.

Известны способы получения человеческого интерферона из лейкоцитов донорской крови человека, индуцированных вирусами, двуцепочечными РНК и другими индукторами (авт. св. и пат. СССР №297296, 1970; №1366064, 1983, №1713591, 1986 - кл. С 12 N 15/00; пат. РФ №№1364343, 1984; 1709615, 1990; 2066188, 1993 - кл. C 12 N 15/00).

Недостатками этих способов являются, как правило, низкий выход продукта, невозможность масштабирования этого процесса, вероятность контаминации конечного продукта вирусами человека, такими, как вирусы гепатитов, иммунодефицита и др.

Более перспективным признан способ получения интерферона микробиологическим синтезом, который обеспечивает возможность получения целевого продукта со значительно более высоким выходом из сравнительно недорогого исходного сырья. Используемые при этом подходы позволяют создать оптимальные для бактериальной экспрессии варианты структурного гена, а также регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию.

В настоящее время в качестве исходных микроорганизмов используют в основном различные искусственно сконструированные штаммы Р. pastoris, Ps. putida и Е. coli.

Наиболее распространены процесс на основе Ps. putida и Е. coli, т.к. при использовании штаммов Р.Pastoris (J.N.Garcia, J.A.Aguiar et. al. High level expression of human IFN-2b in Pichia pastoris. Biotecnologia Aplicada. 12(3), р.152-155, 1995), отмечается низкий уровень выхода целевого продукта на грамм биомассы.

При использовании технологии получения интерферона на основе штаммов Е. coli: (пат. УР №13380, 1997, C 12 N 15/21, Кравченко В.В. и др. Биоорганическая химия. 1987, т.13, №9, с.1186-1193) отмечается нестабильность выхода и недостаточный уровень экспрессии интерферона.

Использование штаммов Ps. putida более перспективно, т.к. позволяет получить достаточно высокий выход интерферона, однако для них характерна сложность выделения конечного продукта, что приводит к большой трудоемкости процесса и высокой себестоимости конечного продукта.

В частности, известен способ получения интерферона на основе биомассы бактериального продуцента Pseudomonas putida 84, содержащего рекомбинантную плазмиду p VG-3, включающий в себя разрушение бактериальных клеток в лизатном буфере при рН 6,7-8,2 и температуре 3-5°С, удаление нуклеиновых кислот обработкой лизата полиэтиленимином с последующим осаждением белков серно-кислым аммонием и очисткой конечного продукта последовательно гидрофобной на фенилсилохроме С-80 и иммуноаффинной хроматографией с использованием моноклональных антител 5А6.

Недостатком способа является невозможность его осуществления в промышленных масштабах в связи с высокой себестоимостью и нестабильностью иммуноаффинных сорбентов.

Наиболее близким к заявляемому решению по технической сущности является усовершенствованный способ получения интерферона из биомассы бактериального продуцента Pseudomonas putida 84, который включает в себя лизис бактериальных клеток, удаление нуклеиновых кислот обработкой лизата полиэтиленимином, с последующим осаждением белков сернокислым аммонием, фракционированием нерастворимых белков гидрофобной хроматографией на фенилсилохроме С-80, рН-фракционирование белков ортофосфорной кислотой, концентрирование и диафильтрация раствора белков, хроматографию на анионите-целлюлозе DE-52 с использованием для элюирования 0,04-0.06 М ацетатного буфера при рН 4,8-5,2, а затем на катионите - целлюлозе СМ-52 с элюированием линейным градиентом 0,1 М ацетатного буфера и 0,1 М ацетатного буфера с 0,3-0,5 М хлористого натрия при рН 4,8-5,2, концентрирование лизата с помощью фильтров типа PTGC с пределом 1000 дальтон и гель-фильтрацией на сефадексе G-100, уравновешенном 0,05-0,15 М фосфатным буфером с 0,15-0,25 М натрия хлористого при рН 7,15-7,25. (Пат. СССР №1640996, 1989, кл. C 12 N 15/00).

Недостатком способа является низкий выход интерферона (12-13%) за счет больших потерь целевого продукта на стадии очистки.

Задачей, стоявшей перед авторами, являлось создание более селективной системы очистки интерферона.

Указанная задача решалась путем того, что лизис клеток осуществляют одновременно с их баллистической дезинтеграцией, а хроматографию проводят на катионгидрофобном сорбенте Солоза КГ при рН 7,0-7,2 с элюцией интерферона 0,05 М раствором трис-буферного раствора с рН 10,1- 10,3; очистку на второй стадии хроматографии проводят на анионите Сфероцелл-QAE с промывкой колонки 0.05М трис-ацетатным буферным раствором при рН 8,0 и отмывкой примесных белков 0,05М трис-ацетатным буферным раствором с добавлением 0,05 М NaCI, осуществляя элюцию интерферона 0,1 М натрий-ацетатным буферным раствором при рН 5,0. а на третьей стадии хроматографии очистку проводят на гидрофобном сорбенте - Сфероцелл ЛП-М с элюированием интерферона линейным градиентом концентрации хлористого натрия.

Оптимально проводить на третьей стадии хроматографии промывку колонки 0.05 М натрий-ацетатным буферным раствором при рН 5,0. Однако возможно применение и иных буферных растворов с рН около 5,0, например 0,05 М натрий-фосфатного буферного раствора или 0,05 М аммоний-цитратного буферного раствора.

Для хроматографии использовались разработанные в ГосНИИ ОЧБ следующие промышленные сорбенты: Солоза КГ - сополимер метакриловой кислоты, ее бутилового эфира и метилен-диакриламида; Сфероцелл-QAE - целлюлоза, сшитая эпихлоргидрином и модифицированная пришивкой диэтиламиноэтильных функциональных групп; Сфероцелл-ЛП-М - макропористая целлюлоза, модифицированная оксиглицидиловым эфиром.

В результате совмещения лизиса и дезинтеграции клеток удается добиться не только более полного выхода интерферона из клеток, но одновременно исключить его связь с остатками клеточных стенок и ряда иных примесей, что позволило в результате на первой стадии хроматографии использовать более эффективный катионгидрофобный сорбент, что в свою очередь обеспечило повышенную очистку интерферона от примесных белков и оптимизировало протекание последующих стадий очистки интерферона, в частности возможность использования на третьей стадии гидрофобный сорбент и более высокий выход последнего в ходе процесса получения.

Сущность патентуемого процесса иллюстрируется следующим примером.

1. Пример. 600 г биомассы клеток Pseudomonas putida 84,содержавших рекомбинантную плазмиду p VG-3, после культивирования содержали 130 мг альфа-2 интерферона. Клетки загружали в емкость баллистического дезинтегратора с механической мешалкой вместимостью 5,0 л и приливали к ней 3,0 л лизисного буфера, содержащего 1,2% хлористого натрия, 1,2% трис-(гидроксиметил)-аминометана, 10% сахарозы, 0,15% этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 0,02% фенилметилсульфонилфторида и 0,01% дитиотреитола при рН 7,7. Биомассу перемешивали до получения однородной суспензии в течение 30 мин, затем дезинтегрировали в циркуляционном режиме в баллистическом дезинтеграторе в соответствии с инструкцией по эксплуатации. Время дезинтеграции составляло 1,5 ч. Процесс дезинтеграции заканчивали, когда при микроскопировании препарата в нескольких полях зрения микроскопа практически не наблюдается целых клеток микроорганизмов. Объем суспензии лизированной биомассы составил 3,5 л.

Полученный на данной стадии лизат затем поступал на стадию осаждения нуклеиновых кислот. Для этого в емкость, содержащую лизат при перемешивании со скоростью 1-1,2 л/ч подавали 180 мл 5% раствора полиэтиленимина. Суспензию перемешивали в течение 1 ч и центрифугировали для отделения осадка нуклеиновых кислот 1 ч при (9500±500) об/мин, при температуре (5±2)°С. После центрифугирования отделяли супернатант, объем которого составлял 3,0 л.

При медленном перемешивании мешалкой в супернатант всыпали 182 г сухого сульфата аммония малыми порциями (каждую следующую порцию добавляли после полного растворения предыдущей). После окончания внесения сульфата аммония перемешивание продолжали до полного растворения соли и суспензию осадка белков выдерживали при температуре (5±2)°С 16 ч, а затем центрифугировали в течение 1 ч при (13500±500) об/мин при температуре (5±2)°С.

Полученный осадок растворяли в дистиллированной воде, доводя общий объем до 4 л. Для осаждения сопутствующих белков проводили кислотное фракционирование полученного раствора, содержащего альфа-2 интерферон. Для этого в раствор добавляли 5,0 мл 50%-ной уксусной кислоты до рН 4,75. Полученную смесь переносили в холодильник и оставляли при температуре (5±2)°С в течение 3 ч, затем центрифугировали суспензию белков при (13500±500) об/мин 30 мин при (5±2)°С.

К 4 л супернатанта добавляли 50,0 мл 1 М раствора Триса до рН (6,9±0,1). Концентрация общего белка, определенная методом Лоури, составляла 9,0 мг/мл, биологическая активность альфа-2 интерферона (6,8±0,5)×10⁶ МЕ/мл. Удельная активность 8,5×10⁵ МЕ/мг. Общее содержание альфа-2 интерферона на данной стадии 2,9×10¹⁰ ME.

Сорбент Солоза КГ в количестве 0,6 л в виде водной взвеси помещали в хроматографическую колонку. Затем с помощью перистальтического насоса через сорбент последовательно пропускали 2,0 л 0,2 М раствора гидроокиси натрия, 6,0 л дистиллированной воды и 4,5 л 0,05 М трис-ацетатного буферного раствора при рН (7,1±0,1), который на выходе из колонки контролировали рН-метром.

Раствор белков, содержащий альфа-2 интерферон, разбавляли дистиллированной водой до проводимости (6,0+2,0) мСм/см при комнатной температуре. Объем раствора при этом составил 19,2 л.

Раствор наносили на колонку со скоростью 1,5 л/час, затем промывали сорбент 2,0 л трис-ацетатного буфера 0,05 М при рН 7,0. Элюцию проводили 1,2 л 0,05 М раствором Триса с рН (10,2±0,1) Содержание интерферона во фракциях, собранных с помощью коллектора фракций, определяли иммуноферментным методом.

Концентрация общего белка, определенная методом Лоури, составляет (2,2±0,2) мг/мл, биологическая активность альфа-2 интерферона (2,1±0,5)×10⁷ МЕ/мл, удельная активность препарата (9,7±0,5)×10⁶ МЕ/мг. Общее содержание альфа-2 интерферона на данной стадии составляет (1,5±0,5)×10¹⁰ ME.

Сорбент Сфероцелл qae в количестве 0,15 л в виде водной суспензии загружали в колонку и промывали со скоростью 0,15 л/ч последовательно 0,5 л 2 М раствора хлористого натрия, 1,5 л дистиллированной воды и 1,0 л трис-ацетатного буферного раствора 0,05 М с рН 8,0, контролируя рН буферного раствора на выходе из колонки рН-метром.

Раствор белков объемом 0,7 л, содержащий альфа-2 интерферон наносили на колонку с сорбентом Сфероцелл-QAE объемом 0,15 л со скоростью 0,2 л/час. Промывку колонки осуществляли трис-ацетатным 0,05 М буферным раствором (рН 8,0) объемом 0,1 л, затем примесные белки отмывали 1,0 л того же буферного раствора с добавлением 0,05 М NaCI. Элюцию интерферона проводили 0,8 л 0,1 М натрий-ацетатным буферным раствором при рН 5,0. Содержание альфа-2 интерферона во фракциях, собранных с помощью коллектора определяли иммуноферментным методом. Концентрация белка составляла (0,35±0,05) мг/мл, биологическая активность альфа-2 интерферона (1,7±0,2)×10⁷ МЕ/мл. Удельная активность препарата 5,5×10⁷ МЕ/мг белка. Элюат содержал 1,20х10¹⁰ ME. Выход по биологической активности на данной стадии 82,5%.

Полученный раствор доводили до рН (5,0±0,1) 50% уксусной кислотой и разбавляли 0,05 М натрий-ацетатным буферным раствором. Удельная электропроводность составила (0,29±0,02) мСм/см при температуре (5±2)°С. Подготовленный таким образом раствор белка наносили на колонку с сорбентом Сфероцелл ЛП-М со скоростью 0,1 л/ч, промывали 0,3 л вышеуказанного буферного раствора, а затем элюировали интерферон с помощью линейного градиента концентрации хлористого натрия, создаваемой с помощью градиентного смесителя Ультроград Элюат фракционировали с помощью коллектора фракций и измеряли концентрацию общего белка и альфа-2 интерферона. Концентрация белка в объединенных фракциях (0,45±0,02) мг/мл. Объем раствора 0,1 л. Общее содержание альфа-2 интерферона (8,6±0,2)×10⁹ ME. Удельная активность - е (7,5±0,2)×10⁷ МЕ/мг. Выход на данной стадии 73%.

Полученный 3 раствор объемом 0,1 л концентрировали до (5,0±0,2) мл с помощью ячейки для ультрафильтрации, используя мембрану Amicon YM-3. Подготовленный таким образом образец наносили на колонку с сорбентом Сефадекс G-100, уравновешенную фосфатно-солевым буфером со скоростью 0,025 л/ч. Объем фракций составляет 10,0 мл. Полученные после хроматографии фракции проверяли на содержание альфа-2 интерферона иммуноферментным методом и объединяя фракции, содержащие основной пик альфа-2 интерферона. Объем полученного раствора составил 30,2 мл. Концентрация общего белка, определенная методом Лоури, (0,90±0,02) мг/мл. Общее содержание альфа-2 интерферона в растворе 5,5×10⁹ ME. Удельная активность полученного препарата альфа-2 интерферона 2,3×10⁸ МЕ/мг. Выход по альфа-2 интерферону на данной стадии составляет 90,2%. Полученный продукт стерилизовали и расфасовывали. Общий выход препарата 35,8%, в том числе на стадии очистки 51%.

Формула изобретения

Способ получения человеческого интерферона, включающий в себя культивирование клеток микроорганизмов Pseudomonas putida, лизис клеток буферным раствором, обработку клеток полиэтиленимином, отделение нуклеиновых кислот, высаливание белков серно-кислым аммонием, трехстадийную хроматографию, включающую очистку целевого продукта на гидрофобном сорбенте и анионите, концентрирование методами ультрафильтрации и гель-фильтрацию на Сефадексе G-100, отличающийся тем, что лизис клеток осуществляют одновременно с их баллистической дезинтеграцией, а на первой стадии хроматографии очистку проводят на катионгидрофобном сорбенте Солоза КГ при рН 7,0-7,2, с элюцией интерферона 0,05 М трис- буферным раствором с рН 10,1-10,3; вторую стадию хроматографии проводят на анионите Сфероцелл-QAE с промывкой колонки 0,05М трис-ацетатным буферным раствором при рН 8,0 и отмывкой примесных белков 0,05М трис-ацетатным буферным раствором, содержащим дополнительно 0,05 М NaCl, осуществляя элюцию интерферона 0,1 М натрий-ацетатным буферным раствором при рН 5,0; третью стадию хроматографии осуществляют на гидрофобном сорбенте Сфероцелл ЛП-М с элюированием интерферона линейным градиентом концентрации хлористого натрия.

NF4A Восстановление действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Дата, с которой действие патента восстановлено: 10.07.2007

Извещение опубликовано: 10.07.2007        БИ: 19/2007