Способ получения трансгенных растений сорго

 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности может быть использовано в селекции сорго для создания новых сортов и гибридов. Проводят опыление цветущих метелок сорго, лишенных собственной фертильной пыльцы. До начала завязывания семян на рыльца цветков наносят суспензию клеток Agrobacterium tumefaciens при температурных условиях, способствующих завязыванию семян и сохранению функциональной активности vir-генов. Проводят отбор трансгенных растений среди проростков, выросших из семян, завязавшихся на обработанных метелках. Изобретение позволяет получать трансгенные растения, минуя систему культуры in vitro, что существенно снижает производственные и временные затраты. 1табл., 1 ил.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии и может быть использовано в селекции сорго при создании новых сортов и гибридов с помощью генной инженерии, в работах по инсерционному мутагенезу, выделению и клонированию генов сорго.

Известен способ получения трансгенных растений сорго с помощью баллистической трансформации (Casas A.M., Kononovich A.K., Zehr U.B. et al. Trans genie sorghum plants via microprojectile bombardment // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, v. 90, pp. 11212-11216), по которому незрелые зародыши культивируют в течение 24-72 часов на питательной среде, содержащей минеральные соли по Мурасиге и Скугу (MS), витамины по прописи среды В5, L-аспарагин (150 мг/л), сахарозу (30 г/л), кокосовую воду (20 мл/л); 2,4-D (1.5 мг/л) и агар, после чего их подвергают бомбардировке микрочастицами золота или платины с нанесенными на них плазмидными молекулами ДНК, переносят на полужидкую среду исходного состава и культивируют в течение 2 недель. Полученный эмбриогенный каллус пересаживают на среду для субкультивирования, отличающуюся от исходной среды добавкой кинетина (0.5 мг/л), содержащую селективный агент биалофос (3 мг/л). Отбирают устойчивый к селективному агенту эмбриогенный каллус и культивируют его на этой среде в течение 3 месяцев с регулярными пересадками через каждые 2 недели. Затем эмбриогенный каллус пересаживают на среду для регенерации, отличающуюся от среды для субкультивирования заменой 2,4-D на ИУК (1.0 мг/л) и сниженной до 20 г/л концентрацией сахарозы, содержащую биалофос (3 мг/л), и культивируют 2-3 месяца. Затем регенерированные побеги пересаживают на среду для укоренения, отличающуюся от последней сниженной концентрацией минеральных солей (1/2 MS) и биалофоса (1 мг/л), отсутствием кинетина, L-аспарагина и витаминов, но с добавкой НУК (0.5 мг/л). Полученные растения переносят в почву, проверяют на устойчивость к биалофосу и с помощью молекулярно-генетических методов подтверждают наличие встройки плазмидной ДНК.

Недостатками данного способа (аналога) являются значительная дороговизна оборудования, используемого для введения чужеродной ДНК в клетки сорго, низкая частота стабильной трансформации (0.3% зародышей, подвергшихся бомбардировке, дали устойчивый к биалофосу каллус; из 8 испытанных сортов только у одного были регенерированы устойчивые растения), а также длительный и трудоемкий процесс получения трансгенных растений. Кроме того, применение метода баллистической трансформации может привести к попаданию нескольких копий генов в одну клетку, либо вызвать разрыв генетической конструкции, используемой в опыте, что может затруднить экспрессию вводимых генов и/или отбор трансформированных клеток.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения трансгенных растений сорго на основе агробактериальной трансформации незрелых зародышей сорго в культуре in vitro (Zhao Z.Y., Cat Т., Tagliani L. et al. Agrobacterium-mediated sorghum transformation // Plant Mol. Biol., 2000, v.44, pp. 789-798), в соответствии с которым незрелые зародыши сорго помещают на 5 мин в суспензию клеток Agrobacterium tumefaciens (плотность 0.5-1.0×10⁹ кл/мл) в среде для инокуляции, содержащей минеральные соли и витамины по MS, гидролизат казеина (1.0 г/л), 2,4-D (1.5 мг/л), глюкозу (36 г/л), сахарозу (68.5 г/л) с добавкой ацетосирингона (100 μМ) для активации vir-генов, после чего их переносят на 3 дня на среду для сокультивирования, отличающуюся от исходной увеличенной до 2.0 мг/л концентрацией 2,4-D, сниженными до 20 и 10 г/л соответственно концентрациями сахарозы и глюкозы, добавкой L-пролина (0.7 г/л), аскорбиновой кислоты (10 мг/л), MES (0.5 г/л) и агара (8 г/л). Затем зародыши переносят на 4 дня на среду без ацетосирингона, но с добавкой антибиотика карбенициллина (100 мг/л) для подавления роста агробактерий. Затем для индукции эмбриогенного каллуса зародыши переносят на среду, отличающуюся от предыдущей отсутствием глюкозы и сниженной концентрацией 2,4-D (до 1.5 мг/л) и добавкой селективного агента фосфинотрицина (5 мг/л), ген устойчивости к которому (bar) присутствовал в Т-ДНК использованного агробактериального штамма, и культивируют в течение 2 недель. Переносят выживший (устойчивый) каллус на среду того же состава с повышенным уровнем фосфинотрицина (10 мг/л) и пересаживают каждые 2 недели. Для развития эмбриоидов каллус пересаживают на среду, отличающуюся от предыдущей добавкой кинетина (0.5 мг/л) и затем - на среду для побегообразования, отличающуюся от предыдущей отсутствием 2,4-D, увеличенной до 60 г/л концентрацией сахарозы, заменой кинетина на зеатин (0.5 мг/л), добавкой ИУК (1 мг/л), АБК (0.1 μМ) и тидиазурона (0.1 мг/л). Побеги переносят на среду для укоренения - 1/2 MS, НУК (0.5 мг/л), ИБК (0.5 мг/л), сахароза (20 г/л), агар (7 г/л), а затем - на среду того же состава, но без НУК и ИБК. У полученных растений с помощью методов молекулярной генетики анализируют наличие в их геноме встройки фрагмента чужеродной ДНК (Т-ДНК агробактерии).

Данный способ (прототип) позволяет достигать частоты стабильной трансформации до 10.1% в расчете на количество инокулированных зародышей.

Недостатками данного способа (прототипа) является высокая трудоемкость, сложность и длительность процесса получения трансгенных растений. Кроме того, использование системы культуры in vitro, во-первых, может привести к получению сомаклональных вариантов среди растений-трансформантов, во-вторых, ограничивает применение данного способа, поскольку не все образцы сорго (селекционно-ценные линии и гибриды) дают хорошо растущий эмбриогенный каллус с высокой регенерационной способностью, либо же их экспланты, продуцирующие эмбриогенный каллус, некротизируют в результате сокультивирования с агробактериальными клетками.

Цель предлагаемого изобретения - повышение частоты при упрощении и сокращении длительности и трудоемкости процесса получения трансгенных растений сорго.

Поставленная цель достигается тем, что, по предлагаемому способу получения трансгенных растений сорго, включающему обработку сорго суспензией клеток Agrobacterium tumefaciens с активированными vir-генами и отбор трансгенных растений, для получения трансгенных растений используют цветущие метелки сорго, лишенные собственной фертильной пыльцы, которые опыляют пыльцой фертильных растений сорго и до начала завязывания семян на рыльца цветков наносят суспензию клеток Agrobacterium tumefaciens, причем процесс трансформации осуществляют в температурных условиях, способствующих завязыванию семян при сохранении функциональной активности vir-генов, при этом трансгенные растения отбирают среди проростков, выросших из семян, завязавшихся на этих метелках.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется чертежом, на котором показаны результаты анализа ДНК некоторых канамицин-устойчивых растений сорго, полученных с использованием предлагаемого изобретения, с помощью метода ПЦР (полимеразной цепной реакции), где 1 - маркер молекулярной массы фрагментов ДНК; 2, 6-8, 10-12 - ДНК трансгенных растений, несущих маркерный ген nptII: 2 - из опыта с использованием плазмиды pAS47, 6-8 - из опыта с использованием плазмиды pTd33 в 2000 г., 10-12 с использованием pTd33 в 2001 г.; 3-5, 9 - ДНК растений, проявивших устойчивость к канамицину, но не являющихся трансгенными; 13 - ДНК растений исходной линии сорго (А2 КВВ-181); 14 - дорожка без ДНК; 15 - ген nptII. На дорожках 2, 6-8, 10-12 отчетливо виден фрагмент ДНК размером 250 п.н., присутствующий на дорожке 15.

Предлагаемый способ получения трансгенных растений сорго осуществляют следующим образом.

Метелки растений сорго изолируют пергаментными изоляторами до начала цветения. Мужски-стерильные растения (несущие мутации цитоплазматической или генной мужской стерильности) используют без кастрации; мужски-фертильные растения перед изоляцией кастрируют. На выброшенные рыльца неопыленных метелок наносят пыльцу фертильных аналогов или растений той же линии. Затем, до начала завязывания семян, например, через 4-7 часов после опыления, на рыльца цветков наносят суспензию клеток штамма Agrobacterium tumefaciens, несущего генетическую конструкцию с функциональными и маркерными генами, подлежащую введению в геном сорго. Используют суспензию в экспоненциальной фазе роста с плотностью клеток, например, 1×10⁶-1×10⁹ кл/мл. В клетках суспензии активируют vir-гены, для чего в суспензию добавляют, например, аце-тосирингон, например, в концентрации 20-200 μM. Нанесение агробактериальной суспензии проводят в температурных условиях, способствующих завязыванию семян при сохранении функциональной активности vir-генов, например, при температуре воздуха 23-25°С. С обработанных растений собирают семена, проращивают их и отбирают проростки, содержащие генетическую конструкцию, подлежащую введению в геном сорго, несущую функциональные и маркерные гены. У таких проростков берут фрагмент ткани, например лист, и с помощью метода ПЦР (полимеразной цепной реакции) проверяют наличие последовательности ДНК функционального или маркерного гена, подлежащего введению в растения сорго. Отбирают проростки, несущие последовательность ДНК данного гена (ПЦР+ проростки), которые являются трансгенными растениями.

Пример конкретного осуществления предлагаемого способа получения трансгенных растений сорго.

Для осуществления предлагаемого способа использовали растения стабильной ЦМС-линии сорго [Sorghum bicolor (L.) Moench] A2 KBB-181, которые выращивали в теплице НИИСХ Юго-Востока (г. Саратов) в 2000-2001 г.г. В качестве доноров пыльцы использовали растения фертильного аналога линии KBB-181, которые выращивали в соседних сосудах.

Трансгеноз осуществляли с помощью Agrobacterium tumefaciens, при этом использовали штаммы GV3101 и LBA4404, которые несли плазмиды соответственно pTd33 и pAS47. В обеих плазмидах присутствовал селективный маркерный ген nptII, обусловливавший устойчивость к канамицину. Суспензию клеток использованных агробактериальных штаммов выращивали на качалке на питательной среде Лурия-Бертани (LB) до плотности 1×10⁶ кл/мл при температуре 28°С. По достижении необходимой плотности в суспензию добавляли ацетосирингон (200 μМ).

До начала цветения метелки сорго тщательно изолировали пергаментными изоляторами. После выбрасывания цветочных рылец метелки опыляли пыльцой фертильного аналога и через 4-7 часов после цветения на рыльца кисточкой наносили суспензию агробактериальных клеток. Нанесение агробактериальной суспензии осуществляли при 23-25°С.

Для выявления трансгенных растений семена, собранные с метелок, обработанных агробактериальной суспензией, и необработанных (контрольных) метелок растений исходной линии, стерилизовали 5%-ным раствором хлорамина (15 мин), интенсивно промывали в проточной воде, замачивали в дистиллированной воде (24 час), повторно стерилизовали в ламинар-боксе 5%-ным раствором хлорамина и без промывки сажали на агаровую среду (1/2 MS), содержащую канамицин (200 мг/л), и выращивали на свету (фотопериод 16 ч/8 ч) (I способ отбора трансгенных растений). По другому способу отбора трансгенных растений зерновки, собранные с обработанных и необработанных метелок, раскалывали пополам; сколы с зародышами стерилизовали согласно вышеописанному способу, замачивали в растворе канамицина (200 мг/л) и после повторной стерилизации в ламинар-боксе без промывки сажали на агаровую среду (1/2 MS), не содержащую канамицина (II способ отбора трансгенных растений). Выявляли устойчивые к канамицину зеленые проростки, пересаживали их в вегетационные сосуды и выращивали в теплице.

Подтверждение трансгенной природы полученных зеленых растений проводили с помощью метода ПЦР. При этом из листьев отобранных растений выделяли ДНК согласно общепринятым методам (Маниатис Т., Фриш. К., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Лабораторное руководство. М.: Мир, 1984. - 453 с.). Реакцию ПЦР проводили с олигонуклеотидными праймерами, специфичными к фрагменту гена nptII размером 250 п.н.: ACAGACAATCGGCTGCTCTGATG и GGCAGGAGCAAGGTGAGATGACA. Циклы выполнялись по схеме: 94°С - 30 с, 60°С - 30 с, 72°С - 1 мин; общее количество циклов 40. Продукты реакции разделяли электрофорезом в агарозном геле. В качестве контроля использовали ген nptII, который несла плазмида pTd33. Для проверки соответствия амплифицированного участка гену nptII проводили рестриктный анализ продуктов реакции с помощью рестриктазы PstI, имевшей рестриктный сайт внутри данного участка гена и разрезавшей его на два фрагмента длиной 100 и 150 п.н.

На метелках линии А2 КВВ-181, выращенных в 2000 г., опыленных пыльцой фертильного аналога и обработанных через 6 ч после опыления суспензией клеток агробактериального штамма GV3101 (pTd33), наблюдали хорошую завязываемость семян (80-100%). Потомство, выросшее из этих семян, обладало значительно более высокой устойчивостью к канамицину по сравнению с контролем (исходной линией А2 КВВ-181). Так, в контроле до 100% проростков погибало на стадии развертывания второго листа, тогда как среди проростков, выросших из семян с обработанных метелок, 11-44% оставались зелеными на этой стадии развития (см. табл.). Большинство этих проростков, однако, погибало на последующих стадиях развития, особенно при пересадке в почву. Тем не менее, четыре растения удалось дорастить до взрослого состояния. Результат анализа ДНК показал, что в трех из них присутствует последовательность, соответствующая по своим размерам и сайту рестрикции гену nptII, но отсутствующая у контрольных растений исходной линии (А2 КВВ-181) (см. чертеж). В расчете на число проросших зерновок частота полученных из них взрослых генетически трансформированных растений составила 1.4-2.2%.

При проведении аналогичных экспериментов на этой же линии сорго при выращивании ее в 2001 г. наблюдали значительно более низкий уровень завязываемости семян, нежели в 2000 г. Тем не менее, все зерновки, завязавшиеся на двух метелках, обработанных штаммом A. tumefaciens GV3101 (pTd33), несли только трансгенные проростки, обладавшие нормальной жизнеспособностью (см. табл.). В результате частота генетической трансформации составила 100%. В потомстве одной из двух метелок, обработанных штаммом LBA4404 (pAS47), также присутствовало трансгенное растение (частота трансформации 10%).

Необходимо отметить, что согласно предлагаемому способу нанесение агробактериальной суспензии необходимо проводить именно в течение интервала времени между опылением и началом завязывания семян, в процессе которого происходит рост пыльцевых трубок, их проникновение в зародышевый мешок и оплодотворение. При одновременном опылении и нанесении агробактериальной суспензии завязываемость семян полностью отсутствовала, что делало невозможным получение трансгенных растений по предлагаемому способу. Нанесение суспензии после начала завязывания семян нецелесообразно, так как к этому моменту начинается дегенерация пыльцевой трубки, являющейся, по-видимому, вектором для переноса генетической информации от агробактерии (Т-ДНК) в формирующийся зародыш; кроме того, при генетической трансформации на ранних стадиях эмбриогенеза возрастает вероятность возникновения химерного зародыша, содержащего генетически трансформированные и нетрансформированные клетки.

Необходимо отметить, что согласно предлагаемому способу генетическую трансформацию необходимо осуществлять при температурных условиях, способствующих одновременно как завязыванию семян (росту пыльцевых трубок, двойному оплодотворению), так и агробактериальной трансформации (переносу Т-ДНК, для которого необходимо функционирование vir-генов), поскольку температурный фактор является важнейшим в данных процессах. У теплолюбивой культуры сорго оптимальный температурный интервал для опыления, роста пыльцевых трубок и оплодотворения лежит в диапазоне 25-30°С. В то же время для агробактериальной трансформации температура выше 25°С является критической, и оптимальный интервал этого процесса лежит в диапазоне 22-25°С (Salas M.G., Park S.H., Srivatanakul M., Smith R.H. Temperature influence on stable integration of T-DNA in plant cell // Plant Cell Repts.. 2001. V.20. P. 701-705). В этой связи при использовании данного способа процесс генетической трансформации необходимо проводить в температурном диапазоне, не превышающем 25°С, но максимально приближенном к этой точке.

Таким образом, предлагаемый нами способ позволяет с высокой частотой получать трансгенные растения сорго. При этом выход таких растений может достигать 100%, что на порядок превышает частоту выхода трансгенных растений в прототипе. Предлагаемый способ позволяет получать трансгенные растения при использовании разных агробактериальных штаммов, несущих разные генетические конструкции. Кроме того, необходимо отметить значительно меньшую трудоемкость, простоту и дешевизну предлагаемого нами способа, в сравнении с прототипом, предусматривающим использование серии из шести питательных сред для получения каллусных культур и последующей регенерации растений, среди которых только некоторые оказываются трансгенными, а также в сравнении с аналогом, в котором для получения трансгенных растений необходимо использовать дорогостоящее оборудование для баллистической трансформации. Для получения и отбора трансгенных растений по предлагаемому способу требуется 1-2 месяца (период, необходимый для формирования семян и их проращивания), тогда как по прототипу 5-6 месяцев (получение каллуса, отбор трансформированных клеточных линий, регенерация из них растений и их повторный отбор). Предлагаемый способ позволяет получать трансгенные растения, минуя систему культуры in vitro, и, следовательно, (1) не несет угрозы возникновения сомаклональной изменчивости; (2) позволяет избежать химерности трансформантов, проистекающей из-за развития их из многоклеточных меристем, содержащих как генетически трансформированные, так и нетрансформированные клетки; (3) его использование не ограничено генотипами, способными к образованию хорошо растущего эмбриогенного каллуса. Предлагаемый способ может быть использован для получения трансгенных растений не только у ЦМС-линий, но и у фертильных линий сорго после их предварительной кастрации, поскольку зарегистрированные нами частоты выхода трансгенных растений позволяют использовать даже ручную кастрацию для его осуществления.

Формула изобретения

Способ получения трансгенных растений сорго, включающий обработку сорго суспензией клеток Agrobacterium tumefaciens с активированными vir-генами и отбор трансгенных растений, отличающийся тем, что в качестве объекта генетической трансформации используют цветущие метелки сорго, лишенные собственной фертильной пыльцы, которые опыляют пыльцой фертильных растений и до начала завязывания семян на рыльца цветков наносят суспензию клеток Agrobacterium tumefaciens, причем процесс трансформации осуществляют в температурных условиях, способствующих завязыванию семян при сохранении функциональной активности vir-генов, при этом трансгенные растения отбирают среди проростков, выросших из семян, завязавшихся на этих метелках.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2