Штамм bifidobacterium bifidum 791-ин, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, заквасок, кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств
Владельцы патента RU 2260042:
Государственное учреждение "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)
Изобретение относится к биотехнологии, пищевой и медицинской промышленности и может быть использовано в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств. Штамм Bifidobacterium bifidum 791-ИН получен путем селекции без использования методов генетической модификации штамма Bifidobacterium bifidum 791 и отличается от прототипа способностью утилизировать инулин и целлобиозу. Депонирован в ГКНМ ГУ "МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского МЗ РФ" под №162. Штамм высокотехнологичен, накапливает биомассу на субстратах растительного происхождения и искусственных питательных средах в короткие сроки с высокой концентрацией бифидобактерий, обладает кислотообразующими и антагонистическими свойствами в отношении патогенной и гнилостной микрофлоры. Использование его в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, гигиенических и косметических средств, обеспечивает пробиотический эффект и нормализацию микробиоценозов организма человека, в т.ч. желудочно-кишечного и мочеполового трактов, кожных и слизистых покровов, а также расширение арсенала аналогичных средств. 2 табл.
Изобретение относится к биотехнологии, пищевой и медицинской промышленности и может быть использовано в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.
Известен штамм Bifidobacterium bifidum 791, который является наиболее близким аналогом к заявляемому штамму.
Данный штамм выделен из кишечника здорового грудного ребенка, депонирован в ЦМПМ «ВНИИгенетика» под №3300 и характеризуется следующими признаками.
1. Культурально-морфологические признаки.
Грамположительные палочковидные клетки с раздвоениями на концах, неподвижные, в мазке образуют скопления в виде китайских иероглифов.
В жидких питательных средах (печеночной, гидролизатно-молочной, казеиново-дрожжевой) с добавлением 0,75-1% агара растут по всему объему, кроме зоны аэробиоза, накапливая биомассу к 20-24 часам. Отдельные колонии имеют форму «комет».
2. Физиолого-биохимические признаки.
Облигатный анаэроб. Ферментирует лактозу с образованием уксусной и молочной кислот. Не ферментирует арабинозу, ксилозу, маннозу, целлобиозу, инулин, маннит, сорбит, салицин.
Сквашивает молоко к 16-18 часам с образованием сгустка нежной консистенции, рН 4,3-4,5.
Кислотообразующая активность: на печеночной среде: к 24 ч - 80-90°Т, к 72 - 90-100°Т; на ГМ-среде: до 100°Т и 200°Т соответственно.
3. Антагонистические свойства.
Штамм проявляет в отношении шигелл Зонне, Флекснера, энтеропатогенных кишечных палочек, стафилококков.
Недостатком указанного штамма является то, что из углеводов он может усваивать только лактозу. Вследствие этого при попадании в организм человека недостаточны его жизнеспособность, устойчивость и колонизирующая активность при прохождении пищеварительного тракта.
Известен штамм Bifidobacterium bifidum 791 БАГ, используемый для получения жидкого концентрата бифидобактерий, кисломолочных лечебно-диетических продуктов и биологически активных добавок (Патент РФ 2165454 от 2001.04.20).
Задачей предлагаемого изобретения является получение штамма Bifidobacterium bifidum 791-ИН, который обеспечивает утилизацию более широкого спектра углеводов, обладает более высокой биологической активностью и устойчивостью к внешним воздействиям, вследствие чего более технологичен: накапливает биомассу на питательных субстратах из натурального растительного сырья и искусственных питательных средах и сквашивает молоко в более короткие сроки и с большим выходом активной биомассы.
Для получения штамма Bifidobacterium bifidum 791-ИН была проведена селекция штамма Bifidobacterium bifidum 791. Селекция проводилась без использования методов генетической модификации посредством многократных пассажей через синтетическую питательную среду следующего состава:
на 1 литр дистиллированной воды:
| Эпидермат-0 | 10 г |
| инулин | 10 г |
| Цистеин | 0,5 г |
| Натрий хлористый | 2,5 г |
| Магний серно-кислый | 0,5 г |
| Натрий уксусно-кислый | 0,3 г |
| Агар-агар | 0,75 г |
После растворения перечисленных компонентов в среде доводили рН до 7,2-7,4, разливали по флаконам и стерилизовали при 0,5 атм в течение 30 минут.
Первичный посевной материал штамма Bifidobacterium bifidum 791 в объеме 5% вносили в вышеуказанную среду и культивировали при 37°С 24 часа. Далее было проведено 30 пассажей выросшей на этой среде культуры через среду того же состава, после каждого из которых производили отбор клонов по признакам максимального накопления биомассы за цикл культивирования. Если при первых пассажах получали микробный урожай не более 104-105 в 1 мл, то на 25-м пассаже число КОЕ бифидобактерий достигало 109 и сохранялось на таком уровне при последующих пересевах. Это объясняется повышенной продукцией инулиназы в результате длительного пассирования на среде, содержащей инулин.
В результате проведенной селекции получен штамм Bifidobacterium bifidum 791-ИН, который депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов - представителей нормальной микрофлоры человека под №162.
Заявляемый штамм может быть использован при производстве бактерийных препаратов в различных формах, в том числе, капсул, суппозиториев, мазей; биологически активных добавок к пище, заквасок, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, в том числе, кисломолочной продукции, соков, напитков, квасов и т.д. Также штамм Bifidobacterium bifidum 791-ИН может найти применение в производстве гигиенических и косметических средств, например, кремов, гелей, питательных масок.
Техническим результатом заявленного изобретения является получение бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, заквасок, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств, которые в качестве действующего начала пробиотической направленности содержат штамм Bifidobacterium bifidum 791-ИН, который обеспечивает утилизацию более широкого спектра углеводов и вследствие этого более технологичен, чем прототип, обладает более высокой биологической активностью и устойчивостью к внешним воздействиям, что обеспечивает более активную колонизацию кишечника и восстановление резидентной микрофлоры, а также позволит расширить арсенал технических средств лечебно-профилактической направленности. Заявляемый штамм обладает следующими свойствами.
Культурально-морфологические: грамположительные однородные палочки, равномерно окрашиваемые метиленовой синью, расположенные преимущественно цепочками.
Физиолого-биохимические: ферментирует лактозу, инулин, целлобиозу с образованием уксусной и молочной кислот и следов муравьиной и пропионовой кислот.
Арабинозу, ксилозу, маннозу, маннит, сорбит, салицин не ферментирует. На всех принятых в производстве питательных средах растет с накоплением биомассы бифидобактерий не менее lg9 микробного числа за 16-18 часов. Максимальное накопление биомассы при этом превосходит аналог на 0,5-1 lg. Активность кислотообразования при этом также превосходит таковые значения у прототипа. При культивировании на среде с инулином выход биомассы превосходит прототип на 4 порядка.
Данные представлены в таблице 1.
| Таблица 1 Число КОЕ в 1 мл и активная кислотность в °Т после 16-18 часов культивирования | ||||
| Питательная среда | В.Bifidum 791 | В.Bifidum 791-ИН | ||
| Печеночная (Блаурокка) | 2×108 | 60°T | 6×108 | 60°Т |
| Гидролизатно-молочная | 5×108 | 100°T | 8×109 | 140°T |
| Молоко | 1×108 | 70°Т | 5×108 | 90°Т |
| Эпидермат с инулином | 1×105 | 40°Т | 1×109 | 100°Т |
Антагонистические свойства у заявляемого штамма проявляются в отношении шигелл Зонне, Флекснера, сальмонелл, энтеропатогенных кишечных палочек, стафилококка, протея и выражены в большей степени, чем у прототипа (таблица 2).
| Таблица 2 Зона задержки роста тест-культур | |||||
| штамм | S.sonnei | S.flexnery | E.coli | S.aureus | Pr.vulgaris |
| В.bifidum 791 | 16,1 | 15,3 | 15,1 | 14,5 | 17,3 |
| В.bifidum 791-ИН | 22,5 | 29,0 | 18,3 | 25,0 | 19,6 |
Таким образом, из приведенных данных видно, что новый штамм Bifidobacterium bifidum 791-ИН отличается высокой технологичностью, активно наращивает биомассу бифидобактерий на производственных средах, при этом его продуктивность в среднем на 0,5 lg превосходит прототип; в отличие от прототипа утилизирует инулин и целлобиозу и растет на субстратах, содержащих эти углеводы; отличается более высокой активностью кислотообразования, чем прототип. Это повышает функциональную ценность продуктов и препаратов, приготовленных на основе такого штамма. При попадании в организм человека культура такого штамма утилизируется более обширный набор растительных субстратов, вследствие чего более активно идет колонизация слизистых кишечника, вытеснение патогенной и гнилостной микрофлоры, более эффективно восстанавливается резидентная микрофлора.
Пример 1. Получение лиофилизированного бактерийного препарата.
К суспензии 22-24-часовой культуры бифидобактерий штамма Bifidobacterium bifidum 791-ИН добавляют защитную среду высушивания (сахароза 80% и желатин 8% в объеме 10-12%) и разливают по 5 мл в пенициллиновые флаконы, замораживают при -40-45°С и лиофильно высушивают из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат содержит в 1 г сухой биомассы не менее 108 живых клеток бифидобактерий.
Пример 2. Использование штамма Bifidobacterium bifidum 791-ИН в качестве закваски для приготовления продукта лечебно-функционального питания.
Суспензию 14-16 часовой культуры штамма Bifidobacterium bifidum 791-ИН вносят в стерильное молоко в объеме 5% к объему молока, перемешивают и культивируют 8-10 часов до образования сгустка, после чего продукт охлаждают и сливают. В результате получают лечебно-профилактический кисломолочный продукт с содержанием бифидобактерий не менее 108 в 1 мл.
Пример 3. Получение жидкой формы биологически активной добавки к пище.
Инокулят культуры штамма Bifidobacteriun bifidum 791-ИН объеме 5-10% вносят в ферментер с питательной средой следующего состава в расчете на 1 литр продукта: 5-%-ный водный экстракт топинамбура, 2% гидролизата коллагена, 0,5% хлористого натрия, 0,5% экстракта шиповника, 1% пектина, 0,1% агар-агара и культивируют в течение 6-8 часов при 37,5-38°С и стерильно разливают в емкости. В результате получают биологически активную добавку к пище с содержанием бифидобактерий не менее 108 в 1 мл. Полученная добавка обладает выраженным иммунокоррегирующим действием.
Пример 4. Получение капсулированной формы биологически активной добавки к пище.
К суспензии 22-24-часовой культуры бифидобактерий штамма Bifidobacterium bifidum 791-ИН добавляют среду высушивания в объеме 20% и распылительно высушивают. 1 г готовой биомассы содержит не менее 109 жизнеспособных бифидобактерий.
Для капсулирования готовят смесь, в которую в равных частях входят следующие ингредиенты: высушенная биомасса бифидобактерий, лактулоза, пектин, декстрин. К смеси, из расчета получившейся массы добавляют 1% стеарата магния и 1% аскорбиновой кислоты. После тщательного перемешивания проводят капсулирование в капсулы №0 по 0,3 г. Одна капсула содержит не менее 108 жизнеспособных бифидобактерий.
Пример №5. Использование штамма Bifidobacterium bifidum 791-ИН для получения гигиенических и косметических средств. Сухую биомассу бифидобактерий штамма с содержанием бифидобактерий не менее 109 в 1 г вводят в состав питательного крема из расчета 1 г на 100 г крема.
Пример №6. Использование штамма Bifidobacterium bifidum 791-ИН для приготовления сока.
Инокулят культуры штамма Bifidobacterium bifidum 791-ИН в объеме 5-10% вносят в ферментер с питательной средой следующего состава в расчете на 1 литр продукта: 5%-ный водный экстракт топинамбура, 2% гидролизата коллагена, 0,5% хлористого натрия, 0,5% экстракта шиповника, 1% пектина, 0,1% агар-агара, культивируют в течение 6-8 часов при 37,5-38°С и вносят в сок, перемешивают и разливают в емкости. В результате получают продукт с концентрацией живых бифидобактерий не менее 106/мл.
Пример №7. Использование штамма Bifidobacterium bifidum 791-ИН для получения гигиенических средств.
Сухую биомассу бифидобактерий штамма с содержанием бифидобактерий не менее 109 в 1 г вводят в состав зубной пасты из расчета 1 г на 100 г пасты.
Штамм Bifidobacterium bifidum 791-ИН ГКНМ ГУ МНИИЭМ МЗ РФ им. Г.Н.Габричевского №162, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, заквасок, кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.
