Способ получения лекарственного препарата, содержащего медные аналоги хлорофилла
Владельцы патента RU 2320360:
Открытое акционерное общество "Фармацевтическая фабрика Санкт-Петербурга" (RU)
Изобретение относится к медицине. Проводят экстракцию листьев эвкалипта прутовидного 95-96% этанолом в течение 1-2 суток без перемешивания при температуре (18-24)°С при массовом соотношении листьев эвкалипта прутовидного к этанолу 1:(5-6) с отстаиванием полученного продукта в течение 2-3 суток при температуре не выше (6-8)°С, его фильтрацией и последующей обработкой полученного экстракта солью меди в течение 6-24 часов при температуре (18-24)°С. В качестве соли меди используют медь двухлористую 2-водную или 5-10% спиртовой раствор меди двухлористой 2-водной при мольном соотношении хлорофилла, содержащегося в полученном экстракте, к меди двухлористой 2-водной 1:(3-4). Изобретение позволяет получать более активный и стабильный продукт. 10 табл., 6 ил.
Заявляемое изобретение относится к способам получения лекарственных препаратов методом спиртовой экстракции природного сырья, а именно эвкалипта прутовидного (Eucaliptus viminalis. L), относящегося к семейству миртовых (Myrtaceae), и последующей обработки спиртового экстракта солью двухвалентной меди для получения нативного лекарственного комплекса, содержащего медные аналоги хлорофилла.
Лекарственный препарат, получаемый согласно заявляемому способу, имеет торговое название «Галенофиллипт» (зарегистрированный товарный знак по свидетельству РФ №286561, дата приоритета 30.06.2004) и представляет собой спиртовой раствор для приема внутрь и местного применения, предназначенный для использования в медицине в качестве эффективного противомикробного средства, в особенности - при наличии антибиотикоустойчивых штаммов золотистого стафилококка (Staphyllococcus aureus).
Известны способы получения различных лекарственных препаратов и биологически активных добавок (БАД), содержащих медные аналоги хлорофилла, путем экстракции различных видов природного сырья, например хвои (патент России №20040266, дата приоритета 29.12.1992), осиновой коры (патент России №20034555, дата приоритета 13.02.1992), прополиса - сырца и травы маргаритки многоцветной (патент России №2066191, дата приоритета 25.06.1992), водоросли ламинарии (авторское свидетельство СССР №1782603, дата приоритета 16.11.1990), листьев мяты (авторское свидетельство СССР №288869, дата приоритета 08.12.1968, авторское свидетельство СССР №955929, дата приоритета 24.09.1980).
Известен также способ получения металлсодержащих производных бактериохлорофилла и фармацевтическая композиция на их основе (патент России №2193038, дата приоритета 24.11.1996).
Известен также способ получения металлосодержащих производных хлорофилла и фармацевтические композиции на его основе (патент США №5,744,598, дата публ. 28.04.1998).
Из нескольких видов эвкалиптов (семейства миртовых), культивируемых в России, в медицине находят применение Эвкалипт прутовидный и Эвкалипт шариковый, используемые для получения противомикробных, антисептических, противовоспалительных и других препаратов (М.Д.Машковский. «Лекарственные средства». - М., т.1, 2, 2002, стр.316, 399 «Лекарственное растительное сырье. Фармакогнозия»./ Под ред. Г.П.Яковлева и К.Ф.Блиновой, СПб: СпецЛит, 2004, стр.149-152).
Основными биологически активными веществами, выделяемыми из листьев эвкалиптов экстракцией 95% этанолом и другими методами, являются эфирное масло (основные компоненты - цинеол и пинены), фенолоальдегиды, хлорофиллы и др.
В медицине в качестве противовоспалительного и антисептического средства используют настойку эвкалипта (Tinctura Eucalypti), получаемую при соотношении сырья и растворителя (1:5) на 70% этаноле (М.Д.Машковский. «Лекарственные средства». - М., 2002, т.1, стр.316).
Из листьев и побегов эвкалипта прутовидного получают препарат «Эвкалимин», содержащий фенолоальдегиды, который используется в медицинской практике в качестве препарата, обладающего бактериостатическим эффектом на стафилококки, стрептококки, дифтерийную палочку. При острых гнойно-воспалительных процессах применяют 1% спиртовой раствор «Эвкалимина» (М.Д.Машковский. «Лекарственные средства». - М., 2002, т.2, стр.399 и «Лекарственное растительное сырье. Фармакогнозия»./ под ред. Г.П.Яковлева и К.Ф.Блиновой. - СПб: СпецЛит, 2004, стр.152).
Известен препарат под торговым названием «Хлорофиллипт», который получают из листьев эвкалипта шарикового (Eucalyptus globulus L) или эвкалипта прутовидного (Eucaliptus viminalis. L) путем экстракции 95% этанолом (М.Д.Машковский. «Лекарственные средства». - М., 2002, т.2, стр 399 и авторское свидетельство СССР №801341, дата приоритета, 14.04.1979, столбец 1, 2 абз. сверху), который обладает антибактериальной активностью. В медицинской практике используют 1% спиртовой или 2% масляный растворы «Хлорофиллипта». В патентной литературе описаны способы применения «Хлорофиллипта», раствора спиртового 1% в медицинской практике (авторское свидетельство СССР №240932, дата приоритета 22.10.1965 и авторское свидетельство СССР №463706, дата приоритета 18.05.1973).
Способ получения «Хлорофиллипта» (раствора спиртового 1%) из эвкалипта прутовидного (Eucaliptus viminalis. L) описан в авторском свидетельстве СССР №801341, дата приоритета 14.04.1979, а также в сети Интернет на сайте Инновационного технологического центра МГТУ им. Н.Э.Баумана по адресу http://www.mgtu-sistema.ru/patents/1111215275/3.php, который выбран в качестве прототипа заявляемого изобретения.
1% спиртовой раствор «Хлорофиллипта» получают по авторскому свидетельству СССР №801341 путем экстракции листьев эвкалипта прутовидного (Eucaliptus viminalis. L) 96% этанолом и последующей обработкой полученного концентрированного экстракта солью двухвалентной меди, а именно 4% раствором сернокислой меди с последующим извлечением целевого продукта - суммы гидрофобных компонентов, в т.ч. медных аналогов хлорофилла, бензолом. Экстрагирование бензолом проводят трижды с перемешиванием каждый раз по 15 минут и отстаиванием в течение 5-6 часов. Отстоявшееся бензольное извлечение промывают 3 раза водой очищенной и упаривают под вакуумом при температуре 40°С. По данным из описания к авторскому свидетельству СССР №801341 (столбец 2, абз.1 снизу) «Хлорофиллипт» (раствор спиртовой 1%), полученный из эвкалипта прутовидного по той же технологии, является в 2 раза более активным бактерицидным препаратом по сравнению с «Хлорофиллиптом» раствором спиртовым 1%, выделенным из эвкалипта шарикового.
Как видно из описания технологии получения «Хлорофиллипта» (раствора спиртового 1%) по авторскому свидетельству СССР №801341 в процессе приготовления препарата, промежуточный продукт экстракции листьев эвкалипта прутовидного, содержащий хлорофилл, подвергается как термической обработке, так и химической обработке ядовитым веществом - бензолом, а также механической обработке (перемешиванию), что приводит к снижению качества целевого продукта за счет потери его нативных свойств, а также снижению стабильности препарата вследствие термического разрушения проэкстрагированного хлорофилла и его медных аналогов и снижению антибактериальной активности препарата в особенности по отношению к золотистому стафилококку.
Факт разрушения хлорофилла в результате термического воздействия известен из уровня техники, а именно из патента РФ №2034555 (стр.3, абз.2 снизу). Факт низкой активности «Хлорофиллипта» (раствора спиртового 1%) в отношении золотистого стафилококка также известен из уровня техники, например, из патента РФ №2066191 (стр.1, абз.3 сверху).
Кроме того, в результате исследований 1% спиртового раствора препарата «Хлорофиллипт», полученного способом по авторскому свидетельству №801341, проведенных авторами настоящего изобретения, было экспериментально установлено, что при обработке промежуточного продукта-экстракта расход сернокислой меди CuSO4·H2O в 4 раза превышает его реальную потребность для проведения химической реакции омеднения хлорофилла.
Таким образом, авторы настоящего изобретения установили, что в прототипе в реакционной смеси сернокислая медь находится в избытке, в связи с чем она может в определенных условиях, например при высоких температурах вступать в реакцию не только с хлорофиллом, но и с другими компонентами спиртового экстракта листьев эвкалипта прутовидного, например фенолоальдегидами, компонентами эфирного масла и другими, что приводит к уменьшению нативных (природных) свойств целевого продукта.
Задачей настоящего изобретения является создание нового способа получения лекарственного препарата из листьев эвкалипта прутовидного, при котором полученный лекарственный препарат сохранял бы все основные биологически активные компоненты, то есть имел высокую степень нативности, был стабилен даже при длительном хранении и получался по технологии, исключающей использование токсических растворителей, а также термических, химических и механических воздействий, могущих приводить к изменениям и деструкции активных компонентов препарата и снижению его активности.
Поставленная задача решается тем, что лекарственный препарат получают путем экстракции листьев эвкалипта прутовидного этанолом и последующей обработкой полученного экстракта солью двухвалентной меди. Новым является то, что экстракцию листьев эвкалипта прутовидного проводят 95-96% этанолом в течение 1-2 суток без перемешивания при температуре (18-24)°С при массовом соотношении листьев эвкалипта прутовидного к этанолу 1:(5-6) с отстаиванием полученного продукта в течение 2-3 суток при температуре не выше (6-8)°С, его фильтрацией и последующей обработкой полученного экстракта солью двухвалентной меди в течение 6-24 часов при температуре (18-24)°С, при этом в качестве соли меди используют медь двухлористую 2-водную или 5-10% спиртовой раствор меди двухлористой 2-водной при мольном соотношении хлорофилла, содержащегося в полученном экстракте, к меди двухлористой 2-водной 1:(3-4).
Вся совокупность новых признаков в заявленном изобретении является существенной для достижения поставленной задачи.
Проведение технологического процесса получения лекарственного препарата при отсутствии нагревания экстракта листьев эвкалипта прутовидного (промежуточного продукта), отсутствии механических воздействий при перемешивания реагентов в процессе экстракции и промывок, а также в процессе проведения химической реакции омеднения хлорофиллов, позволяют сохранить высокую степень нативности получаемого лекарственного препарата «Галенофиллипта» и его высокую биологическую активность за счет исключения факторов, в существенной степени влияющих на разложение хлорофиллов.
Авторы настоящего изобретения провели сравнительные исследования препаратов «Хлорофиллипт» (раствор спиртовой 1%) и «Галенофиллипт», в процессе которых изучались электронные спектры поглощения обоих препаратов, величина рН, влияние облучения дневным светом на оптическую плотность обоих препаратов, а также их качественный и количественный состав методом хроматографии в тонком слое сорбента. Кроме того, в сравниваемых препаратах определялось содержание основных действующих веществ: фенолоальдегидов, цинеола, пинена, медных аналогов хлорофилла.
В результате экспериментальных исследований препарата «Хлорофиллипт» (раствор спиртовой 1%), проведенных авторами настоящего изобретения, было установлено, что в нем, в отличие от «Галенофиллипта» отсутствует пинен - ценное биологически активное вещество, экстрагируемое этанолом из листьев эвкалипта прутовидного, а содержание медных аналогов хлорофилла, цинеола и фенолоальдегидов снижено. Сравнительные данные показателей качества (сохранения нативности препарата) «Хлорофиллипта» (раствора спиртового 1%) и «Галенофиллипта» приведены в таблице 1.
Как видно из таблицы 1, в препарате «Галенофиллипт», полученном в соответствии с заявляемым способом, содержание основных биологически активных веществ: фенолоальдегидов, цинеолов, медных аналогов хлорофилла в 2-3 раза выше, чем в препарате «Хлорофиллипт» (раствор спиртовой 1%), полученном по способу, выбранному в качестве прототипа. Кроме того, рН препарата «Галенофиллипт» в 1,4 раза больше, чем рН препарата «Хлорофиллипт» (раствор спиртовой 1%). Последнее может ускорять разложение хлорофиллов, т.к. известно, что при низких значениях рН снижается устойчивость хлорофиллов (Березин Б.Д. Координационные соединения порфиринов и фталоцианина. - М.: Наука, 1978).
В таблице 2 приведены результаты исследования влияния облучения дневным светом на оптическую плотность спиртового экстракта из листьев эвкалипта прутовидного и препаратов «Галенофиллипт» и «Хлорофиллипт» (раствор спиртовой 1%). Исследовались два препарата «Хлорофиллипт» (раствор спиртовой 1%) (производитель Украина) и «Хлорофиллипта» (раствор спиртовой 1%) (производитель Россия), представленные на российском рынке и полученные одинаковым способом по технологии прототипа. При этом для проведения сравнительных исследований использовался препарат «Хлорофиллипт» (раствор спиртовой 1%) серии №490705 производства Украины и препарат «Хлорофиллипта» (раствор спиртовой 1%) серии №71205 производства России.
Сравниваемые образцы препаратов облучали дневным светом в течение 7 суток. Как видно из таблицы 2, падение оптической плотности у препарата «Галенофиллипт» через 7 суток облучения дневным светом составило 9%, у препарата «Хлорофиллипт» (раствор спиртовой 1%) (Украина) - 26%, у препарата «Хлорофиллипта» (раствор спиртовой 1%) (Россия) - 35%. Полученные данные свидетельствуют о том, что стабильность лекарственного препарата «Галенофиллипт», полученного заявляемым способом в 2,8-3,8 раза выше, чем у обоих сравниваемых препаратов, получаемых по способу - прототипу.
Из уровня техники известно, что при взаимодействии солей двухвалентной меди с индивидуальным хлорофиллом в спиртовых растворах в электронном спектре поглощения смеси наблюдается гиперхромный и гипохромный сдвиг первой полосы поглощения хлорофилла от (662±3) нм до (650±3) нм, что характерно для медных аналогов хлорофилла (Журнал РАН «Успехи химии» №73(2) 2004, статья Б.Д.Березина и др. «Химические превращения хлорофилла и его использование для создания экологически чистых красителей нового поколения », стр.202, табл.4, 3 строка сверху).
В процессе реализации настоящего изобретения представляло научный и практический интерес установить, как протекает это взаимодействие в многокомпонентных спиртовых растворах, содержащих наряду с хлорофиллом, также и другие химические вещества, способные к тем или иным реакциям с двухвалентной медью. К таким системам относится и спиртовой экстракт листьев эвкалипта прутовидного, содержащий, кроме хлорофиллов, фенолоальдегиды, эфирное масло и другие компоненты.
При добавлении возрастающих количеств спиртового раствора меди двухлористой 2-водной с известной концентрацией к спиртовому экстракту листьев эвкалипта прутовидного с известным содержанием хлорофилла, в смеси нами установлено (фиг.1) постепенное уменьшение, а затем и исчезновение первой полосы поглощения хлорофилла при (662±3) нм и одновременное постепенное возрастание максимума поглощения при (650±3) нм (медные аналоги хлорофилла).
Неожиданно авторы настоящего изобретения обнаружили, что этот процесс заканчивается при мольном соотношении хлорофилла и меди двухлористой 2-водной 1:(3-4), соответственно. Дальнейшее добавление меди двухлористой 2-водной (1:4 и 1:5) не изменяет вида электронного спектра поглощения (фиг.1).
При всех соотношениях хлорофилла и меди двухлористой 2-водной не наблюдалось изменения электронного спектра поглощения смеси в области 220-290 нм, характерной для фенолоальдегидов (фиг.2). Эти данные позволяют сделать вывод о том, что в технологическом процессе получения лекарственного препарата Галенофиллипт согласно заявляемому изобретению, происходит взаимодействие меди двухлористой 2-водной только с хлорофиллом, а другие компоненты экстракта листьев эвкалипта прутовидного, такие как фенолоальдегиды, компоненты эфирного масла (цинеол и пинен) не реагируют с медью двухлористой 2-водной. Описанный выше неожиданно установленный феномен позволяет получить лекарственный препарат по новой технологии с сохранением всех полезных свойств основных биологически активных компонентов экстракта листьев эвкалипта прутовидного.
Из уровня техники известно, что очистка производных хлорофилла при производстве лекарственных препаратов - очень трудоемкий технологический процесс, требующий большого расхода растворителей и больших энергозатрат (патент РФ №2147203, стр.1, 4 абз. сверху). Оптимальный подбор технологических параметров заявляемого способа получения лекарственного препарата «Галенофиллипт» позволяет исключить стадию очистки экстракта крайне опасным растворителем - бензолом, а также исключить стадию удаления избытка соли меди промывкой водой, остатков бензола - с использованием многократного нагревания, экстракции и азеотропной отгонки бензола спиртом, что позволяет сохранить высокие биологически активные свойства получаемого лекарственного препарата за счет сохранения нативных свойств его компонентов и обеспечить его стабильность.
Сущность заявляемого изобретения поясняется следующими чертежами:
фиг.1 - электронные спектры поглощения спиртового экстракта листьев эвкалипта прутовидного и продуктов его омеднения при различных мольных соотношениях хлорофилла и меди двухлористой 2-водной;
фиг.2 - электронные спектры поглощения спиртового экстракта листьев эвкалипта прутовидного и продуктов его омеднения при различных мольных соотношениях хлорофилла к меди двухлористой 2-водной в области (200-280) нм;
фиг.3 - схема хроматограмм спиртового экстракта эвкалипта прутовидного (Э), «Галенофиллипта» (Г), «Хлорофиллипта» (раствора спиртового 1%) (X) на пластинах Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ в системе растворителей ацетон-петролейный эфир (3:7);
фиг.4 - электронные спектры поглощения хлорофиллов, содержащихся в спиртовых извлечениях из пятен хроматограммы экстракта листьев эвкалипта прутовидного;
фиг.5 - электронные спектры поглощения хлорофиллов, содержащихся в спиртовых извлечениях из пятен хроматограммы «Галенофиллипта»;
фиг.6 - электронные спектры поглощения хлорофиллов, содержащихся в спиртовых извлечениях из пятен хроматограммы «Хлорофиллипта» (раствора спиртового 1%).
Приведем примеры конкретного осуществления заявляемого способа изобретения.
Пример 1. Технология получения препарата «Галенофиллипт», раствор для приема внутрь и местного применения спиртовой, при мольном соотношении хлорофилла в экстракте-полупродукте и меди двухлористой 2-водной 1:3 соответственно.
Для приготовления 1000 л препарата «Галенофиллипт» по заявляемому способу берут 200 кг измельченных листьев эвкалипта прутовидного (ФСП 42-0039-3375-02) загружают их в экстрактор и заливают 95% этанолом (ФС 42-3072-00) при массовом соотношении листьев эвкалипта прутовидного к этанолу 1:5 в количестве 1175 литров, учитывающим коэффициент спиртопоглощения сырья для получения 1000 л промежуточного продукта (экстракта-полупродукта), и производят экстракцию при комнатной температуре (18-24°С) в течение 24 часов без перемешивания. Полученный экстракт-полупродукт необходимо хранить в темноте.
Через 24 часа полученный экстракт-полупродукт сливают в реактор, охлаждаемый рассолом и отстаивают в течение 2 суток при температуре +8°С. Затем из полученного таким образом экстракта-полупродукта отбирают пробу и определяют содержание в ней хлорофилла, фенолоальдегидов, сухого остатка, спирта, величину рН, снимают электронный спектр поглощения (фиг.1, кривая 1 «экстракт»). При получении данных анализа, соответствующих требованиям к экстракту-полупродукту, последний фильтруют через гофрокартон на фильтр-прессе. В электронном спектре профильтрованного экстракта-полупродукта присутствует лишь одна полоса поглощения с максимумом (662±3) нм, характерная для хлорофилла (фиг.1 кривая 1 «экстракт»).
Отфильтрованный экстракт-полупродукт омедняют расчетным количеством 10% спиртового раствора меди двухлористой 2-водной при мольном соотношении хлорофилла, содержащегося в экстракте-полупродукте к меди двухлористой 2-водной 1:3, соответственно, что в пересчете на массовое соотношение экстракта-полупродукта к меди двухлористой 2-водной составляет 1000:0,076. Затем омедненный экстракт-полупродукт выдерживают при температуре от 18 до 24°С в течение 24 часов, после чего снимают электронный спектр поглощения полученного омедненного продукта в области от 600 до 700 нм.
В электронном спектре поглощения наблюдается полоса поглощения с максимумом при (650±3) нм (медные аналоги хлорофилла), а также увеличение оптической плотности до 0,36 (фиг.1, кривая 5 (1:3)).
Через 24 часа отбирают пробу полученного целевого продукта «Галенофиллипт» и анализируют ее в соответствии с требованиями фармакопейной статьи по разделам: описание, подлинность, рН, тяжелые металлы, содержание спирта, сухой остаток, микробиологическая чистота, количественное определение фенолоальдегидов, содержание меди, токсичность.
При получении удовлетворительных результатов анализа полученный «Галенофиллипт» фильтруют через гофрокартон на фильтр-прессе. Затем «Галенофиллипт» передают на фасовку во флаконы темного стекла и упаковку в пачку картонную.
В результате осуществления заявляемого способа получают препарат «Галенофиллипт», раствор для приема внутрь и местного применения спиртовой следующего состава:
| Эвкалипта прутовидного листьев | - 200 г |
| Меди двухлористой 2-водной | - 0,06 г |
| Спирта этилового 95% до | получения 1000 мл препарата |
Пример 2. Способ получения лекарственного препарата, содержащего медные аналоги хлорофилла, при мольном соотношении хлорофилла в экстракте-полупродукте к меди двухлористой 2-водной как 1:0,5.
Производят экстракцию 200 кг листьев эвкалипта прутовидного 95% этанолом так, как это описано в примере 1 в настоящей заявке до стадии омеднения промежуточного экстракта-продукта медью двухлористой 2-водной. Отфильтрованный экстракт-полупродукт омедняют медью двухлористой 2-водной при соотношении хлорофилла, содержащегося в полученном экстракте-полупродукте к меди двухлористой 2-водной как 1:0,5, что в пересчете на массовое соотношение экстракта-полупродукта к меди двухлористой 2-водной составляет 1000:0,0126. Затем омедненный экстракт-полупродукт выдерживают при температуре от 18 до 24°С в течение 24 часов.
Затем снимают электронный спектр поглощения в области от 600 до 700 нм.
В электронном спектре поглощения наблюдается широкая полоса поглощения, включающая два слабовыраженных максимума поглощения: хлорофилла при (662±3) нм и медного аналога хлорофилла при (650±3) нм, что указывает на лишь частичное связывание хлорофилла с меди двухлористой 2-водной вследствие недостаточного количества последней (фиг.1, кривая 2 (1:0,5)).
Пример 3. Способ получения лекарственного препарата, содержащего медные производные хлорофилла, при мольном соотношении хлорофилла в экстракте-полупродукте к меди двухлористой 2-водной как 1:1.
Производят экстракцию 200 кг листьев эвкалипта прутовидного 95% этанолом так, как это описано в примере 1 в настоящей заявке до стадии омеднения промежуточного экстракта-продукта медью двухлористой 2-водной. Отфильтрованный экстракт-полупродукт омедняют медью двухлористой 2-водной при соотношении хлорофилла, содержащегося в полученном экстракте-полупродукте к меди двухлористой 2-водной как 1:1, что в пересчете на массовое соотношение экстракта-полупродукта к меди двухлористой 2-водной составляет 1000:0,0253. Затем омедненный экстракт-полупродукт выдерживают при температуре от 18 до 24°С в течение 24 часов.
Затем снимают электронный спектр поглощения в области от 600 до 700 нм.
В электронном спектре поглощения наблюдается уменьшение интенсивности полосы поглощения хлорофилла в области (662±3) нм, а также повышение оптической плотности поглощения при (650±3) нм по сравнению с кривой 2 (фиг.1) 0,24 до 0,27, что указывает на возрастание выхода медных аналогов хлорофилла, образующихся при увеличении добавляемого количества меди двухлористой 2-водной (фиг.1, кривая 3 (1:1)).
Пример 4. Способ получения лекарственного препарата, содержащего медные аналоги хлорофилла, при мольном соотношении хлорофилла в экстракте-полупродукте к меди двухлористой 2-водной как 1:2.
Производят экстракцию 200 кг листьев эвкалипта прутовидного 95% этанолом так, как это описано в примере 1 в настоящей заявке до стадии омеднения промежуточного экстракта-продукта медью двухлористой 2-водной. Отфильтрованный экстракт-полупродукт омедняют медью двухлористой 2-водной при соотношении хлорофилла, содержащегося в полученном экстракте-полупродукте к меди двухлористой 2-водной как 1:2, что в пересчете на массовое соотношение экстракта-полупродукта к меди двухлористой 2-водной составляет 1000:0,051. Затем омедненный экстракт-полупродукт выдерживают при температуре от 18 до 24°С в течение 24 часов.
После чего снимают электронный спектр поглощения в области от 600 до 700 нм.
В электронном спектре поглощения наблюдается резкое снижение оптической плотности при (662±3) нм и возрастание оптической плотности поглощения при (650±3) нм, с 0,27 до 0,35 (фиг.1, кривая 4 (1:2)), что указывает на значительное увеличение содержания медных аналогов хлорофиллов.
Пример 5. Способ получения лекарственного препарата, содержащего медные аналоги хлорофилла, при мольном соотношении хлорофилла в экстракте-полупродукте к меди двухлористой 2-водной как 1:4.
Производят экстракцию 200 кг листьев эвкалипта прутовидного 95% этанолом так, как это описано в примере 1 в настоящей заявке до стадии омеднения промежуточного экстракта-продукта медью двухлористой 2-водной. Отфильтрованный экстракт-полупродукт омедняют медью двухлористой 2-водной при соотношении хлорофилла, содержащегося в полученном экстракте-полупродукте к меди двухлористой 2-водной как 1:4, что в пересчете на массовое соотношение экстракта-полупродукта к меди двухлористой 2-водной составляет 1000:0,101. Затем омедненный экстракт-полупродукт выдерживают при температуре от 18 до 24°С в течение 24 часов.
Затем снимают электронный спектр поглощения в области от 600 до 700 нм.
В электронном спектре поглощения наблюдается максимум поглощения при (650±3) нм, оптическая плотность его не меняется (0,36), что указывает на полное связывание всего хлорофилла с медью двухлористой 2-водной (фиг.1, кривая 6 (1:4)).
Пример 6. Способ получения лекарственного препарата, содержащего медные аналоги хлорофилла, при мольном соотношении хлорофилла в экстракте-полупродукте к меди двухлористой 2-водной как 1:5.
Производят экстракцию 200 кг листьев эвкалипта прутовидного 95% этанолом так, как это описано в примере 1 в настоящей заявке до стадии омеднения промежуточного экстракта-продукта медью двухлористой 2-водной. Отфильтрованный экстракт-полупродукт омедняют медью двухлористой 2-водной при соотношении хлорофилла, содержащегося в полученном экстракте-полупродукте к меди двухлористой 2-водной как 1:5, что в пересчете на массовое соотношение экстракта-полупродукта к меди двухлористой 2-водной составляет 1000:0,127. Затем омедненный экстракт-полупродукт выдерживают при температуре от 18 до 24°С в течение 24 часов.
Затем снимают электронный спектр поглощения в области от 600 до 700 нм.
По сравнению с предыдущим примером изменений в электронном спектре поглощения не наблюдается. В электронном спектре поглощения наблюдается максимум поглощения при (650±3) нм, оптическая плотность его не изменяется 0,36, (фиг.1, кривая 7), то есть дальнейшее добавление меди двухлористой 2-водной не увеличивает выход медных аналогов хлорофилла. Из полученных данных (примеры 1-6) следует, что для полного омеднения хлорофиллов, содержащихся в экстракте из листьев эвкалипта прутовидного, необходимо использовать 3-4 эквивалента меди двухлористой 2-водной.
Авторы настоящего изобретения провели сравнительное исследование хроматограмм спиртового экстракта листьев эвкалипта прутовидного, «Галенофиллипта»,полученного заявляемым способом, а также «Хлорофиллипта» (раствора спиртового 1%) (прототипа).
При сравнении свойств экстракта листьев эвкалипта прутовидного с полученным из него «Галенофиллиптом», а также с «Хлорофиллиптом» (раствором спиртовым 1%) на хроматограмме в тонком слое сорбента, в экстракте обнаруживаются пятна хлорофиллов (визуально и в УФ-свете с максимумом излучения 365 нм). На хроматограммах «Галенофиллипта» и «Хлорофиллипта» (раствора спиртового 1%) обнаруживаются визуально изумрудные пятна медных аналогов хлорофилла с различными величинами Rf - безразмерная величина отношения расстояния, прошедшего пятном хромотографируемого вещества от старта, к расстоянию, пройденному системой растворителя от старта до финиша (фиг.3). При этом на хроматограммах положение пятен хлорофиллов экстракта и пятен медных аналогов хлорофилла в «Галенофиллипте» совпадают и находятся в верхних частях хроматограмм, что свидетельствует о том, что структура молекулы после замещения Mg на Cu сохраняется и косвенно подтверждает, что полученное вещество является медным аналогом хлорофилла. В случае «Хлорофиллипта» (раствора спиртового 1%) количество пятен медных аналогов хлорофилла больше по сравнению с количеством пятен на хроматограмме «Галенофиллипта» и они имеют существенно меньшие величины Rf, что свидетельствует о том, что в процессе получения «Хлорофиллипта» под химических воздействием избыточного количества меди сульфата и низкой величины рН, а также интенсивного перемешивания при трехкратной экстркации бензолом и нагревании происходит изменение структуры хлорофиллов (частичная деградация) с образованием хроматографически менее подвижных производных, что свидетельствует о получении препарата со значительно более низкими нативными свойствами.
Далее авторы настоящего изобретения получили и исследовали электронные спектры поглощения спиртовых извлечений из отдельных пятен хроматограмм экстракта эвкалипта прутовидного, «Галенофиллипта» и «Хлорофиллипта» (раствора спиртового 1%) (фиг.4, 5, 6).
Как видно из фиг.4, в электронном спектре поглощения спиртовых извлечений из пятен хромотограммы экстракта листьев эвкалипта обнаруживаются максимумы поглощения при 662, 655 и 651 нм, характерные для хлорофиллов.
В электронном спектре поглощения спиртовых извлечений из пятен хроматограмм «Галенофиллипта» обнаруживаются пятна медных аналогов хлорофилла с максимумами 650, 640 и 647 нм, а в электронных спектрах поглощения спиртовых извлечений из пятен хроматограмм «Хлорофиллипта» (раствора спиртового 1%) - с максимумами при 650 (2 пятна) и 640 нм.
Количество медных аналогов хлорофилла, присутствующих в «Галенофиллипте», вычисленных по площади полос поглощения спектров, примерно в 3 раза больше, чем в «Хлорофиллипте» (растворе спиртовом 1%). Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что содержание медных аналогов хлорофилла в «Галенофиллипте» существенно выше, чем в «Хлорофиллипте» (растворе спиртовом 1%), что позволяет предположить более высокую биологическую активность препарата «Галенофиллипт», полученного согласно заявляемому способу, по сравнению с препаратом «Хлорофиллипт» (раствор спиртовой 1%) (прототип).
Приведем результаты доклинических сравнительных исследований противомикробной активности препаратов «Галенофиллипта» и «Хлорофиллипта» (раствора спиртового 1%).
Исследование антибактериальных и противогрибковых свойств в опытах in vitro.
Исследования выполнялись в соответствии с «Методическими указаниями по изучению противомикробной активности фармакологических веществ», «Методическими указаниями по изучению противогрибкой активности фармакологических веществ» (в книге «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ». - М.: Медицина, 2005, с.515-531 и с.582-588).
Количественная оценка противомикробного действия препарата Галенофиллипт в сравнении с препаратом «Хлорофиллипт» (раствор спиртовой 1%) и известными антибиотиками.
Для выявления преимуществ препарата «Галенофиллипт» была проведена количественная оценка его антибактериального действия в сравнении с «Хлорофиллиптом» (раствор спиртовой 1%) и шестью антибиотиками с использованием метода разведения.
Использовали музейные штаммы микроорганизмов, занимающих различное систематическое положение: грамположительные кокки - Stafilococcus aureus-209 Р; грамотрицательные палочки - Escherichia coli-88; спорообразующие палочки - Clostridium dificille-4938 и грибы Candida albicans-674, а также полевые штаммы Pseudomonas aeruginosa и Salmonella typhi suis.
Полученные результаты, представленные в таблице 3, свидетельствуют о том, что минимальная подавляющая концентрация «Галенофиллипта» для всех испытанных штаммов микроорганизмов составляет от 0,2 до 2,0 мкг/мл, т.е. сопоставима с эффектом известных антибиотиков. Однако в отличие от них, «Галенофиллипт» обладает значительно более широким спектром действия, так как способен подавлять жизнедеятельность и грибов (C.albicans). В случае «Хлорофиллипта» раствора спиртового 1% минимальная подавляющая концентрация значительно больше и составляют от 1,3 до 8,0 мкг/мл, т.е. активность «Хлорофиллипта» (раствора спиртового 1%) существенно ниже «Галенофиллипта».
Следовательно, препарат «Галенофиллипт» обладает выраженным антибактериальным действием в концентрациях, сопоставимых с эффективными дозами антибиотиков. Он обладает более широким спектром действия по сравнению с большинством антибиотиков, применяемых в медицинской практике.
По сравнению с препаратом «Хлорофиллипт» (раствор спиртовой 1%) (прототип) препарат «Галенофиллипт» эффективнее по антибактериальной активности приблизительно в 2 раза.
Исследование антибактериального действия сравниваемых препаратов методом посева на агар (ГФ XI, вып.2, стр.188 и «Изменением» №2 к ней от 01.01.2002 г.)
Проведено три серии исследований методом посева на агар (в чашки Петри диаметром 90 мм) и жидкие питательные среды (в пробирки) по отношению к контрольным штаммам: Е.Coli (АТСС 25922), St.aureus (ATCC 6538-Р), Ps.aemgmosa (АТСС 9027), Вас.Subtilis (АТСС 6633), Вас.cereus (АТСС 10702), и грибами C.albicans (АТСС 885-653). Для этого из 10 мл каждого препарата готовили разведения 1:10, 1:20, 1:50, 1:100, 1:200, 1:500, используя фосфатный буферный раствор. По 1 мл препаратов и их разведении вносили в чашки и пробирки, где после инкубации учитывали рост тест-микроорганизмов. В контроль вносили аналогичные объемы дистиллированной воды.
Результаты исследований представлены в таблице 4.
Как видно из таблицы 4, в контрольных образцах наблюдался активный рост тест-микроорганизмов.
Результаты эксперимента свидетельствуют о широком спектре антимикробного действия у препарата «Галенофиллипт», который оказался существенно активнее препарата сравнения «Хлорофиллипта» (раствора спиртового 1%).
Исследование биоцидного действия сравниваемых препаратов.
В ходе проведенного исследования изучалось воздействие сравниваемых препаратов «Галенофиллипт» и «Хлорофиллипт» (раствора спиртового 1%)на культуры микроорганизмов.
Тест-культуры подбирали по принципу их разной чувствительности к неблагоприятным воздействиям внешней среды, в т.ч. к изучаемым препаратам, обусловленной: типом строения клеточной стенки (грациликутный, фармикутный, дрожжевой); наличием на клеточной стенке дополнительных поверхностных слоев (капсул и др.); происхождением штамма (музейный или клинический изолят); индивидуальными особенностями микроорганизма; плотностью популяции микроорганизмов, испытывающей «давление» неблагоприятного фактора.
В качестве дополнительного показателя учитывали принадлежность тест-культуры к нормальной (НМ) или условно-патогенной (УПМ) микрофлоре.
Перечень и характеристики тест-культур приведены в таблице 5.
Тест-культуры выращивали в соответствующих питательных средах (Lactobacillus acidophilus в МРС-1; Escherichia coli M-17, Klebsiella pneumonia, Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus 209 - в питательном бульоне; Candida albicans - в мальтозном бульоне) в течение 24 часов при 37°С. Из жидких культур готовили стандартные суспензии плотностью 103-108 КОЕ/мл и наносили по 100 мкл на поверхность аналогичных агаровых сред, содержащих 0.025-0.5% исследуемых субстанций. Посевы инкубировали при 37°С в течение 5 суток, просматривая ежедневно, после чего производили подсчет колоний. Результаты выражали в lgKOE/мл (таблица 6).
В случаях отсутствия роста колоний считали, что 100 мкл пробы содержит менее 1 колонии, т.е. менее 10 колоний в 1 мл. Соответственно lgKOE/MA=l правильно представлять, как lgKOE/мл<1.
Как видно из таблицы 6, представленные результаты свидетельствуют о том, что «Галенофиллипт» обладает широким спектром антимикробной активности в отношении дрожжей и бактерий, независимо от типа строения их клеточной стенки и плотности популяции. Эффективная концентрация препарата «Галенофиллипт» коррелирует со степенью устойчивости микроорганизмов к неблагоприятным внешним воздействиям (0.05%, для умеренно устойчивых и 0.1% - для устойчивых микроорганизмов). Грациликутные бактерии и дрожжи в исследованном диапазоне концентраций устойчивы к «Галенофиллипту», независимо от плотности микробной популяции.
Следовательно, препарат «Галенофиллипт» оказывает биоцидное действие на представителей как нормальной, так и условно-патогенной микрофлоры, превосходя в этом отношении препарат сравнения «Хлорофиллипт» (раствор спиртовой 1%).
Исследование специфической противоожоговой и противомикробной активности препаратов «Галенофиллипт» и «Хлорофиллипт» (раствор спиртовой 1%) на модели локализованной гнойно-воспалительной инфекции в опытах in vivo.
Исследования проводилась в соответствии с «Методическими рекомендациями по экспериментальному (доклиническому) изучению лекарственных препаратов для местного лечения гнойных ран и ожогов». - М.: Минздрав СССР, 1989, 48 с.
Исследования проводили в виде сравнения эффективности лечебного действия «Галенофиллипта», «Хлорофиллипта» (раствора спиртового 1%) и «Дермазина» - крема с антибактериальным действием с сульфадиазином серебра (фирмы Lek Pharmaceutical and Chemical Company d.d., Словения), широко применяемого в практике для местного лечения ожогов (регистрационный №005398 от 14.10.94 г. в Регистре лекарственных средств России; НД: 42-298-94) на характер и темпы послеожоговой регенерации. В эксперименте на лабораторных животных (белые крысы, самцы) моделировали одинаковые по глубине и площади ожоги. Различия между сравниваемыми сериями заключались лишь в применяемых лечебных средствах. Объективность результатов исследования достигалась идентичными для всех животных условиями их содержания, лечения, а также единой методикой оценки получаемых данных.
Моделирование термических ожогов осуществлялось следующим образом.
Ограниченные по площади ожоги кожи моделировали у крыс световым излучением специальной установкой, разработанной специалистами Военно-медицинской Академии им. С.М.Кирова и позволяющей точно дозировать площадь и степень (глубину) ожогового поражения. В наших исследованиях использовался ее модифицированный вариант. На выстриженной коже спины каждой крысы (симметрично средней линии спины) с помощью установки создавалось два участка ожога размером 2,5×2 см каждый. Суммарная площадь симметрично расположенных ожогов составляла 10 см2, то есть около 4% площади поверхности тела. Глубина (степень) ожога - 3 «а» и «б» степеней.
Способы применения сравниваемых лекарственных средств у всех животных были одинаковыми - аппликации «Галенофиллиптом» и «Хлорофиллиптом» (раствором спиртовым 1%) в виде пропитанных ими тампонов, или крема «Дермазин» в дозе 150 мг/10 см2 или 800-900 мг/кг осуществлялась на обожженную поверхность через сутки на протяжении всего периода заживления раневой поверхности. Контрольным животным на участки ожога накладывались сухие стерильные салфетки, которые менялись через 1-2 дня, причем все манипуляции (в том числе нанесение ожога) проводились под коротким кетаминовым наркозом.
Регистрировали: показатели общего состояния животных (пищевую и двигательную активность); показатели течения раневого процесса (площадь ожога и завершение эпителизации). Обязательно проводился гистологический контроль течения процесса заживления.
Как видно из результатов проведенных исследований, двигательная и пищевая активности всех животных существенно не изменялись, что можно объяснить небольшими размерами ожога, а следовательно, и малой тяжестью развивающихся общих изменений. Поэтому основным объектом изучения, как это и требовалось по задачам исследования, являлась динамика местных изменений в ожоговых ранах.
Оценка результатов лечения ожогов, представленная для наглядности в виде таблиц 7 и 8, свидетельствует, что, по сравнению с нелеченными животными (контроль), «Галенофиллипт», «Хлорофиллипт» (раствор спиртовой 1%) и «Дермазин» оказали отчетливое положительное влияние на темпы регенерации.
Сравнительная оценка скорости отторжения ожогового струпа показала, что по данному показателю эффективность сравниваемых средств возрастала в ряду: «без лечения»<«Хлорофиллипт» (раствор спиртовой 1%)<«Дермазин»<«Галенофиллипт». Аналогичная тенденция просматривалась и по другим показателям клинической эффективности.
Следует отметить, что по всем показателям «Галенофиллипт» был достоверно эффективнее по сравнению с контролем, причем по скорости отторжения ожогового струпа и по скорости полной эпителизации он достоверно превосходил и «Дермазин», и «Хлорофиллипт» (раствор спиртовой 1%). Кроме того, если при применении крема «Дермазин» у каждого второго животного наблюдалось образование келоидного рубца, то у животных, пролеченных «Галенофиллиптом», образование келоидов не наблюдалось и ожоги заживали первичным натяжением.
В таблице 7 приведены результаты полного заживления ожоговых ран при различных сроках наблюдения. К 25-му дню наступила полная эпителизация ожоговых ран у крыс, пролеченных «Галенофиллиптом» - у 76%; «Дермазином» - у 55%; «Хлорофиллиптом» (раствором спиртовым 1%) - у 50%; у нелеченных - у 18%. К 30-му дню лечения эти цифры соответственно были: 93%, 85%, 79% и 25%.
Следовательно, сохранилась закономерность, отмеченная выше, т.е. лечебная эффективность испытанных средств по показателю полного заживления ожога возрастала в ряду: «без лечения»<«Хлорофиллипт»<«Дермазин»<«Галенофиллипт».
Полученные результаты подтверждаются данными патоморфологического исследования ожоговых ран.
В группе животных без лечения на 35-37 день на месте ожога виден рубец, состоящий из плотных коллагеновых соединительнотканных волокон.
Данные морфологии подтверждаются визуально динамикой репарации ожоговых ран, которая представлена на фотографиях экспериментальных животных.
По данным гистологического исследования, применение препарата «Галенофиллипт» в условиях светового ожога 3 «а» и «б» степеней способствует более быстрой и полноценной эпителизации ожоговой поверхности, в то время как в условиях ожога без применения препарата на месте ожога образуется келоидный рубец и восстановление придатков кожи не происходит.
В процессе применения сравниваемых препаратов и течения ожогового процесса на 5, 10 и 20 день оценивалось общее состояние животных, включающее 11 стандартных показателей: вес тела, белок мочи, удельный вес мочи, сахар крови, белок сыворотки, активность АлТ, АсТ, содержание лейкоцитов, содержание эритроцитов, содержание гемоглобина, СОЭ.
Результаты исследования свидетельствуют о наличии динамических изменений, характерных для течения воспалительного и репаративного процессов: в начале ожоговои интоксикации замедлены темпы увеличения веса, снижено содержание эритроцитов, гемоглобина, увеличены лейкоцитоз и СОЭ. В дальнейшем эти показатели постепенно возвращаются к нормальным уровням, причем наблюдается тенденция более быстрой нормализации при лечении ожогов «Галенофиллиптом».
Исследование антимикробной активности сравниваемых препаратов.
Изучение бактерицидных и бактериостатических свойств исследуемых препаратов проводилось методом диффузии в агар (метод дисков) и путем его внесения в агаровую лунку по отношению к контрольным штаммам: Е.Coli (ATCC 25922), St.aureus (ATCC 653 8-Р), Ps.aemginosa (ATCC 9027), Вас.Subtilis (ATCC 6633), Вас.cereus (ATCC 10702), и грибами C.albicans (ATCC 885-653). В соответствии с ГФ XI, вып.2, стр.187, проведено 3 серии исследований.
Результаты представлены в таблице 9.
Как видно из таблицы 9, в контрольных образцах (с физиологическим раствором) вокруг дисков наблюдался сплошной рост тестовых микроорганизмов.
При применении сравниваемых препаратов наблюдалась задержка роста микроорганизмов, что свидетельствует о чувствительности микроорганизмов к ним.
Проводили также контроль стерильности исследуемых препаратов путем прямого посева на жидкую среду Сабуро (Государственная Фармакопия XI, вып.2, стр.188). При этом длительная инкубация не приводила к помутнению питательной среды, что свидетельствует о стерильности и бактерицидных свойствах сравниваемых препаратов.
Кроме этого, производился посев отделяемого раневых ожоговых поверхностей на кровяной агар, среду Чистовича, Сабуро, Эндо и мясопептонный агар. При этом выявлялся рост стафилококков и грамотрицательных палочек (таблица 10), который исчезал в случае «Хлорофиллипта» (раствора спиртового 1%) лишь к 20 дню, а в случае «Галенофиллипта» - уже к 10 дню.
Как видно из приведенных данных в экспериментах с необширным ожогом (3 «а» и «б» степеней) на площади около 4% поверхности тела, не оказав заметного влияния на показатели общего состояния, препарат «Галенофиллипт» способствовал оптимизации репаративного процесса в большей степени, чем «Дермазин» и «Хлорофиллипт» (раствор спиртовой 1%) применяемые в практической медицине в качестве средств местного лечения.
Ускорение сроков начала и полного отторжения струпа, начала и завершения эпителизации по сравнению с показателями течения тех же процессов при применении «Дермазина» и «Хлорофиллипт» (раствор спиртовой 1%), позволяет отметить большую эффективность препарата «Галенофиллипт» в достижении нормального, близкого к оптимальному, течения процессов репаративной регенерации.
«Галенофиллипт» может применяться в качестве средства при лечении ожогов 3 «а» и «б» степеней, точечных или круговых глубоких ожогов или при линейных глубоких ожогах площадью не более 4% поверхности тела. «Галенофиллипт» не уступает, а по многим показателям клинического течения ожоговой раны, превосходит препарат-прототип «Хлорофиллипт» и мазь «Дермазин».
Таким образом, как видно из приведенных выше данных, достоверно установлено, что лекарственный препарат «Галенофиллипт», полученный согласно заявляемому способу обладает более высокой биологической активностью, более высокой нативностью и более высокой стабильностью лекарственной формы по сравнению с препаратом «Хлорофиллипт» (раствор спиртовой 1%), полученным по способу-прототипу.
| Таблица 1 | |||
| Сравнение показателей качества (нативности) «Хлорофиллипта» и «Галенофиллипта» | |||
| Показатели качества (нативности) препарата | «Галенофиллипт» | «Хлорофиллипт» | Результаты сравнения Галенофиллипт/Хлорофил- липт |
| Медные производные хлорофилла (D=650 нм) | ˜0,045 | ˜0,012 | >2-3 раза |
| Фенолоальдегиды, % | ˜0,82 | ˜0,46 | >2 раза |
| Цинеол,% | 0,12 | 0,03 | >2-3 раза |
| Пинен, % | 0,03 | - | есть/нет |
| рН | 4,3 | 3,1-3,2 | >1,4 раза |
| Таблица 2 | ||||
| Влияние облучения дневным светом на оптическую плотность препарата «Галенофиллипт» и препарата «Хлорофиллипт» (раствор спиртовой 1%, производство Украина) и «Хлорофиллипта» (раствор спиртовой 1%, производство Россия). | ||||
| Название препарата | Исходная оптическая плотность | Оптическая плотность через 7 суток облучения | Остаточная плотность | Падение плотности |
| Галенофиллипт | при 650 нм 0,391 | при 650 нм 0,356 | 91% | 9% |
| Хлорофиллипт, раствор спиртовой 1% (Украина) | при 650 нм 0,233 | при 650 нм 0,173 | 74% | 26% |
| Хлорофиллипта, раствор спиртовой 1% (Россия) | при 650 нм 0,139 | при 650 нм 0,090 | 65% | 35% |
| Таблица 3 | ||||||
| Минимальная подавляющая концентрация (МПК) для сравниваемых препаратов in vitro (мкг/мл) | ||||||
| Препарат | Тест-микроб | |||||
| E.coli | Ps. | St. | Cl. | C. | S.typhis | |
| «Галенофиллипт» | 2.0 | 2.0 | 0.2 | 0.2 | 2.0 | 2.0 |
| «Хлорофиллип» (раствор спиртовой 1%) | 8.0. | 4.0 | 1.5 | 1.3 | 4.8 | 5.0 |
| Бензилпенициллин | 15.0-60.0* | устойч. | 0.003-60.0 | 0.018-6.0 | устойч. | 1.2-12.0 |
| Эритромицин | 10.0-100.0* | устойч. | 0.1-100.0* | 0.1-5.0 | устойч. | 43.0 |
| Олеандомицин | устойч | устойч. | 0.3-100.0* | 1.0-20.0 | устойч. | устойч. |
| Стрептомицин | 0.5-100.0 | 0.5-200.0* | 0.5-200.0 | 1.0-200.0 | устойч. | 0.004-20.0 |
| Тетрациклин | 0.5-100.0* | 3.0-100.0* | 0.1-100.0* | 0.1-100.0 | устойч. | 1.0-2.5 |
| Левомицетин | 0.5-200.0* | 10.0-200.0* | 0.5-100.0* | 1.0-50.0 | устойч. | 0.8-5.0 |
| * - и более; второй интервал минимальных подавляющих концентраций антибиотиков приводится для устойчивых штаммов возбудителей заболеваний. |
| Таблица 4 | |||||||||||||
| Результаты посева тест-микроорганизмов при использовании препаратов «Галенофиллипт» и «Хлорофиллипт» (раствор спиртовой 1%) | |||||||||||||
| Тест-микроор- ганизмы | Разведение препарата | ||||||||||||
| Контроль | 1:10 | 1:20 | 1:50 | 1:100 | 1:200 | 1:500 | |||||||
| «. | |||||||||||||
| Галагено-филлипт | Хлоро-филлипт | Галагено-филлипт | Хлоро-филлипт | Галагено-филлипт | Хлоро-филлипт | Галагено-филлипт | Хлоро-филлипт | Галагено-филлипт | Хлоро-филлипт | Галагено-филлипт | Хлоро-филлипт | ||
| Е.Coli | +++ | - | - | -- | - | -- | - | - | ± | -- | + | --- | ++ |
| St.aureus | +++ | - | - | -- | - | -- | - | - | + | -- | ++ | --- | ++ |
| Ps.aeruginosa | +++ | - | - | -- | - | -- | ± | - | + | -- | ++ | --- | ++ |
| Вас.Subtilis | +++ | - | - | -- | - | -- | - | - | + | -- | ++ | --- | ++ |
| Вас.Cereus | +++ | - | - | -- | - | -- | - | - | + | -- | ++ | + | + |
| Грибы С.albicans | +++ | - | - | -- | - | -- | ± | - | + | -- | ++ | ++ | +++ |
| Обозначения: | |||||||||||||
| +++ - сплошной рост; ++ - рост в пределах 100 колоний; | |||||||||||||
| + - рост единичных колоний; ± - слабый или замедленный рост; | |||||||||||||
| - - отсутствие роста. |
| Таблица 5 | ||||
| Характеристика использованных тест-культур | ||||
| Тест-культура | Тип строения клеточной стенки | Представитель НМ или УПМ | Музейный штамм или клинический изолят | Устойчивость к неблагоприятным воздействиям внешней среды |
| Escherichia coli | Грациликутный | НМ | Музейный | умеренная |
| М-17 | ||||
| Klebsiella | Грациликутный | УПМ | Клинический | высокая |
| pneumonia | изолят | (капсулы) | ||
| Salmonella | Грациликутный | УПМ | Музейный | слабая |
| enteritidis | ||||
| Staphylococcus | Фирмикутный | УПМ | Музейный | умеренная |
| aureus 209 | ||||
| Lactobacillus | Фирмикутный | НМ | Музейный | умеренная |
| acidophilus | ||||
| D75 | ||||
| Lactobacillus | Фирмикутный | НМ | Музейный | умеренная |
| acidophilus | ||||
| D76 | ||||
| Candida | Дрожжевой | УПМ | Клинический | высокая |
| albicans | изолят |
| Таблица 6 | ||||||||||||
| Выживаемость микроорганизмов в присутствии сравниваемых препаратов в зависимости от концентрации препаратов и плотности микробной популяции | ||||||||||||
| Тест-культуры | Контроль | Галенофиллипт,% | Хлорофиллипт,% | |||||||||
| 0.02 | 0.05 | 0.1 | 0.25 | 0.5 | 0.0 | 0.05 | 0.1 | 0.25 | 0.5 | |||
| Escherichia coli M-17 | 8 | 8 | 1 | 1 | 1 | 1 | 8 | 3 | 9 | 1 | 1 | |
| 7 | 6 | 1 | 1 | 1 | 1 | 6 | 2 | 1 | 1 | 1 | ||
| 6 | 5 | 1 | 1 | 1 | 1 | 5 | 2 | 1 | 1 | 1 | ||
| 5 | 4 | 1 | 1 | 1 | 1 | 4 | 2 | 1 | 1 | 1 | ||
| 4 | 2 | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 | 1 | 1 | 1 | 1 | ||
| 3 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | ||
| Klebsiella pneumonia | 8 | 8 | 8 | 3 | 1 | 1 | 8 | 8 | 5 | 3 | 2 | |
| 7 | 7 | 7 | 2 | 1 | 1 | 7 | 7 | 4 | 2 | 1 | ||
| 6 | 6 | 6 | 1 | 1 | 1 | 6 | 6 | 4 | 2 | 1 | ||
| 5 | 5 | 4 | 1 | 1 | 1 | 5 | 4 | 3 | 2 | 1 | ||
| 4 | 4 | 3 | 1 | 1 | 1 | 4 | 3 | 3 | 2 | 1 | ||
| 3 | 3 | 2 | 1 | 1 | 1 | 3 | 3 | 2 | 1 | 1 | ||
| Salmonella enteritidis | 8 | 7 | 1 | 1 | 1 | 1 | 8 | 4 | 3 | 2 | 2 | |
| 6 | 5 | 1 | 1 | 1 | 1 | 5 | 3 | 2 | 2 | 1 | ||
| 4 | 3 | 1 | 1 | 1 | 1 | 3 | 2 | 2 | 1 | 1 | ||
| Staphylococcus aureus 209 | 8 | 8 | 1 | 1 | 1 | 1 | 8 | 5 | 3 | 2 | 2 | |
| 7 | 7 | 1 | 1 | 1 | 1 | 7 | 5 | 2 | 2 | 1 | ||
| 6 | 6 | 1 | 1 | 1 | 1 | 6 | 2 | 1 | 1 | 1 | ||
| 5 | 5 | 1 | 1 | 1 | 1 | 5 | 2 | 2 | 2 | 1 | ||
| 4 | 4 | 1 | 1 | 1 | 1 | 4 | 2 | 2 | 1 | 1 | ||
| 3 | 3 | 1 | 1 | 1 | 1 | 3 | 2 | 2 | 1 | 1 | ||
| Lactobacillus acidophilus D-75; | 7 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 3 | 2 | 1 | 1 | 1 | |
| 6 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 3 | 2 | 1 | 1 | 1 | ||
| 5 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 1 | 1 | 1 | ||
| 4 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 | 1 | 1 | 1 | 1 | ||
| 3 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 | 1 | 1 | 1 | 1 | ||
| Lactobacillus acidophilus D-76 | 8 | 8 | 1 | 1 | 1 | 1 | 8 | 5 | 3 | 2 | 2 | |
| 7 | 7 | 1 | 1 | 1 | 1 | 7 | 3 | 2 | 1 | 1 | ||
| 6 | 6 | 1 | 1 | 1 | 1 | 6 | 9 | 2 | 1 | 1 | ||
| 5 | 5 | 1 | 1 | 1 | 1 | 5 | 2 | 2 | 1 | 1 | ||
| 4 | 4 | 1 | 1 | 1 | 1 | 4 | 9 | 1 | 1 | 1 | ||
| 3 | 3 | 1 | 1 | 1 | 1 | 3 | 9 | 1 | 1 | 1 | ||
| Candida albicans | 8 | 8 | 7 | 1 | 1 | 1 | 8 | 7 | 5 | 3 | 2 | |
| 7 | 7 | 6 | 1 | 1 | 1 | 7 | 6 | 4 | 2 | 2 | ||
| 6 | 6 | 5 | 1 | 1 | 1 | 6 | 5 | 3 | 9 | 2 | ||
| 5 | 5 | 4 | 1 | 1 | 1 | 5 | 4 | 2 | 2 | 1 | ||
| 4 | 4 | 3 | 1 | 1 | 1 | 4 | 3 | 2 | 1 | 1 | ||
| 3 | 3 | 1 | 1 | 1 | 1 | 3 | 2 | 1 | 1 | 1 |
| Таблица 7 | |||||
| Клинические критерии эффективности сравниваемых препаратах в ожоговой ране - сроки заживления ожоговых ран у крыс, сутки (М±m) | |||||
| Экспериментальная группа | Ликвидация перифокальной реакции | Очищение раны (отторжение струпа) | Появление грануляции | Начало краевой эпителизации | Окончание заживления (полная эпителизация) |
| Контроль | 4.5±1.0 | 12.5±1.0 | 17.2±1.4 | 17.0±1.9 | 46.4±3.6 |
| «Дермазин» | 2.2±0.4 | 7.9±0.6* | 13.1±2.0 | 13.2±1.1 | 31.5±1.9* |
| «Хлорофиллипт» (раствор | 2.5±0.3 | 8.1±0.4* | 12.1±1.6 | 14.4±1.3 | 33.5±1.7* |
| спиртовой 1%) | |||||
| «Галенофиллипт» | 1.4±0.4* | 5.2±1.3* | 6.9±1.1* | 8.3±0.9* | 22.0±1.5* |
| *- достоверные отличия от контроля (р<0.05) |
| Таблица 8 | ||
| Процент полностью эпителизированных ожоговых ран при использовании сравниваемых препаратов | ||
| Экспериментальная | 25-й день наблюдений | 30-й день наблюдений |
| группа | ||
| Ожог без лечения - сухая стерильная повязка | 18% | 25% |
| «Дермазин» | 55% | 85% |
| «Хлорофиллипт» (раствор спиртовой 1%) | 50% | 79% |
| «Галенофиллипт» | 76% | 93% |
| Таблица 9 | |||
| Зоны задержки роста микроорганизмов (мм) при внесении в культуры дисков с исследуемыми препаратами | |||
| Микроорганизм | «Хлорофиллипт» (раствор спиртовой 1%) | «Галенофиллипт» | Превышение зоны задержки, % |
| Е.Coli | 18±2 | 22±3 | 22 |
| St.aureus | 15±1 | 17±4 | 13 |
| Ps.aeruginosa | 17±4 | 23±3 | 35 |
| Вас.Subtilis | 19±2 | 25±5 | 31 |
| Вас.Cereus | 13±2 | 23±3 | 77 |
| Грибы С.albicans | 9±2 | 15±4 | 67 |
| Таблица 10 | ||||
| Результаты посевов отделяемой ожоговой поверхности | ||||
| Экспериментальная серия | День после ожога | |||
| 2-й | 5-й | 10-й | 20-й | |
| Без лечения | +++ | ++ | ++ | ++ |
| «Дермазин» | ++ | ++ | - | - |
| «Хлорофиллипт» (раствор спиртовой 1%) | +++ | +++ | + | - |
| «Галенофиллипт» | +++ | ++ | - | - |
| где использованы обозначения: | ||||
| +++ - сплошной рост; | ||||
| ++ - рост в пределах 100 колоний; | ||||
| + - рост единичных колоний; | ||||
| - - отсутствие роста. |
Способ получения лекарственного препарата, содержащего медные аналоги хлорофилла, путем экстракции листьев эвкалипта прутовидного этанолом и последующей обработкой полученного экстракта солью меди, отличающийся тем, что экстракцию листьев эвкалипта прутовидного проводят 95-96%-ным этанолом в течение 1-2 сут без перемешивания при температуре (18-24)°С при массовом соотношении листьев эвкалипта прутовидного к этанолу 1:(5-6) с отстаиванием полученного продукта в течение 2-3 сут при температуре не выше (6-8)°С, его фильтрацией и последующей обработкой полученного экстракта солью меди в течение 6-24 ч при температуре (18-24)°С, при этом в качестве соли меди используют медь двухлористую 2-водную или 5-10%-ный спиртовой раствор меди двухлористой 2-водной при мольном соотношении хлорофилла, содержащегося в полученном экстракте, к меди двухлористой 2-водной 1:(3-4).
