Способ получения трансплантата для лечения сахарного диабета у собак и кошек и способ лечения сахарного диабета у собак и кошек
Изобретение относится к области ветеринарной медицины. Способ получения трансплантата включает извлечение поджелудочной железы, ее механическое измельчение, обработку диспергирующими растворами, повторное измельчение, промывку раствором Хенкса, помещение в культуральную среду и выделение β-клеток. При этом для извлечения поджелудочной железы используют 26±2-дневные плоды кроликов или 56±3-дневные плоды кошек или собак. Повторное измельчение поджелудочной железы проводят до размера 0,1-1,0 мм, в культуральную питательную среду добавляют 5-10% фетальной коровьей сыворотки, а выделение β-клеток осуществляют путем смены культуральной среды через каждые 3-4 дня на протяжении 10-14 дней культивирования. После чего полученные β-клетки отмывают от питательной среды и сыворотки раствором Хенкса и помещают в стерильный физиологический раствор. Способ лечения сахарного диабета включает трансплантацию им β-клеток поджелудочной железы. При этом для трансплантации используют трансплантат, полученный по описанному выше способу. Трансплантат путем 5-7 инъекций в дозе по 0,2 мл вводят собакам и кошкам непосредственно через брюшную стенку в паренхиму левой доли печени под контролем ультразвукового исследования. Изобретение позволяет трансплантировать β-клетки без иммуносупрессивной терапии реципиента, проводить ксеногенную (межвидовую) трансплантацию материала (кролик - собака, кролик - кошка) без применения иммуносупрессантов и без отторжения трансплантата. 2 с.п. ф-лы, 2 табл.
Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной медицины и клеточной биотехнологии, в частности к получению материала поджелудочной железы для трансплантации больным сахарным диабетом животным, и способ лечения сахарного диабета методом трансплантации.
В настоящее время актуальной является проблема лечения сахарного диабета у людей, однако, эта проблема остро стоит также в отношении животных, представляющих породную и продуктивную ценность, поэтому разработка эффективных способов лечения сахарного диабета животных является актуальной.
Известен способ получения клеточного материала, содержащего β-клетки от млекопитающих для трансплантации. Для этого полученную поджелудочную железу измельчают, обрабатывают диспергирующими растворами протеолитических ферментов (коллагеназа, трипсин) и после ресуспендирования помещают островки β-клеток в питательную среду с добавлением 5-10% плодной сыворотки коровы [1].
Известен также способ получения трансплантата, содержащего β-клетки поджелудочной железы для трансплантации больным сахарным диабетом людям и способ лечения сахарного диабета людей методом трансплантации. При этом для трансплантации больным сахарным диабетом используют поджелудочную железу новорожденного кролика, плода человека или другого млекопитающего. Промывают железу в растворе Хэнкса с добавлением антибиотиков, разрезают ее на фрагменты и засевают полученным материалом культуральные матрасы, добавляя культуральную (ростовую) среду и сыворотку млекопитающих, и обеспечивают режим, при котором β-клетки свободно мигрируют из культивируемых микрофрагментов поджелудочной железы на дно культурального матраса, для чего осуществляют инкубацию при температуре 35-40°С в продолжение от двух суток до шести недель с однократным или многократным снижением температуры до 4-25°С и выдержкой при пониженной температуре, а также с временным однократным или периодическим снижением концентрации сыворотки, затем собирают β- клетки со дна культурального матраса и получают материал для трансплантации.
Для лечения сахарного диабета людей проводят трансплантацию материала, содержащего β-клетки поджелудочной железы, полученные с использованием феномена миграции β-клеток, при этом материал может быть трансплантирован в различные органы и ткани: внутримышечно, в частности, в прямую мышцу живота, в печень (непосредственно в паренхиму или через воротную вену или ее ветви), в пульпу селезенки, в селезеночную вену, в полость брюшины, в специально создаваемый мышечный карман, в большой сальник [2].
В задачу наших исследований входило - получить трансплантат от животных, содержащий β-клетки поджелудочной железы с последующей трансплантацией животным, больным сахарным диабетом, направленной на нормализацию уровня глюкозы в крови, снижение дозы вводимого экзогенного инсулина и предотвращение сопутствующих течению сахарного диабета сосудистых осложнений.
Это удалось достичь благодаря тому, что в качестве материала были использованы поджелудочные железы плодов животных на сроках гестации - 26±2 дня для кроликов, 56±3 дня для собак, 56±3 дня для кошек. Извлеченные поджелудочные железы промывают раствором Хэнкса, механически измельчают, обрабатывают диспергирующими растворами, повторяют измельчение до размера 0,1-1 мм, промывают раствором Хэнкса и помещают в культуральную питательную среду с добавлением 5-10% фетальной коровьей сыворотки; далее через каждые 3-4 дня проводят смену среды до получения чистой культуры - 10-14 дней, после чего полученные β-клетки отмывают от питательной среды и сыворотки раствором Хэнкса и помещают в стерильный физиологический раствор; о качестве трансплантата судят по снижению уровня глюкозы в крови больного животного.
Полученный трансплантат вводят больным сахарным диабетом животным, преимущественно собакам и кошкам, непосредственно через брюшную стенку в паренхиму левой доли печени 5-7 уколов по 0,2 мл суспензии, под контролем ультразвукового исследования; о результатах выздоровления больного животного судят по снижению уровня глюкозы в крови до физиологической нормы.
Сущность предложенного способа получения трансплантата заключается в следующем: извлеченную поджелудочную железу помещают в раствор Хэнкса с антибиотиками. Удаляют капсулу, прослойки соединительной ткани с кровеносными сосудами и основными разветвлениями выводных протоков. Декапсулированную поджелудочную железу помещают в глубокое часовое стекло и разрезают на фрагменты размером 2-3 мм. Измельченный материал промывают раствором Хэнкса с антибиотиком. После этого фрагменты заливают 0,1-0,3% раствором коллагеназы на растворе Хэнкса при комнатной температуре на 10-15 мин, отмывают раствором Хэнкса и тщательно измельчают глазными ножницами на микрофрагменты размером 0,1-1 мм. Материал промывают средой 199 с 5-10% фетальной сыворотки и помещают в культуральный матрас. Смена среды 1 раз в 3-4 дня в течение 10-14 дней.
Способ лечения сахарного диабета животных заключается в следующем - перед трансплантацией больному животному проводят инсулиновую терапию, направленную на нормализацию уровня глюкозы в крови, за 3 дня до трансплантации β-клеток больному животному назначают терапию антикоагулянтными средствами. Перед трансплантацией кожу животного обрабатывают стандартно для ультразвукового исследования, выбривают, обрабатывают антисептиком, увлажняют. Общей анестезии и обездвиживания животного не проводят. Трансплантат, представляющий собой суспензию β-клеток в физиологическом растворе, набирают в шприц с длинной иглой с мандреном для спинномозговой пункции. Прокол брюшной стенки проводят левее белой линии на уровне конца мечевидного отростка грудины под контролем ультразвука. Иглой чрескожно и через мышечную брюшную стенку попадают в паренхиму левой доли печени и после удаления мандрена инъецируют трансплантат порциями по 0,2 мл в 5-7 точек. Иммуносупрессивной терапии после трансплантации не проводят. Контроль результатов трансплантации оценивают по снижению уровня глюкозы в крови до физиологической нормы и, соответственно, по снижению дозы вводимого инсулина.
Конкретные примеры отражены в таблицах.
| Табл.1. Изменения уровня глюкозы у клинических пациентов, выражается в ммоль/л | |||||||||||||||||
| До трансплантации | Сутки, после трансплантации | ||||||||||||||||
| -1 | 1 | 7 | 14 | 30 | 60 | 90 | 120 | 150 | 180 | 210 | 240 | 270 | 300 | 330 | 360 | ||
| Стафф. | 19,3 | 19 | 5,2 | 4,4 | 4,2 | - | 3,9 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Кот "М" | 44,3 | 7,8 | 6,4 | 4,2 | 3,7 | 6,6 | 4,4 | 4,1 | 3,8 | 3,7 | 4,7 | 4,6 | 3,9 | 4,6 | 4,5 | 5,8 | 4,1 |
| Англ.сеттер | 32,6 | 33 | 20 | 7,2 | - | 8 | 22 | 11 | 5,8 | 31 | 11 | 3,3 | 2,7 | - | - | - | - |
| Ирл.сеттер | 26,7 | 9,7 | 11 | 4,5 | 4,7 | 4,8 | 5,3 | 4,8 | 4,8 | 4,8 | 4,3 | 4,3 | 4,3 | - | - | - | - |
| Кот "К" | 20,9 | 5,1 | 4,1 | 5,7 | 4,1 | 5,2 | 4,5 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Ризен. | 21,3 | 12 | 15 | 20 | 11 | 16 | 8,3 | 13 | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Перс | 18,8 | 9,7 | 5 | 4,7 | 10 | 7,7 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Табл.2. Изменения доз вводимого экзогенного инсулина у клинических пациентов, выражается в мкИЕд | ||||||||||||||||
| Сутки, после трансплантации | ||||||||||||||||
| -1 | 1 | 7 | 14 | 30 | 60 | 90 | 120 | 150 | 180 | 210 | 240 | 270 | 300 | 330 | 360 | |
| Стафф. | 20 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Кот "М" | 10 | 0 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Англ.сеттер | 44 | 44 | 20 | 18 | 16 | 12 | 18 | 14 | 20 | 14 | 20 | 14 | ||||
| Ирл.сеттер | 30 | 30 | 30 | 16 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||||
| Кот "К" | 15 | 15 | 3 | 9 | 12 | 7 | 6 | 5 | ||||||||
| Ризен. | 40 | 40 | 15 | 40 | 28 | 30 | 36 | |||||||||
| Перс | 20 | 18 | 11 | 18 | 23 |
Техническая значимость предложенного способа получения трансплантата состоит в следующем:
- получаемый материал, содержащий β-клетки поджелудочной железы животных, не имеет «зрелых» антигенов видовой специфичности, что позволяет трансплантировать эти клетки без иммуносупрессивной терапии реципиента;
- благодаря отсутствию «узнаваемости» позволяет проводить ксеногенную (межвидовую) трансплантацию материала (кролик - собака, кролик - кошка) без применения иммуносупрессантов и без отторжения трансплантата.
Предложенный способ лечения сахарного диабета животных позволяет:
- неинвазинвным способом провести трансплантацию β-клеток поджелудочной железы животных чрезкожно, под контролем ультразвука в паренхиму печени, без общей анестезии, без обездвиживания животного, без лапаротомии;
- благодаря трансплантации β-клеток поджелудочной железы животных нормализовать уровень глюкозы в крови больных животных и, соответственно, значительно снизить дозы либо отказаться вообще от введения экзогенного инсулина;
- предотвратить развитие сопутствующих течению сахарного диабета сосудистых осложнений (нефропатий, ангиопатий, ретинопатий), приводящих к необратимым изменениям почек, слепоте, сосудистым нарушениям.
Предложенный способ получения трансплантата и способ лечения сахарного диабета животных апробирован нами в 2005-2006 гг. с положительными результатами в отделе клеточной биотехнологии ВНИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко РАСХН, на базе ветеринарной клиники «Биоконтроль» Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН и на базе Московской скорой ветеринарной помощи «Аверс-Вет».
Предложенный способ лечения найдет применение в области ветеринарной медицины для лечения сахарного диабета и позволит сохранить высокоценных животных.
Источники информации.
1. Petropavlovskaia M., Rosenberg L. Identification and characterization of small cells in the adult pancreas: potential progenitor cells? Cell Tissue Res. 2002 Oct; 310 (1):51-8.
2. Патент RU 2135193 C1, А61К 35/39, 1999 г.
1. Способ получения трансплантата для лечения сахарного диабета у собак и кошек, включающий извлечение поджелудочной железы, ее механическое измельчение, обработку диспергирующими растворами, повторное измельчение, промывку раствором Хенкса, помещение в культуральную среду и выделение β-клеток, отличающийся тем, что для извлечения поджелудочной железы используют 26±2-дневные плоды кроликов или 56±3 - дневные плоды кошек или собак, повторное измельчение поджелудочной железы проводят до размера 0,1-1,0 мм, в культуральную питательную среду добавляют 5-10% фетальной коровьей сыворотки, а выделение β-клеток осуществляют путем смены культуральной среды через каждые 3-4 дня на протяжении 10-14 дней культивирования, после чего полученные β-клетки отмывают от питательной среды и сыворотки раствором Хенкса и помещают в стерильный физиологический раствор.
2. Способ лечения сахарного диабета у собак и кошек, включающий трансплантацию им β-клеток поджелудочной железы, отличающийся тем, что для трансплантации используют трансплантат, полученный по п.1, который путем 5-7 инъекций в дозе по 0,2 мл вводят собакам и кошкам непосредственно через брюшную стенку в паренхиму левой доли печени под контролем ультразвукового исследования.
