Способ оценки ангиогенных факторов при химиотерапии рака молочной железы

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано при морфологических исследованиях для оценки эффективности неоадъювантной аутоплазмохимиотерапии больных раком молочной железы. Сущность изобретения заключается в том, что после удаления опухоли оценку эффективности проводят, определяя экспрессию ангиогенного фактора VEGF в цитоплазме опухолевых и эндотелиальных клеток удаленного операционного материала. Снижение экспрессии VEGF как в опухолевых клетках, так и на эндотелии сосудов, свидетельствует о снижении ангиогенного потенциала опухоли под воздействием указанной химиотерапии. 4 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано при морфологических исследованиях для оценки ангиогенных факторов эффективности неоадъювантной аутоплазмохимиотерапии больных раком молочной железы.

Известно, что по мере увеличения опухоли в размерах ее центральный участок попадает в условия гипоксии, что является стимулом к выработке сосудистых факторов роста. Когда размер опухоли достигает определенного критического значения (0,5-2 мм), кровоснабжение опухоли из рядом лежащих сосудов становится невозможным. Прекращается доставка кислорода и питательных веществ.

В ответ на это опухоль начинает секретировать фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), который воздействует на лежащие рядом кровеносные сосуды и стимулирует их рост по направлению к опухоли, что необходимо для ее дальнейшего роста. Было показано, что VEGF индуцирует процесс неоваскуляризации в злокачественных опухолях по аутокринному механизму действия (см. Gordon M.S., Margolin К., Talpaz G. et al. Phase I safety and pharmacokinetics study of recombinant human antivascular endothelial growth factor in patients with advanced cancer // J. Clin. Oncol. 2001. 19. P.843-50). VEGF признан в настоящее время в качестве одного из важнейших факторов, регулирующих процессы неоваскуляризации при росте опухолей (см. Kim K.J., Li В., Winer J. et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor induced angiogenesis supress tumor growth in vivo // Nature 1993. 362. P.841-844).

Высокий уровень VEGF ассоциируется с неблагоприятным прогнозом, повышенным риском развития рецидива опухоли и метастазирования у пациентов с различными онкологическими заболеваниями. Антитела к VEGF блокируют поступающие из опухоли сигналы, которые необходимы для роста сосудов. В результате прекращения поступления питательных веществ и кислорода опухоль перестает расти. Т.о., VEGF занимает позицию главного митогена эндотелиальных клеток, и его присутствие требуется для образования незрелых сосудов при васкулогенезе или неоангиогенезе.

В экспериментальных моделях рака молочной железы у животных показано, что эстрогены индуцируют экспрессию VEGF, в то время как ингибиторы ароматазы оказывают противоположный эффект (см. Traina Т., Dickler M. A feasibility study of an aromatase inhibitor, letrozole and the antibody to vascular endothelial growth factor, bevacizumab, in patients with hormone receptor-positive metastatic breast cancer // J Clin Oncol. 2005. 23 (16S) Part I: abstr. P.796). Выдвинута гипотеза, согласно которой эстрогениндуцированная экспрессия VEGF способствует росту рака молочной железы, и, следовательно, антиэстрогенная терапия (ингибиторы ароматазы) в комбинации с Авастином может быть эффективной при этом заболевании.

Однако для четкой визуализации эндотелиальных клеток необходимо иммуногистохимическое исследование. Для различия клеток кровеносных и лимфатических сосудов в последние годы описываются новые маркеры: наряду с поверхностными антигенами эндотелиальных клеток (CD31) в этой связи имеют значение рецепторы крово- и лимфоангиогенных факторов VEGF-A, -В, -С и -D.

Обычно первый этап прогрессии опухолей - это врастание в первичный узел сосудов. Этот процесс обозначается терминами "васкуляризация" или "ангиогенез". В первичный узел сосуды не прорастают, пока клетки эндотелия (внутреннего слоя) сосудов не получают от опухоли соответствующих сигналов. Ангиогенез начнется тогда, когда в опухоли произойдет изменение в геноме, ведущее к включению гена, который отвечает за синтез сигнальных белков. Такими белками, посылающими эндотелию сосудов сигнал к росту, является VEGF (фактор роста эндотелия сосудов). Этот белок, будучи секретируемым клетками опухолей, контактирует со своими рецепторами на поверхности клеток эндотелия сосудов и передает им сигнал к росту. Клетки начинают делиться и врастать в ткань опухоли, формируя в ней капиллярную сеть. В результате начинается активное кровоснабжение опухоли и снимается ограничение ее роста.

Опухоли способны синтезировать целый ряд ангиогенных факторов роста, то есть таких, которые стимулируют образование кровеносных сосудов. Наиболее известный и распространенный среди них - так называемый васкулярный эндотелиальный фактор роста (VEGF). Именно он и заставляет кровеносную систему организма закладывать новые сосуды, пронизывающие опухоль и образующие в ней разветвленную сеть.

Плотность микрососудов, которая отражает количество/объем развития кровеносных сосудов (образования новых сосудов), от которого зависит рост опухоли, значительно больше в ткани, пораженной раком, чем в здоровой, и она находится в определенном соотношении с распространением опухоли.

В опухоли существуют две основные группы клеток, которые определяют интенсивность роста микрососудов - это опухолевые клетки, которые выделяют стимуляторы и/или ингибиторы ангиогенеза, и нормальные стромальные клетки (фибробласты, лимфоциты, эндотелиальные клетки и т.п.). Они либо также могут стимулировать и/или ингибировать ангиогенез (фибробласты, лимфоциты), либо сами являются непосредственной мишенью для выделяемых факторов (эндотелиальные клетки). Обе группы находятся в динамическом взаимодействии. Экспрессия определенных модуляторов ангиогенеза в опухолевых клетках приводит к изменению фенотипа в эндотелиальных клетках. Тогда как недостаток в питательных веществах и гипоксия из-за небольшого количества микрососудов в опухоли приводит к усилению экспрессии ангиогенных стимуляторов в опухолевых и стромальных клетках.

Следующий источник информации, касающийся действия таргетных препаратов, применимых у больных, опухоли которых содержат конкретные мишени для воздействия этих препаратов, мы взяли в качестве прототипа изобретения (см. Руководство по химиотерапии опухолевых заболеваний. Под ред. Н.И.Переводчиковой. М., 2005).

Известно, что неоангиогенез - важнейший этап канцерогенеза, возможная мишень таргетной терапии. Ингибиторы ангиогенеза исследуются в качестве противоопухолевых средств. На стадии исследования бевацизумаб - МКА (молекулярно-нацеленные препараты к рецепторам VEGF при раке молочной железы, раке почки). Применение этого препарата разрешено в США при метастатическом колоректальном раке в комбинации с фторурацилом и принотеканом. Изучается противоопухолевое действие ингибитора ЦОГ-2 целекоксиба, который испытывался при некоторых опухолевых заболеваниях, в частности, при колоректальном раке и раке молочной железы.

Однако эти препараты не нашли практического применения в настоящее время.

В данной работе мы оценили экспрессию ангиогенного фактора VEGF в опухолевых и эндотелиальных клетках в ткани рака молочной железы после проведения неоадъювантной аутоплазмохимиотерапии и провели анализ взаимосвязи между VEGF на опухолевых и эндотелиальных клетках.

Целью изобретения является оценка ангиогенеза опухоли как прогноз течения заболевания и чувствительности к противоопухолевой аутоплазмохимиотерапии.

Поставленная цель достигается тем, что после проведения неоадъювантной аутоплазмохимиотерапии проводят иммуногистохимическое исследование результатов лечения, оценивают ангиогенез в цитоплазме опухолевых и эндотелиальных клеток, выявляют подавление ангиогенеза, выражающееся в снижении экспрессии ангиогенного фактора - VEGF, экспрессию VEGF на эндотелиальных клетках микрососудов опухоли обнаруживают в 55% случаев, регистрируют одновременную экспрессию фактора VEGF в эпителиальных и эндотелиальных клетках, эти показатели свидетельствуют о снижении злокачественного потенциала в опухоли, подтвержденного клиническим эффектом.

Изобретение «Способ оценки ангиогенных факторов при химиотерапии рака молочной железы» является новым, так как оно неизвестно в области онкологии при морфологических исследованиях для оценки результатов лечения неоадъювантной аутоплазмохимиотерапии больных раком молочной железы.

Новизна изобретения заключается в том, что впервые при иммуногистохимическом исследовании на основе ангиогенеза оценивают результаты аутоплазмохимиотерапии больных раком молочной железы в предоперационном периоде, выявляют подавление ангиогенеза, выражающееся в снижении экспрессии ангиогенного фактора - VEGF, экспрессию VEGF на эндотелиальных клетках микрососудов опухоли обнаруживают в 55% случаев, регистрируют одновременную экспрессию фактора VEGF в эпителиальных и эндотелиальных клетках, эти показатели свидетельствуют о снижении злокачественного потенциала в опухоли, подтвержденного клиническим эффектом.

Изобретение «Способ оценки ангиогенных факторов при химиотерапии рака молочной железы» является промышленно применимым, так как может быть использовано в медицинских учреждениях онкологического профиля, научно-исследовательских онкологических институтах, онкодиспансерах.

Пример конкретного применения «Способа оценки ангиогенных факторов при химиотерапии рака молочной железы»

Нами был исследован патоморфоз опухолей молочной железы под влиянием аутоплазмохимиотерапии и исследованы молекулярные механизмы ангиогенеза с использованием сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF, участвующего в регуляции образования и роста новых сосудов.

Нами были взяты две группы больных по 20 человек: - группа АПХТ - больные после предоперационной аутоплазмохимиотерапии и контрольная группа - больные, которым первым этапом лечения была выполнена радикальная мастэктомия.

Морфологическому исследованию подвергся удаленный операционный материл - молочная железа с регионарными лимфатическими узлами. При гистологическом и морфометрическом исследовании на световом уровне определяли гистологический характер опухоли, изменение структуры опухоли под действием введения химиопрепаратов на аутоплазме, соотношение стромы, паренхимы после лечения, индекс повреждения паренхимы, митотическую активность, дистрофические изменения в раковых клетках.

Проведенное морфологическое исследование свидетельствовало о более выраженном регрессе раковых опухолей молочных желез, наступающем под действием химиопрепаратов, введенных на аутоплазме, в 60% случаев после проведения АПХТ отмечено достижение лечебного патоморфоза.

После АПХТ в большинстве опухолей отмечались дистрофические изменения в раковых клетках, располагавшихся мелкими островками или одиночно, среди стромы и участков выраженного фиброза и гиалиноза встречались комплексы гигантских гиперхромных многоядерных клеток. Кроме того, часто обнаруживались отложения извести в протоках и среди соединительной ткани. После гистологического исследования в группе АПХТ в некоторых случаях наблюдался полный регресс клинически определяемых до начала лечения метастазов в регионарных лимфоузлах, а в оставшихся метастатических узлах произошла резкая регрессия, выражавшаяся в наличии единичных опухолевых клеток среди лимфоидной ткани и участков склероза, отложением бесструктурных эозинофильных масс и солей извести на месте метастаза.

Данные световой микроскопии подтвердились морфометрическими исследованиями.

Соотношение структурных компонентов опухоли в группе АПХТ свидетельствовало о достоверно большем перевесе в сторону соединительной ткани (р≤0,05) по сравнению с контрольной группой, в группе АПХТ она составила 84,4±6,9%. Площадь, занятая сохранившимися опухолевыми клетками в группе АПХТ, составила 14,4±0,8%, что в 2,5 больше, чем в контрольной группе, где она равнялась 36,6±4,2%. В результате индекс повреждения опухоли был 60,7%.

Количество дистрофически измененных клеток после АПХТ было достоверно выше, чем в контрольной группе, в 2,5 раза.

Митотическая активность опухолей молочной железы в группе АПХТ достоверно отличается от контрольной группы и находится на очень низком уровне.

Следует отметить преобладание очагов некрозов в контрольной группе по сравнению с группой АПХТ в 2,2 раза. Учитывая, что обратная закономерность наблюдалась в отношении площадей, занятых паренхимой и стромой опухоли, можно предполагать, что при химиотерапии на аутоплазме быстрее происходит резорбция некротически измененных тканей из опухоли и замещение ее соединительнотканным компонентом.

Солидные опухоли требуют кровоснабжения для своего роста, и многие новые концепции лечения онкологических заболеваний направлены на подавление васкуляризации опухоли.

В контрольной группе экспрессия VEGF была выявлена в цитоплазме опухолевых клеток в 80% (16 из 20) опухолях молочной железы. У 9 из 16 больных (56,2%) мы наблюдали окрашивание более 60% опухолевых клеток антителами к VEGF, у 3 (18,8%) - 50%, у 2 (12,5%) - 40%, и у 2 (12,5%) всего 30% опухолевых клеток воспринимали окраску к VEGF.

В зависимости от гистологического строения опухоли мы наблюдали положительную экспрессию VEGF на опухолевых клетках (VEGF_{опухоль}+): в 11 случаев из 14 инфильтрирующего протокового рака, 3 случая из 4 инфильтрирующего долькового рака и в обоих случаях папиллярного рака.

Мы также оценили экспрессию VEGF на эндотелиальных клетках микрососудов опухоли. Экспрессия VEGF на эндотелиальных клетках сосудов (VEGF_сосуды+) была обнаружена в 95% случаев (19 из 20) рака молочной железы этой группы.

Данные о совместной экспрессии сосудистого эндотелиального фактора роста на опухолевых клетках и клетках эндотелия сосудов представлены в таблице 1.

Таблица 1
Совместная экспрессия VEGF на опухолевых и эндотелиальных клетках рака молочной железы контрольной группы
Фенотип опухоли	VEGFсосуды-	VEGFсосуды+
VEGFопухоль-	1 (5%)	3 (15%)
VEGFопухоль+	0	16 (80%)

Как видно из приведенных данных, полное отсутствие экспрессии VEGF было отмечено всего в 5% случаев, а одновременная экспрессия этого фактора эпителиальными и эндотелиальными клетками, напротив, встречалась в 80% наблюдений. В 3 случаях мы отмечали окраску антителами к VEGF эндотелия сосудов при отсутствии окрашивания опухолевых клеток. Ни разу не было отмечено отсутствия экспрессии VEGF на эндотелии при экспрессии его опухолевыми клетками.

У данной группы больных, не подвергавшихся предоперационной химиотерапии, мы оценивали связь между экспрессией VEGF и поражением регионарных лимфоузлов.

Нами также была обнаружена связь между экспрессией VEGF в опухолевых клетках и поражением регионарных лимфоузлов: все 12 больных, имеющие гистологически подтвержденные метастазы в лимфоузлы, имели иммуногистохимический фенотип РМЖ - VEGF_{опухоль}+.

Необходимо отметить, что VEGF_{опухоль}+ раки с метастазами в подключичные лимфоузлы имели более интенсивную окраску цитоплазмы опухолевых клеток и больший процент клеток, окрашенных антителами, а именно, во всех 6 случаях было окрашено 60% опухолевых клеток, что, как мы полагаем, может косвенно свидетельствовать о повышенной количественной продукции опухолевыми клетками эндотелиального фактора роста на более поздних стадиях рака молочной железы (в нашем случае IIIC стадия рака молочной железы с поражением подкрыльцово-подлопаточно-подключичных лимфоузлов).

В данной группе больных экспрессия VEGF опухолью зависела от степени дифференцировки опухоли: все 13 низкодифференцированных опухолей экспрессировали фактор роста эндотелия сосудов и 3 из 7 умереннодифференцированных опухолей были VEGF_{опухоль}+.

Мы также оценили экспрессию VEGF в зависимости от размера опухолевого узла. Полученные данные отражены в таблице 2.

Таблица 2
Частота экспрессии ангиогенных факторов в зависимости от размера опухоли в контрольной группе (абс. (%), n=20)
Ангиогенный фактор	Размер опухоли
<2 см	2-5 см	>5 см
VEGFопухоль+	6 (30%)	5 (25%)	5 (25%)
VEGFопухоль-	0	1 (5%)	3 (15%)

Так, из 16 положительных по экспрессии VEGF опухолей 6 были менее 2 см в диаметре, от 2 до 5 см и более 5 см были положительны по экспрессии по 5 опухолей. Таким образом, положительная экспрессия опухолевыми клетками VEGF не зависела от размера опухолевого узла в контрольной группе. В нашем исследовании не было выявлено ни одной опухоли с фенотипом VEGF_{опухоль} - меньше 2 см в диаметре, тогда как опухолей диаметром больше 5 см с данным фенотипом было большинство.

В группе АПХТ экспрессия VEGF в цитоплазме опухолевых клеток была выявлена в 35% (7 из 20) случаев рака молочной железы. У 2 больных (28,6%) мы наблюдали 50% опухолевых клеток, окрашенных антителами к VEGF, у 2 больных (28,6%) - 40% и у 3 больных (42,8%) было окрашено всего 30% опухолевых клеток. Нами также отмечено снижение интенсивности окрашивания цитоплазмы опухолевых клеток к VEGF в 5 из 7 случаев рака молочной, что мы объясняем выраженным повреждением паренхимы опухоли под действием аутоплазмохимиотерапии, а также нарастанием дистрофически измененных клеток в оставшейся опухоли и снижением их митотической активности.

Мы не заметили связи между гистологическим типом рака и экспрессией опухолевыми клетками VEGF. 5 из 14 опухолей инфильтрирующего протокового рака были положительными по экспрессии VEGF и по 1 случаю инфильтрирующего долькового и папиллярного рака были VRGF_{опухоль}+.

На эндотелиальных клетках микрососудов опухоли экспрессия VEGF была обнаружена в 55% случаев (11 из 20) рака молочной железы, при этом в большинстве случаев (45%) экспрессия фактора отсутствовала как в клетках опухоли, так и на эндотелии сосудов, в 20% случаев опухоль по фенотипу соответствовала VEGF_{опухоль}-/VEGFсосуды+ и в 35% случаев зарегистрирована одновременная экспрессия фактора в эпителиальных и эндотелиальных клетках (табл.3). Иммуногистохимического фенотипа VEGF_{опухоль}+/VEGF_сосуды- в этой группе, как и в предыдущих, отмечено не было.

Таблица 3
Совместная экспрессия VEGF на опухолевых и эндотелиальных клетках рака молочной железы после АПХТ
Фенотип опухоли	VEGFсосуды-	VEGFсосуды+
VEGFопухоль-	9 (45%)	4 (20%)
VEGFопухоль+	0	7 (35%)

Мы оценили связь между экспрессией опухолевыми клетками сосудистого эндотелиального фактора роста и размером опухолевого узла. Полученные данные представлены в таблице 4.

Таблица 4
Частота экспрессии ангиогенных факторов после АПХТ в зависимости от исходного размера опухоли (абс. (%), n=20)
Ангиогенный фактор	Размер опухоли
<2 см	2-5 см	>5 см
VEGFопухоль+	5 (25%)	2 (10%)	0
VEGFопухоль-	3 (15%)	4 (20%)	6 (30%)

Из представленной таблицы видно, что положительными по экспрессии опухолью сосудистого эндотелиального фактора роста в преобладающем большинстве были опухоли меньше 2 см, тогда как опухоли с фенотипом VEGF_{опухоль}+ больше 5 см мы не наблюдали ни одной. Напротив, отсутствие экспрессии опухолевыми клетками VEGF в большинстве случаев наблюдалось, когда диаметр опухоли превышал 5 см.

Количественная оценка внутриопухолевой микрососудистой сети в раке молочной железы, выявленная нами при иммуногистохимическом исследовании с помощью антител CD31, позволила нам качественно оценить процесс ангиогенеза в каждой из исследуемых групп.

В контрольной группе микрососудистое русло внутри опухоли было представлено капиллярами от 2,3 до 44,4 мкм в диаметре. В одном поле зрения, в среднем, мы наблюдали 7,8 сосуда. Средний диаметр всех сосудов, окрашенных антителами CD31, был равен 5,6±0,7 мкм.

В группе АПХТ мы наблюдали выраженные изменения внутриопухолевой микрососудистой плотности, что выражалось в уменьшении почти в 2 раза по сравнению с контролем количества окрашенных антителами сосудов и составило для опухолей данной группы - 4,1 сосуда в 1 поле зрения. Вырос практически в 1,7 раза по сравнению с группой контроля средний диаметр определяемых сосудов - до 9,2±0,7 мкм. В группе АПХТ мы наблюдали сосуды от 4,1 до 44,6 мкм. Возрастание среднего диаметра сосудов мы объясняем тем, что в опухоли отсутствовали сосуды минимального диаметра, которые мы наблюдали в контрольной группе.

После АПХТ достоверное уменьшение количества сосудов в поле зрения по сравнению с контрольной группой произошло за счет исчезновения сосудов наименьшего диаметра, которые, по нашему мнению, являются незрелыми, нестабильными, с активно пролиферирующим эндотелием, необходимым для их роста, на который так же, как и на опухолевую клетку, но в меньшей степени действует химиопрепарат, вызывая его гибель.

Также более выраженные изменения, касающиеся опухолевого ангиогенеза после АПХТ, мы объясняем существенным регрессом опухолей молочной железы, наступающим под действием химиопрепаратов, введенных на аутоплазме, а именно, в большинстве опухолей отмечались значительные дистрофические изменения в раковых клетках, и происходила гибель большей доли паренхимы опухоли, что привело к снижению продукции опухолевыми клетками сосудистого эндотелиального фактора роста и, как следствие, к отсутствию процесса образования в опухолях новых незрелых сосудов малого диаметра.

Таким образом, проведенное разностороннее исследование рака молочной железы под влиянием химиотерапии на аутоплазме выявило связь между традиционными проявлениями морфологических признаков лекарственного патоморфоза и молекулярно-биологическими особенностями ангиогенеза.

Технико-экономическая эффективность

«Способа оценки ангиогенных факторов при химиотерапии рака молочной железы» заключается в том, что проведенное морфологическое исследование свидетельствует о более выраженном регрессе раковых опухолей молочных желез, наступающем под действием препаратов, введенных на аутоплазме. В 60% случаев после проведения АПХТ отмечено достижение III и IV степени лечебного патоморфоза. Наиболее выраженные изменения процессов ангиогенеза происходили в опухолях, подверженных неоадъювантной АПХТ. Эти изменения затрагивали как уменьшение экспрессии опухолью сосудистого эндотелиального фактора роста, так и снижение микрососудистой плотности в самой опухоли. Так, в группе АПХТ, соответственно, в 1,9 раза по сравнению с контрольной группой снизилось количество сосудов, определяемых в одном поле зрения. Кроме того, после АПХТ достоверное уменьшение количества сосудов в поле зрения по сравнению с контрольной группой произошло за счет исчезновения сосудов наименьшего диаметра, которые, по нашему мнению, являются незрелыми, нестабильными, с активно пролиферирующим эндотелием, необходимым для их роста, на который так же, как и на опухолевую клетку, но в меньшей степени действует химиопрепарат, вызывая его гибель.

Также более выраженные изменения, касающиеся опухолевого ангиогенеза после АПХТ, мы объясняем существенным регрессом опухолей молочной железы, наступающим под действием химиопрепаратов, введенных на аутоплазме, а именно, в большинстве опухолей отмечались значительные дистрофические изменения в раковых клетках, и происходила гибель большей доли паренхимы опухоли, что привело к снижению продукции опухолевыми клетками сосудистого эндотелиального фактора роста и, как следствие, к отсутствию процесса образования в опухолях новых незрелых сосудов малого диаметра.

Кроме того, в группе АПХТ уменьшение количества сосудов в поле зрения происходило за счет исчезновения и уменьшения количества сосудов наименьшего диаметра, которые, по нашему мнению, являются незрелыми, нестабильными, с активно пролиферирующим эндотелием, необходимым для их роста, на который так же, как и на опухолевую клетку, но в меньшей степени действует химиопрепарат, вызывая его гибель.

Таким образом, проведенное иммуногистохимическое исследование, выявившее снижение экспрессии VEGF как в опухолевых клетках, так и на эндотелии сосудов и, как следствие, уменьшение внутриопухолевой микрососудистой плотности, свидетельствует о снижении ангиогенного потенциала опухоли под воздействием химиотерапии на естественной среде организма - плазме.

Способ оценки эффективности химиотерапии рака молочной железы путем оценки ангиогенных факторов, отличающийся тем, что для оценки эффективности неоадъювантной химиотерапии определяют экспрессию ангиогенного фактора VEGF в цитоплазме опухолевых и эндотелиальных клеток удаленного операционного материала.