Способ контроля распространения и устойчивости биологических примесей белковой природы в окружающей среде
Владельцы патента RU 2354704:
Федеральное государственное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации" (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для изучения процессов распространения биопатогенов в окружающей среде, исследования проникающей способности веществ белковой природы в элементы водоочистных сооружений и прогнозирования устойчивости белковых загрязнений в водной среде и на поверхностях объектов окружающей среды. Способ контроля распространения и устойчивости биологических примесей белковой природы в окружающей среде предусматривает нанесение биотрассера с льдообразующей активностью на исследуемый объект и регистрацию указанной активности в пробах, отобранных в различных пространственно-временных точках. В качестве материала биотрассера используют очищенную белковую субстанцию с льдообразующей активностью, полученную из клеток бактерий Erwinia herbicola, Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens. Применение изобретения позволяет характеризовать распространение и стабильность в окружающей среде веществ, подобных белковым токсинам и различающихся молекулярной массой и устойчивостью к действию инактивирующих факторов среды (исследуемого материала). 2 ил., 5 табл.
Изобретение относится к биотрассерам - веществам, предназначенным для изучения процессов распространения и инактивации биопатогенов в окружающей среде, и может быть использовано, в частности, для исследования проникающей способности вредных (опасных) веществ белковой природы через фильтрующие элементы водоочистного оборудования (сооружений), прогнозирования устойчивости белковых загрязнений в водной среде и на поверхностях объектов окружающей среды.
Уже известно применение в качестве биотрассеров препаратов, представляющих суспензии клеток (спор) S. marcescens, E.coli, В. subtilis и некоторых других (СП 1.3.1285-03 Безопасность работы с микроорганизмами I-П групп патогенности (опасности): Санитарные правила. - М.: Информ. - изд. центр Госкомсанэпиднадзора Минздрава России, 2003; Основы техники безопасности в микробиологических вирусологических лабораториях / С.Г.Дроздов, Н.С.Гарин, Л.С.Джиндоян, В.М.Тарасенко. - М.: Медицина, 1987).
Недостатком данных веществ является необходимость количественного определения с помощью стандартной бактериологической методики, предполагающей подсчет числа колоний, выросших на поверхности плотной питательной среды (ППС) после высева соответствующих разведений.
Использование бактериологической методики имеет недостатки, заключающиеся в длительности процесса анализа за счет продолжительного инкубирования проб на чашках с плотной питательной средой, в необходимости использования комплекса специализированного дорогостоящего микробиологического оборудования.
Другим недостатком данных веществ (биотрассеров на основе бактерий вегетативной природы) является низкая стабильность в окружающей среде.
Для биотрассера на основе Е. coli недостатком является сложность дифференциации колоний на плотной питательной среде от колоний, образуемых иными бактериями.
Наиболее близким является метод с использованием биологического трассера, который предназначен для характеристики движения материала в грунтовых, поверхностных водах, жидкостях от бурения, грязевых породах от бурения, производных глины, сланца и карстовых отложений, в песке и смесях (Пат. США №5, 807, 697 Biological tracer method / Strong-Gunderson et al. - 15.09.1998). Биотрассер представляет собой жидкое или порошкообразное вещество на основе живых или убитых бактерий Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens или Erwinia herbicola, обладающих способностью кристаллизовать переохлажденную воду за счет продуцирования белковых комплексов, формирующих центры нуклеации (ЦН).
Биотрассер в отличие от трассеров небиологической природы (радиоактивные трассеры, трассеры-красители) позволяет моделировать распространение биологических примесей, характеризуется удобством в применении, достаточной для проведения исследований стабильностью в окружающей среде.
Отработаны методы, обеспечивающие обнаружение даже единичных ЦН в исследуемых пробах. С этой целью в рассматриваемом методе используется методика количественного обнаружения ЦН (Vali G. Qualitative evaluation of experimental results on the heterogeneous freezing nucleation of supercooled liquids // J. Atmos. Sci. - 1971. - Vol.28. - P.402-409), которая заключается в подсчете относительного числа кристаллизующихся при определенной температуре переохлаждения микрокапель разведения исследуемой пробы, нанесенных на парафинированную поверхность кюветы, размещаемой на плаву на поверхности хладагента, и использовании зависимости концентрации ЦН от доли замерзающих микрокапель, подчиняющейся распределению Пуассона.
Метод имеет недостаток, заключающийся в том, что с его помощью может быть изучено движение только загрязнителей бактериальной природы.
Другим недостатком данного вещества является возможность размножения живых бактерий, входящих в состав биотрассера, в благоприятных для них условиях, что влечет за собой искажение результатов исследований.
Не лишена недостатков и методика количественного определения ЦН в пробах. Размещение кювет на плаву на поверхности хладагента сопровождается воздействием паров хладагента на содержимое микрокапель, приводит к снижению доли замерзших капель и требует от оператора применения средств защиты от испарений и капель хладагентов, которые сказываются на точности анализа и удобстве при выполнении.
Задачей изобретения является разработка биотрассера, предназначенного для изучения процессов распространения и устойчивости биологических примесей белковой природы, подобных бактериальным токсинам, в окружающей среде и прогнозирования устойчивости белковых загрязнений в водной среде и на поверхностях или в объеме объектов окружающей среды.
Поставленная задача решается благодаря тому, что в биотрассере, предназначенном для контроля распространения и устойчивости биологических примесей белковой природы в окружающей среде, вместо живых или убитых бактерий Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens или Erwinia herbicola содержатся продуцируемые ими белки, инициирующие льдообразование (БИЛ), выделенные биотехнологическими методами из культуральной жидкости.
Существенными признаками, характеризующими изобретение и обеспечивающими получение технического результата, являются следующие:
- использование микроорганизмов-продуцентов БИЛ, например Erwinia herbicola, Pseudomonas syringae или Pseudomonas fluorescens. Данные бактерии продуцируют в значительных количествах белковые комплексы классов В и С, инициирующие кристаллизацию переохлажденной воды при температуре от минус 5°С и ниже, представляющие собой глобулярные образования из нескольких субъединиц, имеющие молекулярную массу от 150 до 150000 килодальтон, изоэлектрическую точку в кислой зоне рН, что аналогично ботулиническому нейротоксину. (Виноградова И.Д., Уварова Р.Н., Иванов К.К. и др. Получение нейротоксина и гемагглютинина CL botulinum типа А и характеристика нейротоксина //Биохимия. - 1983. - т.48, вып.5. - С.788-795; Govindarajan A.G., Lindow S.E. Size of bacterial ice nucleation sites measured in situ by radiation inactivation analysis// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1988. - Vol.85, - P.1334-1338; Formation of Bacterial Membrane Ice-Nucleating Lipoglicoprotein Complex / L.M.Kozloff, M.A.Turner, F.Arellano //J. Bacteriol. - 1991. - Vol.173, №20. - P.6528-6536; Surface properties and size of the ice nucleation site in ice nucleation active bacteria: Theoretical considerations / M.J.Burke, S.E.Lindow// Cryobiology. - 1990. - Vol.27, №1. - P.80-84);
- выделение БИЛ в качестве биотрассера из культуральной жидкости продуцентов в виде суспензии (белковой пасты);
- применение метода количественного обнаружения БИЛ, основанного на определении в исследуемой пробе ЦН переохлажденной воды, формируемых белками этого типа;
- использование усовершенствованной методики капельного замораживания для количественного определения ЦН в пробах, суть которой заключается в подсчете относительного числа кристаллизующихся микрокапель ряда серийных разведений исследуемых проб при определенной температуре переохлаждения (температуре анализа), использовании известной зависимости концентрации ЦН от доли замерзающих микрокапель, подчиняющейся распределению Пуассона, с последующим расчетом концентрации ЦН, соответствующей 50-процентному эффекту кристаллизации;
- использование рациональной температуры анализа ряда серийных разведений исследуемых проб, находящейся в интервале от минус 5°С до минус 11°С, так как при этой температуре чистая вода и разбавленные растворы солей, не содержащие гетерогенных ядер нуклеации, в микрокаплях сохраняются в переохлажденном состоянии продолжительное время. Высокомолекулярные БИЛ класса В регистрируются при температуре минус 5°С и ниже. С понижением температуры анализа обеспечивается регистрации белков, имеющих меньшую молекулярную массу. БИЛ класса С регистрируются при температуре минус 7°С и ниже. С уменьшением молекулярной массы БИЛ увеличивается их устойчивость к инактивирующим факторам внешней среды (Some basic characteristics of bacterial freezing nuclei / S.A.Yankofsky, Z.Legin, T.Bertold, N.Sandlerman //J. Appl. Meteorol. - 1981. - Vol.20. - P.1013-1019). Водорасторимые абиогенные ЦН при данной температуре активности, как правило, не проявляют (Fletcher N.H. Active Sites and ice crystal nucleation// J. Atmos. Sci. - 1969. - Vol.26, №6. - P.1266-1271; Supercooling and heterogeneous nucleation of freezing in tissues of tender plant / H.Marcellos, W.V.Single // Cryobiology. - 1979. - Vol.16. - P.74-77);
- использование криостата с регулируемой температурой, обеспечивающего охлаждение и термостабилизацию рабочей поверхности с точностью ±0,1°С в интервале температур от минус 5°С до минус 11°С при отсутствии вибрации рабочей поверхности.
Известно, что к числу наиболее важных требований, предъявляемых к биологическому трассеру, относят безвредность для человека и животных, относительную стабильность в окружающей среде, возможность количественной регистрации, надежной и быстрой дифференциации от иных веществ биологической природы в отобранных пробах.
Известно, что бактерии Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens или Erwinia herbicola и продуциремые ими БИЛ безвредны для человека и животных (Biogenic Ice Nuclei. Part II: Bacterial Sources / G.Vali, M.Christensen, R.W.Fresh, E.L.Galyan, L.R.Maki, R.C.Schnell // J. Atmos. Sci. - 1976. - Vol.33. - P.1565-1570; Пат. 4978540 USA, МКИ5 A23L 3/37. Production of frozen foods and other products / Lee Tung-Ching. 20.01.88).
Активный материал биотрассера должен регистрироваться количественно с помощью специфичной реакции, обеспечивающей высокую чувствительность метода. Также целесообразно, чтобы материал биотрассера был достаточно стабилен при хранении до применения, нахождении на поверхностях различных объектов и в пробах. При этом устойчивость материала во внешней среде должна быть ограничена, чтобы он не накапливался в испытуемых пробах и не создавал избыточного фона.
Для регистрации изменений состояния материала биотрассера на объектах внешней среды должен использоваться метод количественного обнаружения, основанный на анализе его специфической биологической активности, утрачиваемой при инактивации биотрассера (денатурации или деструкции).
В наибольшей степени этим требованиям отвечают бактериальные белки, состоящие из нескольких субъединиц, к которым относятся БИЛ. Диссоциация белковой глобулы под действием различных факторов ведет к утрате специфической активности (устранению индикационного признака).
Наличие причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемыми техническими результатами показано в таблице 1.
Изобретение позволяет характеризовать распространение и стабильность в окружающей среде биопатогенов белковой природы, подобных белковым токсинам и различающихся молекулярной массой и устойчивостью к действию инактивирующих факторов среды (исследуемого материала).
Предложенный биотрассер получают следующим образом: выращивают культуру продуцента, из которой биотехнологическими методами выделяют БИЛ.
Выращивание микробов-продуцентов осуществляют в аппарате-культиваторе с жидкой питательной средой на основе перевара Хоттингера, содержащей аминный азот в количестве (80±10) мг % и имеющей величину рН (6,9±0,4) ед. рН. Выращивание культуры проводят при температуре (22±2)°С в течение 20-22 часов.
Выделение БИЛ осуществляют путем разрушения клеток в суспензии микроорганизмов встряхиванием со стеклянными бусами или ультразвуковой обработкой с отделением неразрушенных клеток центрифугированием или ультрафильтрацией. Далее БИЛ осаждают из культуральной жидкости солевым методом в присутствии гексаметафосфата натрия или сульфата аммония при рН среды 3,5-5,0 ед. с последующим центрифугированием и получением белковой пасты.
Биотрассер готовят в виде раствора или суспензии путем смешения 1 части белковой пасты с 2-9 частями фосфатного буферного раствора.
Полученное вещество характеризуется следующими свойствами:
| плотность, г·см-3 | от 1,0 до 1,2; |
| вязкость динамическая, мПа·с | от 1,0 до 10,0; |
| содержание сухих веществ, % | от 2,0 до 12,0; |
| содержание ЦН, активных | |
| при температуре минус 9°С, ЦН·см-3 | не менее 1,0·108; |
| содержание ЦН, активных при температуре | |
| минус 5°С, ЦН·см-3 | от 0 до 1,0·106. |
Применение биотрассера для изучения процессов распространения биопатогенов в окружающей среде включает следующие этапы:
- отбор проб материала в начальной и конечной точках исследований;
- определение в отобранных пробах фонового содержания природных гетерогенных ЦН, активных при выбранной температуре анализа;
- приготовление раствора биотрассера (при необходимости);
- введение биотрассера (в виде раствора или порошка) в исследуемый материал в начальной точке;
- отбор проб материала в начальной точке;
- отбор проб материала в конечной точке, находящейся на каком-либо расстоянии от начальной точки;
- регидратация исследуемых проб сухих (порошкообразных) материалов в разводящей жидкости;
- количественное определение в отобранных или регидратированных пробах ЦН, активных при выбранной температуре анализа;
- расчет коэффициентов проницаемости материалов или сохраняемости БИЛ в ходе продвижения от начальной точки к конечной с учетом вычета содержания фоновых природных гетерогенных ЦН.
Применение биотрассера для изучения инактивации биопатогенов в окружающей среде включает следующие этапы:
- отбор проб материала перед началом исследований;
- определение в отобранной пробе фонового содержания гетерогенных ЦН, активных при выбранной температуре анализа;
- приготовление раствора биотрассера (при необходимости);
- введение биотрассера (в виде раствора или порошка) в исследуемый материал;
- равномерное распределение биотрассера в материале путем перемешивания (при необходимости);
- выдерживание биотрассера в исследуемом материале в течение заданного времени;
- отбор проб материала в течение времени экспозиции;
- регидратация исследуемых проб сухих (порошкообразных) материалов в разводящей жидкости;
- количественное определение в отобранных или регидратированных пробах ЦН, активных при выбранной температуре анализа;
- расчет коэффициентов инактивации (сохраняемости) БИЛ в исследуемом материале с учетом вычета содержания фоновых гетерогенных ЦН.
Для регистрации ЦН в пробах проводят следующие операции.
По описанию, прилагаемому к мини-криостату, готовят прибор к работе. Устанавливают рабочую температуру анализа в диапазоне от минус 5°С до минус 11°С.
Разводящую жидкость - фосфатный буферный раствор готовят на основе растворов солей однозамещенного и двузамещенного фосфорнокислого калия и дистиллированной воды. Концентрация водородных ионов должна находиться в пределах 7,3-7,6 ед. рН. Приготовленный фосфатный буферный раствор подвергают автоклавированию при 120°С в течение 30 минут. Стерильный фосфатный буферный раствор проверяют на наличие абиогенных ЦН. Для этого его разливают в стерильные пробирки по 4-10 см3 и замораживают в криостате при температуре минус (7-9)°С в течение 5 мин. Замерзшие при этой температуре пробирки выбраковывают.
Стерильные мерные пробирки в количестве, необходимом для выполнения требуемых десятикратных разведений, заполняют фосфатным буферным раствором.
Приготовление парафинированных кювет, необходимых для размещения микрокапель исследуемой жидкости, осуществляют из алюминиевой или медной фольги следующим образом. Кюветы готовят в виде круга диаметром 8-10 см с загнутыми краями с высотой бортов 5-10 мм. Из переплавленного парафина готовят 3% раствор в ксилоле или хлороформе. Раствор парафина наносят на рабочую поверхность кюветы с избытком. Излишек раствора сливают. Кюветы подсушивают в течение 2-3 минут над пламенем спиртовки для испарения растворителя.
Исследуемую пробу сухих (порошкообразных) материалов регидратируют встряхиванием навески в разводящей жидкости с последующей фильтрацией через мембранные материалы.
Исследуемую жидкую пробу тщательно перемешивают и вносят в первую пробирку с фосфатным буфером для получения 10-процентного раствора. Дальнейшие разведения осуществляют десятикратным шагом. Анализу подвергают исходную жидкую пробу и все 5-8 десятикратных разведений.
Микропипеткой наносят на поверхность парафинированной кюветы по 20-40 микрокапель (например, объемом 0,01 см3) контроля (фосфатного буферного раствора) и каждого анализируемого разведения исследуемой пробы. Кюветы устанавливают в камеру мини-криостата и визуально определяют количество замерзших капель на каждой кювете через три минуты с момента начала кристаллизации. Замерзание капель регистрируют по их помутнению. Изменяют температуру охлаждающей поверхности мини-криостата и через 3 мин повторяют подсчет числа замерзших микрокапель при новой температуре.
При расчете концентрации ЦН используют кюветы, в которых отмечено замерзание части нанесенных капель. Анализ считается зачетным, если в контроле (фосфатном буферном растворе) ЦН при выбранной температуре не регистрируются.
Расчет концентрации ЦН в пробе.
Для каждого разведения пробы (i) по формулам (1) и (2) рассчитывают долю замерзших капель - эффект кристаллизации (fi) и соответствующую этому эффекту концентрацию центров нуклеации (Сfi):
где fi - эффект кристаллизации, доля;
Cfi - концентрация БИЛ в исследуемой жидкости, ЦН·см-3;
Noi - общее количество зачетных капель исследуемого разведения на данной кювете;
N3i - число замерзших капель исследуемого разведения на данной кювете;
d - степень разведения;
V - объем капли на кювете (например, 0,01 см3).
На основе полученных значений методом наименьших квадратов рассчитывают концентрацию ЦН, соответствующую 50%-ному эффекту кристаллизации.
Статистическую обработку результатов параллельных определений выполняют в соответствии с общепринятыми методами.
Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.
Пример 1. Изучение распространения биотрассера в водопроводной воде
Для оценки распространения биотрассера в водопроводной воде использовали биопрепарат с льдообразующей активностью (ЛОА) при температуре минус 9°С. В отобранной пробе воды фоновых гетерогенных ЦН не обнаружено.
Биотрассер суспендировали в воде для получения 10%-ного раствора. Полученный раствор вводили в начальной точке водопроводного коллектора и отбирали пробу воды. Концентрация ЦН в начальной точке составила 1,4·105 ЦН·см-3.
В исследуемых точках разветвляющегося коллектора, удаленных на расстояние 120 и 350 м от исходной (точки 2 и 3 соответственно), через фиксированные интервалы времени отбирали пробы воды для анализа содержания ЦН. Результаты экспериментов представлены в таблице 2.
Анализ данных таблицы 2 позволяет оценить скорость распространения биотрассера в воде водопроводного коллектора в зависимости от давления и расхода воды в нем в различных интересующих точках.
Пример 2. Сохраняемость биотрассера в водопроводной воде
Для оценки сохраняемости в водопроводной воде биотрассер с содержанием при температуре минус 9°С - 1,2·109 ЦН·см-3. Температура воды в течение срока наблюдения составляла 21-23°С.
В отобранной пробе воды фоновых гетерогенных ЦН, активных при температуре минус 5 и минус 9°С, не обнаружено.
В периодически отбираемых пробах анализировали содержание ЦН при температурах минус 5 и минус 9°С. Результаты экспериментов представлены в таблице 3.
Данные таблицы 3 свидетельствуют о достаточно высокой стабильности белков класса С, активных при температуре минус 9°С, но быстрой инактивации белков класса В, активных при температуре минус 5°С.
Результаты экспериментов позволяют предполагать возможность использования биотрассера в исследованиях по изучению распространения биологических примесей белковой природы в воде, имеющих продолжительность до 10 сут.
Пример 3. Стабильность биотрассера на поверхности тест-объектов
Тест-объекты смачивали погружением в биотрассер (в виде раствора), удаляли с них фильтровальной бумагой избыток жидкости и подвешивали на штатив. Средняя масса суспензии на тест-объектах составила 0,1 г.
Тест-объекты экспонировали в помещении с воздухообменом 750 м3·ч-1 при температуре 21-23°С, относительной влажности воздуха 30-35% и освещенности 165 лк. После экспозиции тест-объекты промывали 10 см3 фосфатного буферного раствора, считая полученную пробу цельной, и определяли в ней специфическую активность.
В смывах с контрольных тест-объектов ЦН не были обнаружены.
Опыты показали, что БИЛ, активные при температуре минус 5°С, на 2 сут наблюдения в пробах не регистрировались.
БИЛ, активные при температуре минус 9°С, показали достаточно высокую стабильность в рассмотренных условиях. Как видно из представленных на фиг.1 данных, за 14 суток экспозиции содержание ЦН, активных при температуре минус 9°С, на поверхности тест-объектов уменьшилось в среднем на три порядка. Константа скорости инактивации (Кt) для первого опыта составила 0,3185 сут-1, для второго - 0,4042 сут-1.
Критерий аппроксимации (R2) для экспоненциальной кривой инактивации составил 0,8016 и 0,9436 отн.ед. соответственно для первого и второго опытов. Эти данные свидетельствуют о том, что инактивация БИЛ на поверхностях тест-объектов подчиняется экспоненциальному закону. Биотрассер применим для изучения перемещения и сохранения биологических примесей белковой природы на поверхностях различных предметов
Пример 4. Термостабильность биотрассера
Для изучения термостабильности биотрассера (в виде раствора) его выдерживали при температурах 60, 70 и 80°С в соответствии с рекомендациями (Мунблит В.Я., Тальрозе В.Л., Трофимов В.И. Термоинактивация микроорганизмов. - М., Наука, 1985. По окончании экспозиции пробы с биотрассером охлаждали до температуры 4°С. Анализ содержания ЦН проводили при температуре минус 9°С. Результаты экспериментов представлены в таблице 4 и на фиг.2.
Проведенные эксперименты показали, что в исследованном интервале температур инактивация белков класса С, активных при температуре минус 9°С, подчиняется закону Аррениуса. Об этом свидетельствует линейность графика термоинактивации. Полученные данные позволили рассчитать энергию активации деструкции белков, составившую 43 кДж·моль-1. Предэкспоненциальный множитель при этом составил 1,03·105 мин-1.
Проведенные эксперименты свидетельствуют о возможности использования биотрассера для изучения процессов распространения и инактивации биологических примесей белковой природы при температуре до 80°С.
Пример 5. Изучение переноса биотрассера при рукопожатиях людей
К эксперименту привлечены 9 человек, у которых с ладоней взяты пробы методом смыва стерильным фосфатным буферным раствором для определения фонового содержания БИЛ. В пробах не было обнаружено ЦН, активных при температуре минус 9°С.
Первый испытуемый нанес на ладони раствор биотрассера, содержащий 1·108 ЦН·см-3, активных при температуре минус 9°С, в количестве 0,5 см3. С левой ладони испытуемого методом смыва фосфатным буферным раствором взята проба для определения содержания БИЛ.
Следующие испытуемые произвели с ним и друг с другом последовательные рукопожатия. По завершении эксперимента с ладоней испытуемых проведены смывы проб фосфатным буферным раствором. Результаты эксперимента приведены в таблице 5.
Данные эксперимента, приведенные в таблице 5, свидетельствуют о том, что биотрассер распространяется при рукопожатиях. При интенсивном белковом загрязнении ладоней 7 человек являлись носителем биотрассера.
Пример свидетельствует о возможности использования предлагаемого биотрассера для изучения распространения биологических примесей белковой природы при бытовых контактах между людьми.
| Таблица 1 Сведения о причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемыми техническими результатами |
|||
| Виды технического результата и их размерность | Показатели фактические или расчетные | Совокупность отличительных признаков, улучшающих показатели заявляемого объекта | |
| прототипа | заявляемого объекта | ||
| Возможность изучения распространения биопатогенов белковой природы | Нет | Да | Использование в качестве биотрассера специфических белков, очищенных от микробных клеток |
| Возможность характеристики распространения и стабильности в среде белковых комплексов различной молекулярной массы | Нет | Да | Используется биотрассер, содержащий БИЛ классов В и С, имеющих различную молекулярную массу и устойчивость к действию инактивирующих факторов среды (исследуемого материала), различный температурный «порог срабатывания» (температуру проявления льдообразующей активности) |
| Наличие унифицированной для определения БИЛ методики | Нет | Да | Для анализа используется усовершенствованная методика количественного определения БИЛ. |
| Использование биотрассера для изучения распространения биопатогенов при бытовых контактах между людьми. | Нет | Да | При многократной (до 7 последовательных рукопожатий) передаче биотрассера, нанесенного на ладони, сохраняется возможность его обнаружения контролируемым методом. |
| Стабильность биотрассера в окружающей среде, суток | 7-90 | До 10 - в воде До 14 - на поверхностях тест-объектов | Ограниченная стабильность БИЛ исключает риск сохранения и нарастания фона используемого трассера в водной среде и на поверхностях объектов. Однако биотрассер сохраняет активность БИЛ в условиях стационарного хранения в течение 1 года. |
| Таблица 2 Результаты обнаружения биотрассера в водопроводной воде |
||||||||
| Точка отбора проб | Содержание ЦН, активных при температуре минус 9°С, ЦН·см-3, в пробах, отобранных через … час | |||||||
| 0 | 0,5 | 1,0 | 2,0 | 3,0 | 4,0 | 5,0 | 6,0 | |
| 1 (исходная) | 1,4·105 | 8,7·101 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2 | 0 | 3,5 | 1,5·102 | 4,8·103 | 2,4·101 | 6,5 | 0 | 0 |
| 3 | 0 | 0 | 0 | 1,5·101 | 3,8·102 | 7,8·102 | 2,8·101 | 2,0 |
| Таблица 3 Сохраняемость биотрассера в водопроводной воде |
||||||||
| Показатель | Ед.изм. | Значение показателя при экспозиции …, сут | ||||||
| 0 | 1 | 3 | 5 | 7 | 10 | |||
| Содержание ЦН при температуре минус 5°С | ЦН·см-3 | 2,7·101 | 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| процент от исходного | 100 | 17 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| Содержание ЦН при температуре минус 9°С | ЦН·см-3 | 1,2·104 | 1,0·104 | 6,8·103 | 7,4·103 | 3,8·103 | 2,4·102 | |
| процент от исходного | 100 | 88 | 57 | 62 | 32 | 2 | ||
| Таблица 4 Термостабильность биотрассера |
||||||||
| Температура, °С | ЛОА через … мин экспозиции, ЦН·см-3 | Kt, мин-1 | ||||||
| 10 | 20 | 30 | 60 | 120 | 180 | 240 | ||
| 60 | 1,11·105 | 1,21·104 | 1,28·104 | 1,50·104 | 4,31·103 | 1,07·104 | 1,42·102 | 0,0187 |
| 70 | 4,32·104 | 5,95·104 | 1,10·104 | 2,55·102 | 4,31·102 | - | 5,51·10 | 0,0285 |
| 80 | 7,21·103 | 2,63·103 | 1,40·102 | 4,50·102 | 2,07·101 | - | - | 0,0451 |
| Таблица 5 Содержание БИЛ в смывах с поверхностей ладоней испытуемых |
||||||||
| Содержание БИЛ в смывах с ладоней испытуемого …, ЦН·см-3 | ||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 (контроль) |
| 5,5·106 | 1,2·104 | 4,9·102 | 105 | 34 | 15 | 6 | 0 | 0 |
Способ контроля распространения и устойчивости биологических примесей белковой природы в окружающей среде, в том числе для изучения распространения биопатогенов при бытовых контактах между людьми, путем нанесения в виде раствора или порошка биотрассера с льдообразующей активностью на исследуемый объект, отбора проб материала в различных пространственно-временных точках и определения в отобранных пробах центров нуклеации, отличающийся тем, что в качестве материала биотрассера используют очищенную белковую субстанцию с льдообразующей активностью, полученную путем разрушения клеток штаммов-продуцентов видов Erwinia herbicola, Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens механической или ультразвуковой обработкой с последующим солевым осаждением и центрифугированием, а льдообразующую активность регистрируют по наличию в пробе центров нуклеации с помощью унифицированной методики, основанной на использовании закона Пуассона для описания вероятности обнаружения центров нуклеации в каплях малого объема и расчете концентрации, соответствующей 50% эффекту кристаллизации в группах микрокапель при температуре от (-5)÷(-11)°С, с использованием метода наименьших квадратов.
