Визуализация 18f или 11c-меченных алкилтиофенилгуанидинов

В изобретении предложено соединение формулы (I), где: R¹ представляет собой водород или С_1-4алкил; каждый из R² и R⁴ независимо выбран из С_1-4алкила, [¹¹С]-С_1-4алкила и [¹⁸F]-С_1-4фторалкила, при условии, что по меньшей мере один из R² и R⁴ представляет собой [¹¹С]-С_1-4алкил или [¹⁸F]-С_1-4фторалкил; и R³ представляет собой галогено, применимое для визуализации NMDA-опосредованного заболевания и способ его (соединения) получения. 7 н. и 4 з.п. ф-лы, 2 табл.

 

Настоящее изобретение относится к области медицинской визуализации, в частности к позитронной эмиссионной томографии (PET), и предлагает соединения и способы для визуализации рецепторов центральной нервной системы (ЦНС).

Рецептор N-метил-О-аспартата (NMDA) является одним из основных подтипов глутаматергических рецепторов и признанно считается, что он играет центральную роль в длительной депрессии, длительном потенцировании и нейрональной пластичности развития. При многих заболеваниях ЦНС, таких как удар, травма головного или спинного мозга, эпилепсия, болезнь Альцгеймера и болезнь Гентингтона, была обнаружена NMDA-индуцированная эксцитотоксичность, по меньшей мере частично обусловленная избыточной активацией или пролонгированной стимуляцией NMDA рецепторов. Был создан ряд соединений в качестве потенциальных радиолигандов для изучения сайтов NMDA-рецепторных ионных каналов in vivo с использованием PET. Однако большинство этих соединений обладало недостатками, состоящими в плохом проникновении через гематоэнцифалический барьер или в высоком неспецифическом связывании.

В WO 94/27591 раскрыт ряд замещенных гуанидинов и их применение для терапии.

В WO 2004/007440 раскрыты меченные радиоактивными метками производные гуанидина и их применение для визуализации рецепторов центральной нервной системы (ЦНС), и было установлено, что эти производные требуют после их синтеза сложной очистки посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), и что они дают низкие или умеренные выходы при относительно длительном времени получения, составляющем примерно 45 минут. Поэтому существует потребность в улучшенных в плане общих выходов, времени получения и простоты очистки химических методах введения радиоизотопов. Кроме того, для того, чтобы обеспечить возможность более длительного сканирования и повышения доступности таких изотопных индикаторов, существует необходимость в дополнительных радиолигандах для NMDA рецептора.

Соответственно, в одном аспекте настоящего изобретения предложено соединение формулы (I):

или его соль или сольват, где:

R¹ представляет собой водород или С_1-4алкил;

каждый из R² и R⁴ независимо выбран из С_1-4алкила, [¹¹С]-С_1-4алкила и [¹⁸F]-С_1-4фторалкила, при условии, что по меньшей мере один из R² и R⁴ представляет собой [¹¹С]-C_1-4алкил или [¹⁸F]-С_1-4фторалкил; и

R³ представляет собой галогено.

R¹ предпочтительно представляет собой водород или метил, более предпочтительно метил.

Одна группа из R² или R⁴ предпочтительно представляет собой -¹¹СН₃, -¹¹CH₂CH₃ или -¹¹CH₂CH₂CH₃, -CH₂ ¹⁸F, -CH₂CH₂ ¹⁸F или -CH₂CH₂CH₂ ¹⁸F и более предпочтительно представляет собой -¹¹СН₃ или -CH₂ ¹⁸F; а другая группа R² или R⁴ предпочтительно представляет собой метил.

R³ предпочтительно присоединен к фенильному кольцу в пара-положении относительно группы -SR², и в предпочтительном аспекте R³ представляет собой хлоро.

Группа -SR⁴ предпочтительно присоединена к фенильному кольцу в мета-положении относительно гуанидинового мостика.

Таким образом, в предпочтительном аспекте изобретения предложено соединение формулы (la):

или его соль или сольват, где R¹, R², R³ и R⁴ являются такими, как определено для соединений формулы (I).

Наиболее предпочтительные соединения формулы (I) включают:

N-(2-хлор-5-[¹⁸F]-фторметилтио)-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидин;

N-(2-хлор-5-(2-[¹⁸F]-фторметилтио)-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидин;

N-(2-хлор-5-метилтио)-фенил-N'-(3[¹⁸F]фторметилтио)-фенил-N'-метилгуанидин;

N-(2-хлор-5-метилтио)-фенил-N'-(3-(2-[¹⁸F]фторметилтио)-фенил-N'-метилгуанидин;

N-(2-хлор-5-[¹¹С]-метилтио)-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидин;

N-(2-хлор-5-метилтио)-фенил-N'-(3-[¹¹С]метилтио)-фенил-N'-метилгуанидин;

N-(2-хлор-5-[¹¹C]этилтио)-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидин; и

N-(2-хлор-6-метилтио)фенил-N'-(3-[¹¹C]этилтио)-фенил-N'-метилгуанидин или соль или сольват любого из них.

Подходящие соли согласно изобретению включают физиологически приемлемые соли присоединения кислот, такие как соли, полученные с минеральными кислотами, например соляной, бромистоводородной, фосфорной, метафосфорной, азотной и серной кислотами, и соли, являющиеся производными органических кислот, например винной, трифторуксусной, лимонной, яблочной, молочной, фумаровой, бензойной, гликолевой, глюконовой, янтарной, метансульфоновой и пара-толуолсульфоновой кислот.

Как будет показано ниже, соединения формул (I) и (Ia).находят применение как радиолиганды NMDA рецептора. Поэтому, согласно следующему аспекту изобретения, предложено соединение формул (I) или (Ia), как определено выше, или его соль или сольват, для применения в способе in vivo диагностирования или визуализации, таком как PET. Целесообразным образом соединение формул (I) или (Ia), как определено выше, или его соль или сольват могут быть использованы для визуализации NMDA рецептора у здоровых людей-добровольцев.

Соответственно, соединения формул (I) или (Ia) или их соль или сольват полезны для in vivo визуализации NMDA рецепторов, и поэтому находят применение в диагностике NMDA-опосредованных расстройств, таких как удар, травма спинного или головного мозга, эпилепсия, болезнь Альцгеймера или болезнь Гентингтона. Соответственно, дополнительно предложено применение соединения формул (I) или (Ia) или его соли или сольвата в изготовлении радиофармацевтического средства для in vivo диагностирования или визуализации NMDA-опосредованного заболевания.

В альтерантивном воплощении предложен способ in vivo диагностирования или визуализации NMDA-опосредованного заболевания у субъекта, предпочтительно человека, включающий введение соединения формул (I) или (Ia) или его соли или сольвата. Этот способ особенно предпочтителен для in vivo диагностирования или визуализации удара, травмы спинного или головного мозга, эпилепсии, болезни Альцгеймера или болезни Гентингтона.

Соединение формул (I) или (Ia) или его соль предпочтительно вводят в составе радиофармацевтической композиции, содержащей соединение по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент."Радиофармацевтическая композиция" определена в настоящем изобретении как композиция, содержащая соединение формул (I) или (Ia) или его соль в форме, подходящей для введения людям. Введение предпочтительно осуществляют посредством инъекции композиции в виде водного раствора. Такая композиция возможно может содержать дополнительные ингредиенты, такие как буферы, фармацевтически приемлемые солюбилизаторы (например, циклодекстрины или поверхностно-активные вещества, такие как Pluronic, Tween или фосфолипиды), фармацевтически приемлемые стабилизаторы или антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота, гентизиновая кислота или лара-аминобензойная кислота).

Доза соединения формул (I), (Ia) или его соли будет варьировать в зависимости от конкретного вводимого соединения, массы пациента и других переменных показателей, как это будет очевидно врачу-специалисту. В общем доза лежит в диапазоне от 0,1 нмоль/кг до 50 нмоль/кг, предпочтительно от 1 нмоль/кг до 5 нмоль/кг.

Соединение формул (I), (Ia) или его соль или сольват могут быть получены из соответствующего соединения формулы (II):

где один из R² или R⁴ представляет собой водород или защитную группу для тиола, такую как бензил, а другой представляет собой водород, С_1-4алкил или защитную группу для тиола, такую как бензил; R¹ представляет собой водород или С_1-4алкил, и R³ представляет собой галогено; путем (1) удаления любых защитных групп для тиола и (2) взаимодействия с соответствующим алкилгалогенидом [¹¹C]С_1-4алкил-Х или [¹⁸F]С_1-4фторалкил-Y, где Х и Y представляют собой независимо галогено, предпочтительно хлоро, иодо или бромо, или другую подходящую уходящую группу, такую как арил- или алкилсульфонат, например тозилат, трифлат или мезилат.

Это взаимодействие с алкилгалогенидом предпочтительно осуществляют в подходящем растворителе, таком как N,N-диметилформамид (DMF), ацетон, дихлорметан, хлороформ, диметилсульфоксид, метанол, этанол, пропанол, изопропанол, тетрагидрофуран или ацетонитрил, и в присутствии основания, целесообразно неорганического основания, такого как карбонат калия, гидроксид калия или гидрид натрия, или органического основания, такого как триалкиламин, например триэтиламин, диизопропилэтиламин или диметиламинопиридин.

Соединения формулы (II) являются полезными промежуточными соединениями для получения изотопных индикаторов формулы (I) для PET и, как таковые, образуют еще один аспект изобретения.

Согласно следующему аспекту изобретения предложен способ получения соединения формулы (I):

или его соли или сольвата, где:

R¹ представляет собой водород или С_1-4алкил;

каждый из R² и R⁴ независимо выбран из С_1-4алкила, [¹¹С]-С_1-4алкила и [¹⁸F]-С_1-4фторалкила, при условии, что по меньшей мере один из R² и R⁴ представляет собой [¹¹С]-С_1-4алкил или [¹⁸F]-С_1-4фторалкил; и

R³ представляет собой галогено,

который включает взаимодействие соединения формулы (II):

где один из R² или R⁴ представляет собой водород или защитную группу для тиола, такую как бензил, а другой представляет собой водород, С_1-4алкил или защитную группу для тиола, такую как бензил; R¹ представляет собой водород или С_1-4алкил, и R³ представляет собой галогено;

путем (1) удаления любых защитных групп для тиола и (2) взаимодействия с соответствующим алкилгалогенидом [¹¹С]С_1-4алкил-Х или [¹⁸F]-С_1-4фторалкил-Y, где Х и Y представляют собой независимо галогено, предпочтительно хлоро, иодо или бромо, или другую подходящую уходящую группу, такую как арил- или алкилсульфонат, например тозилат, трифлат или мезилат;

в подходящем растворителе и в присутствии основания.

Согласно следующему аспекту изобретения предложен набор для приготовления радиофармацевтической композиции, содержащий соединение формулы (II), как определено выше, алкилгалогенид [¹¹С]С_1-4алкил-Х или [¹⁸F]-С_1-4фторалкил-Y, где Х и Y представляют собой независимо галогено, предпочтительно хлоро, иодо или бромо, или другую подходящую уходящую группу, такую как арил- или алкилсульфонат, например тозилат, трифлат или мезилат; и фармацевтически приемлемый эксципиент. При использовании набора соединение формулы (II) превращают в соответствующее соединение формулы (I), используя вышеописанный способ.

Соединения формулы (II), в которых R² представляет собой водород или защитную группу для тиола, могут быть получены из соединения формулы (III) или его соли:

где R³ представляет собой галогено, и Р¹ представляет собой защитную группу для тиола, как описано ниже; взаимодействием с соединением формулы (IV):

где R¹ представляет собой водород или С_1-4алкил, и R⁴ является таким, как определено для желаемого соединения формулы (II). Сочетание соединения формулы (III) с соединением формула (IV) может быть осуществлено без растворителя или в присутствии высококипящего апротонного растворителя, такого как хлорбензол, толуол или ксилол. Это взаимодействие можно проводить при повышенной температуре, например от 50 до 200°С, целесообразно при приблизительно 160°С. После взаимодействия защитная группа Р¹ может быть удалена, как описано ниже.

Подходящие методики введения и удаления защитных групп для тиола могут быть найдены, например, в Protecting Groups in Organic Synthesis, Theodora W. Greene and Peter G.M. Wuts, published by John Wiley & Sons Inc. Подходящие защитные группы для тиола включают арилалкильные группы, такие как бензил или пара-метоксибензил, которые могут быть удалены перед проведением стадии введения радиоактивной метки, например путем обработки кислотой, например кислотой Льюиса, такой как AlCl₃.

Синтез соединения формулы (II) из соединений формул (III) и (IV) проиллюстрирован на Схеме 1.

Схема 1

Соединения формул (III) и (IV) могут быть получены из имеющихся в продаже исходных веществ с помощью способов, описанных на Схеме 1 и в Прмерах, или аналогичных им.

Соединения формулы (II), в которых R⁴ представляет собой водород или защитную группу для тиола, могут быть получены из соединения формулы (V):

где R¹ представляет собой водород или С_1-1алкил, а Р² представляет собой защитную группу для тиола, как описано выше; взаимодействием с соединением формулы (VI):

где R³ представляет собой галогено, a R² является таким, как определено для желаемого соединения формулы (II). Сочетание соединения формулы (V) с соединением формулы (VI) может быть осуществлено способами, аналогичными описанным для сочетания соединения формулы (III) с соединением формулы (IV). После этого взаимодействия защитная группа Р² может быть удалена, как описано выше.

Этот синтез соединения формулы (II) из соединений формул (V) и (VI) проиллюстрирован на Схеме 2.

Соединения формул (V) и (VI) могут быть получены из имеющихся в продаже исходных веществ с помощью способов, описанных на Схеме 2 и в Прмерах, или аналогичных им.

Изобретение далее проиллюстрировано с помощью Примеров, в которых использованы следующие аббревиатуры:

HPLC: высокоэффективная жидкостная хроматография

UV: ультрафиолет

TLC: тонкослойная хроматография

EtOAc: этилацетат

IR: инфракрасная спектроскопия

мин: минута(ы)

Пример 1: синтез N-(2-хлор-5-фторметилтио)-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидина

Пример 1(1) Синтез 3-амино-4-хлорбензолтиола

К охлажденному раствору (0°С) хлорида олова (II) (11,260 г, 59,40 ммоль) в 10 мл концентрированной соляной кислоты медленно порциями добавляли 4-хлор-3-нитро-бензолсульфонилхлорид (1,690 г, 6,60 ммоль). Полученную суспензию сохраняли холодной и перемешивали в течение 15 минут, а затем смесь нагревали до температуры дефлегмации в течение 1 часа. После охлаждения до комнатной температуры смесь разбавляли водой (100 мл) и осторожно нейтрализовали с помощью NaHCO₃. Водную фазу экстрагировали хлороформом (4×50 мл), а органическую фазу отделяли и сушили над Na₂SO₄. В результате удаления растворителя под вакуумом получали ярко-желтое твердое вещество. В результате колоночной хроматографии на силикагеле с использованием смеси 1:1 хлороформ/гексан в качестве подвижной фазы получали 3-амино-4-хлорбензолтиол в виде белого твердого вещества (0,632 г, 60%).

¹H ЯМР (CDCl₃) 7.08 (d, 1H, |J|=8,5 Гц, арильный Н), 6.67 (d, 1Н, |J|=2,0 Гц, арильный Н), 6.59 (dd, 1H, |J|=8,5 и 2,0 Гц, арильный Н), 4.03 (br s, 2Н, NH₂), 3.37 (s, 1H, SH).

Пример 1(2) Синтез (5-бензилтио-2-хлор)-анилина и (5-бензилтио-2-хлор)-анилина. HCl соль

К охлажденному раствору (0°С) 3-амино-4-хлорбензолтиола (0,630 г, 3,92 ммоль) в безводном тетра гидрофура не (THF) (15 мл) добавляли н-бутиллитий (1,6 М в гексанах, 2,45 мл, 3,92 ммоль) и реакционную смесь быстро перемешивали. К этой смеси медленно добавляли бензилбромид (0,47 мл, 3,92 ммоль) и реакционную смесь быстро перемешивали, нагревая до комнатной температуры в течение приблизительно 1 часа. В результате удаления растворителя при пониженном давлении получали сырой продукт, который очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле, используя смесь 1:1 дихлорметан/гексан в качестве подвижной фазы. (6-Бензилтио-2-хлор)-анилин выделяли в виде ярко-белого твердого вещества (0,805 г, 82%).

¹H ЯМР δ (CDCl₃) 7.26 (m, 3H, фенильный Н), 7.22 (br m, 2H, фенильный Н), 7.09 (d, 1H, |J|=8,3 Гц), 6.66 (d, 1H, |J|=1,9 Гц), 6.61 (dd, 1H, |J|=8,3 и 1,9 Гц), 4.04 (s, 2 Н, СН_з), 4.03 (br s, 2Н, NH₂).

К охлажденному раствору (0°С) (5-бензилтио-2-хлор)-анилина (0,805 г, 3,21 ммоль) в безводном диэтиловом эфире (10 мл) медленно добавляли безводную соляную кислоту в диэтиловом эфире (1 M, 5,0 мл, 5 ммоль). Образовавшийся осадок отделяли фильтрованием, промывали диэтиловым эфиром (2×5 мл) и сушили под вакуумом. (5-Бензилтио-2-хлор)-анилин, соль HCl, выделяли с выходом, близким к количественному, в виде белого твердого вещества (0,865 г, 94%).

Пример 1 (3) Синтез метил-(3-метилтио-фенил)-цианамида

К охлажденному раствору (0°С) 3-метилтио-анилина (1,850 г, 13,30 ммоль) в безводном диэтиловом эфире (10 мл) добавляли раствор в диэтиловом эфире (10 мл) цианогенбромида (0,704 г, 6,65 ммоль). ВНИМАНИЕ: цианогенбромид высокотоксичен. Полученный раствор оставляли перемешиваться при комнатной температуре в течение ночи. Полученную смесь фильтровали для удаления осадка и диэтилэфирный фильтрат промывали 1 M HCl (20 мл) и рассолом (20 мл), после чего растворитель удаляли под вакуумом с получением маслянистого желтого остатка. В результате очистки сырого продукта колоночной хроматографией на силикагеле с использованием смеси 95:5 дихлорметан/этилацетат получали (3-метилтио-фенил)-цианамид в виде практически бесцветного масла, которое кристаллизовалось при стоянии (0,570 г, 52%).

В подвергнутую сушке пламенем колбу Шленка (Schlenk) в атмосфере азота загружали гидрид натрия (60% в минеральном масле, 0,14 г, 3,5 ммоль), 3-метилсульфанил-фенил-цианамид (0,493 г, 3,00 ммоль) и безводный THF (5 мл). Эту смесь быстро перемешивали и нагревали до 70°С в течение приблизительно 0,5 часа. При охлаждении до комнатной температуры капельным методом добавляли иодметан (0,37 мл, 6,00 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Полученный прозрачный бесцветный раствор концентрировали под вакуумом, после чего добавляли воду (30 мл) и диэтиловый эфир (40 мл). Органическую фазу отделяли, сушили над Na₂SO₄ и диэтиловый эфир удаляли под вакуумом с получением сырого остатка. В результате очистки колоночной хроматографией на силикагеле с использованием дихлорметана в качестве подвижной фазы получали указанное в заголовке соединение в виде бледно-желтого масла (0,388 г, 73%).

¹H ЯМР δ (CDCl₃) 7.26 (m,1H, арильный Н), 6.96 (m, 2Н, арильный Н), 6.81 (m, 1H, арильный Н), 3.31 (s, 3H, NCH₃), 2.48 (s, 3H, SCH₃).

Пример 1(4) Синтез N-(5-бензилтио-2-хлор)-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидина, соль HCl

В подвергнутую сушке пламенем круглодонную колбу на 10 мл, снабженную магнитной мешалкой, добавляли метил-(3-метилтио-фенил)-цианамид (0,185 г, 1,04 ммоль) и (5-бензилтио-2-хлор)-анилин, соль HCI (0,297 г, 1,04 ммоль). Колбу вакуумировали и три раза заполняли азотом, после чего колбу герметично закрывали и нагревали до 160°С в течение 3 часов. Образовавшийся при охлаждении до комнатной температуры бледно-оранжевый остаток переносили в минимальный объем дихлорметана (0,5-1 мл) и очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле, используя градиент метанола в дихлорметане 0-10%. В результате удаления растворителя в высоком вакууме получали указанное в заголовке соединение в виде стекловидного белого твердого вещества (0,357 г, 74%).

¹H ЯМР δ (d₆-DMSO) 9.70 (brs, 1H, NH), 8.01 (brs, 1H, NH), 7.39-7.08 (m, 11H, арильный H), 7.09 (m, 1H, арильный H), 4.24 (s, 2H, CH₂), 3.39 (s, 3H, N-СН₃), 2.45 (s, 3 H, S-СН₃).

Пример 1(5): Синтез N-(2-хлор-5-меркапто)-фенил-N'(3-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидина, соль HCl

В подвергнутую сушке пламенем колбу Шленка в атмосфере азота загружали хлорид алюминия (0,293 г, 2,20 ммоль) и безводный толуол (5 мл). К полученной перемешиваемой суспензии добавляли толуольный раствор N-(5-бензилтио-2-хлор)-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидина, соль HCl (0,250 г, 0,54 ммоль), и реакционную смесь быстро перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Полученную смесь разбавляли метанолом (5 мл), в результате чего получали бесцветный гомогенный раствор. В результате удаления растворителей под вакуумом получали бесцветный остаток, который переносили в дихлорметан (3 мл), фильтровали и фильтрат очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле, используя градиент 0-10% метанола в дихлорметане. Указанное в заголовке соединение выделяли в виде стекловидного белого твердого вещества (0,130 г, 64%).

Образец свободного основания получали посредством нагревания HCI соли в присутствии К₂СО₃ в ацетоне с последующим выделением колоночной хроматографией на силикагеле, используя градиент 0-10% метанола в дихлорметане.

¹H ЯМР δ (CDCl₃) 7.29 (br s, 1H, арильный H), 7.28 (m, 1H, арильный H), 7.13 (m, 2H, арильный H), 7.11 (d m, 1H, арильный H), 7.06 (dd, 1H, арильный H), 7.01 (d m, 1H, арильный H), 3.48 (br s, 1H, SH), 3.36 (s, 3H, NCH₃), 2.49 (s, 3H, SСН₃).

Пример 1(6) Синтез N-(2-хлор-5-Фторметилтио)-Фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидин

В подвергнутую сушке пламенем колбу Шленка в атмосфере азота загружали N-(2-хлор-5-меркапто)-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидин, соль HCl (0,037 г, 0,10 ммоль), триэтиламин (0,020 г, 0,20 ммоль) и безводный дихлорметан (2-3 мл) и охлаждали на ледяной бане до 0°С. Газообразный фторбромметан барботировали через темноокрашенную реакционную смесь в течение 30 секунд, а затем реакционную смесь оставляли медленно нагреваться до комнатной температуры. Через 2 часа полученный бледно-желтый раствор концентрировали под вакуумом с получением сырого остатка, который перерастворяли в дихлорметане (1 мл) и очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле, используя градиент 0-10% метанола в дихлорметане. В результате удаления растворителя в высоком вакууме получали указанное в заголовке соединение в виде бледно-желтого масла (0,024 г, 68%).

¹H ЯМР δ (CDCl₃) 7.32 (m, 2H, арильный Н), 7.20 (m, 1H, арильный Н}, 7.17 (m, 1H, арильный Н), 7.16-7.06 (m, 2Н, арильный Н), 7.04 (m, 1H, арильный Н), 5.71 (d, 2H, |J|=52,8 Гц, CH₂F), 3.41 (s, 3Н, N-СН₃), 2.50 (s, 3H, S-СН₃).

Пример 2: N-(2-Хлор-5-[¹⁸F]фторметилтио)-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидин

Указанное в заголовке соединение получали, применяя методы, аналогичные методам из Примера 1(6), но используя [¹⁸F]фторбромметан в качестве галогеналкилирующего агента, безводный ацетонитрил в качестве растворителя и карбонат цезия в качестве основания. Идентичность продукта подтверждали с помощью HPLC с совместной элюцией N-(2-хлор-5-[¹⁸F]фторметилтио)-фенил-N'-(метилтио)-фенил-N'-метилгуанидина с аутентичным образцом, полученным в Примере 1(6).

Метод HPLC

В опытных аналитических условиях HPLC было установлено, что наиболее эффективное хроматографическое разделение между предшественником N-(2-хлор-5-тио)фенил-N'-3'-(метилтио)-фенил-N'-метилгуанидином и стандартом сравнения N-(2-хлор-5-фторметилтио)-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидином было следующим: колонка 5µ-Luna С-18(2) (250×4,6 мм), МР 55/45 ацетонитрил/0,01 М (NH₄)₂HPO₄, скорость потока 1 мл/мин, UV 254 нм. Время удерживания для предшественника N-(2-хлор-5-тио)фенил-N'-3'-(метилтио)-фенил-N'-метилгуанидина составляло 20,0 минут, тогда как N-(2-хлор-5-фторметилтио)-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидин имел время удерживания 9,70 минут.

Пример 3: Синтез N-(2-хлор-5-(2-Фтор-этилтио))-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидина

В подвергнутую сушке пламенем колбу Шленка, снабженную парциальным конденсатором горячего орошения, загружали N-(2-хлор-5-меркапто)-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидин, соль HCl (0,030 г, 0,08 ммоль), карбонат калия (0,022 г, 0,16 ммоль) и безводный ацетон (2 мл). К этой смеси добавляли раствор 2-фторэтилтозилата (0,017 г, 0,080 ммоль) в ацетоне (1 мл) и реакционную смесь нагревали до флегмообразования в атмосфере азота в течение 3 дней. После охлаждения до комнатной температуры растворитель удаляли под вакуумом, а остаток перерастворяли в дихлорметане (1 мл). В результате очистки посредством колоночной хроматографии на силикагеле с использованием градиента 0-10% метанола в дихлорметане получали указанное в заголовке соединение в виде бледно-желтого масла (0,021 г, 68%).

¹H ЯМР δ (CDCl₃) 7.30 (m, 2H, арильный Н), 7.19 (br m, 1H, арильный Н), 7.13 (br m, 3H, арильный Н), 6.94 (m, 1H, арильный Н), 4.53 (dt, 2 Н, |J|=6,6 и 47,0 Гц, CH₂F), 3.41 (s, 3H, N-CH₃), 3.12 (dt, 2H, |J|=6,6 и 20,5 Гц), 2.51 (s, 3H, S-СН₃).

Пример 4: Синтез N-(2-хлор-5-(2-[¹⁸F]фтор-этилтио))-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидина

Указанное в заголовке соединение получали, применяя методы, аналогичные методам из Примера 3, но используя 2-[¹⁸F]фторэтилтозилат в качестве галогеналкилирующего агента, смесь 1:2 безводный ацетонитрил/этанол в качестве растворителя и карбонат цезия в качестве основания. Идентичность продукта подтверждали посредством HPLC совместной элюции N-(2-хлор-5-[¹⁸F]фторэтилтио)-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидина с аутентичным образцом, полученным в Примере 3.

Метод HPLC

В опытных аналитических условиях HPLC было установлено, что наиболее эффективное хроматографическое разделение между предшественником N-(2-хлоро-5-тио)фенил-N'-3'-(метилтио)-фенил-N'-метилгуанидином и стандартом сравнения N-(2-хлор-5-(2-фтор-этиллтио)-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидином было следующим: -колонка 5µ-Luna С-18(2) (250×4,6 мм), МР 55/45 ацетонитрил/0,01 M (NH₄)₂HPO₄, скорость потока 1 мл/мин, UV 254 нм. Время удерживания для предшественника N-(2-хлор-5-тио)фенил-N'-3'-(метилтио)-фенил-N'-метилгуанидина составляло 20,0 минут, тогда как N-(2-хлор-5-фторэтилтио)-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидин имел время удерживания 9,40 минут.

Пример 5: Синтез N-(2-хлор-5-(2-[¹¹C]этилтио))-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидина

Указанное в заголовке соединение получали, применяя методы, аналогичные методам из Примера 6, но используя 2-[¹¹C]иодэтан в качестве галогеналкилирующего агента.

Пример 6: Синтез N-(2-хлор-5-метилтио)-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидина

В круглодонную колбу, снабженную магнитной мешалкой, добавляли метоксид натрия (1,4 мг, 26,6 мкмоль), N-(2-хлор-5-меркапто)-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидин, соль HCl (5,0 мг, 13,3 мкмоль), и безводный метанол (1 мл). Реакционную смесь быстро перемешивали в атмосфере азота в течение 5 минут, после чего смесь далее обрабатывали иодметаном (1,8 мкл, 30 мкмоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 15 минут растворитель удаляли под вакуумом, а остаток анализировали посредством HPLC.

Пример 7: Синтез N-(2-хлор-6-5-[¹¹C]-метилтио)-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидина

Указанное в заголовке соединение получали, применяя методы, аналогичные методам из Примера 6, но используя [¹¹С]иодметан в качестве метилирующего агента.

Пример 8: Синтез N-(2-хлор-5-метилтио)-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидина

Пример 8(1): Синтез 2-хлор-5-(метилтио)анилина гидрохлорида

К перемешиваемому раствору 2-хлор-5-(метилтио)бензойной кислоты (5 г, 24,67 ммоль) в трет-бутаноле (20 мл) добавляли триэтиламин (5,25 мл, 37,8 ммоль). После короткого перемешивания капельным методом добавляли дифенилфосфорилазид (6 мл, 27,60 ммоль). Реакционную смесь медленно нагревали до флегмообразования в течение 6 часов и затем охлаждали до комнатной температуры. Растворитель удаляли при пониженном давлении и сырую реакционную смесь растворяли в тетрагидрофуране (12,5 мл), затем добавляли 12,5 мл трифторуксусной кислоты (1:1). Реакционную смесь нагревали до флегмообразования в течение 6 часов и растворитель выпаривали после охлаждения до комнатной температуры. Реакционную смесь обрабатывали NaOH (25%) до доведения рН до 12 с охлаждением на бане лед-вода. Продукт повторно экстрагировали этилацетатом (4×25 мл) и органический слой промывали водой (10 мл). Объединенные экстракты сушили над MgSO₄ и концентрировали в вакууме с получением желтого масла. Продукт очищали колоночной хроматографией (SiO₂, градиент гексаны/EtOAc) и собранные образцы растворяли в диэтиловом эфире и обрабатывали смесью HCl/диэтиловый эфир (10 мл, 1 М) с получением белых кристаллов. Указанный в заголовке продукт представлял собой белое твердое вещество (3,73 г, выход 87%); Т.пл. 180-181°С; TLC: гексаны/EtOAc (9:1) R_f=0,51; MS (масс-спектроскопия (Cl) m/e 174 (М+1 для C₇H₈CINS) и m/е 191 (М+NH₃), ¹H-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.) 7.2-6.7 (m, 3H, Ar-H), 2.5 (s, 3H, S-СН₃).

Пример 8(2): Синтез 3-(бензилтио)анилина

К перемешиваемому раствору гидроксида натрия (2,1 г, 52,5 ммоль) в воде (4 мл), охлаждаемому на ледяной бане, капельным методом добавляли раствор 3-аминотиофенола (4,8 г, 38,4 ммоль) в этаноле (20 мл), затем добавляли раствор бензилхлорида (5 г, 39,5 ммоль) в этаноле (5 мл). После завершения добавления реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов, и она превращалась в коричневый раствор с белым осадком. После отфильтровывания осадка фильтрат концентрировали и остаток переносили в дихлорометан (40 мл). Раствор в дихлорометане три раза промывали водным раствором гидроксида натрия (0,5 M, 3×40 мл) и один раз водой (40 мл). После сушки над MgSO₄ и фильтрации раствор в дихлорометане затем концентрировали в вакууме с получением густого желтого масла в качестве сырого продукта. Его дополнительно очищали посредством флэш-хроматографии (SiO₂, гексаны/CH₂Cl₂, 0-100%) с получением 3-(бензилтио)анилина (6,77 г, 82%) в виде бледно-желтого масла, которое затвердевало в виде белого твердого вещества после стояния при комнатной температуре. Тонкослойная хроматография: дихлорметан, R_f=0,37; ¹Н-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.) 6.6-7.4 (m, 9H, Ar-Н), 4.15(s, 2H, S-CH₂).

Пример 8(3): Синтез 3-(бензилтио)Фенилцианамида

Раствор цианогенбромида (1,42 г, 13,4 ммоль) в безводном диэтиловом эфире (10 мл) медленно добавляли к перемешиваемому раствору 3-(бензилтио)анилина (4,6 г, 21,4 ммоль) в безводном диэтиловом эфире (25 мл) при 0-4°С. После завершения добавления реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов, и она превращалась в коричневый раствор с белым осадком. Этот осадок отфильтровывали и фильтрат промывали водной HCl (1M, 3×40 мл), а затем рассолом (40 мл). Эфирный раствор сушили над MgSO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением желтого масла в качестве сырого продукта. Его дополнительно очищали посредством флэш-хроматографии (SiO₂, CH₂Cl₂/EtOAc, 0-20%) с получением 3-(бензилтио)фенилцианамида (2,82 г, выход 55%) в виде белого твердого вещества: TLC: дихлорметан/EtOAc (93:7), R_f=0,64; ¹H-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.) 7.2-6.7 (m, 9Н, Ar-Н), 4.12 (s, 2H, S-CH₂). IR(KBr): 3178 см^-1(вторичный N-H), 3023-3085 см^-1 (С-Н ароматическое растяжение), 2227 см^-1 (CN).

Пример 8(4): Синтез 3-(бензилтио)фенил-N-метилцианамида

К раствору 3-(бензилтио)фенилцианамида (0,80 г, 3,33 ммоль), растворенного в ацетонитриле (8 мл), добавляли диизопропилэтиламин (0,65 г, 5,0 ммоль) с последующим добавлением метилиодида (0,94 г, 6,66 ммоль). Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником при 80-85°С в течение 3 часов. После удаления растворителей остаток переносили в дихлорометан (40 мл) и этот органический раствор промывали водой (40 мл). После сушки над MgSO₄ и фильтрования раствор в дихлорометане затем концентрировали в вакууме с получением желтого масла в качестве сырого продукта. В результате очистки колоночной хроматографии (SiO₂, гексан/CH₂Cl₂, от 50% до 100%) получали 3-(бензилтио)фенил-N-метилцианамид в виде бледно-желтого масла (0,67, выход 80%): CH₂Cl₂ R_f=0,45; ¹H-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.) 7.3-6.8 (m, 9Н, Ar-Н), 4.06 (s, S-CH₂, 2Н), 3.57 (s, 3H, N-СН₃).

Пример 8(5): Синтез N-(2-хлор-5-метилтио)-фенил-N'-3'-(бензилтио)-фенил-N'-метилгуанидина

В высушенную колбу на 25 мл, снабженную водяным конденсатором, вводили 3-(бензилтио)фенил-N-метилцианамид (0,65 г, 2,56 ммоль), 2-хлор-5-(метилтио)анилин гидрохлорид (0,54 г, 2,56 ммоль) и 1 мл хлорбензола. Затем колбу заполняли газообразным азотом и нагревали при 150°С в течение 3 часов при перемешивании. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры. После удаления хлорбензола в вакууме в качестве сырого продукта оставалось густое стекловидное масло. В результате очистки посредством флэш-хроматографии (SiO₂, CH₂Cl₂/MeOH, 0-20%) получали гуанидина гидрохлорид (0,9 г, выход 85%) в виде твердого вещества: тонкослойная хроматография: CH₂Cl₂/MeOH (9:1), R_f=0,34; ¹H ЯМР (CDC₃) δ (м.д.) 6.8-7.3 (m, 12Н, Ar-Н), 4.06 (s, S-CH₂, 2Н), 3.57 (s, 3H, N-СН₃), 2.35 (s, 3H, S-СН₃).

Пример 8(6): Синтез N-(2-хлор-5-метилтио)-фенил-N'-3'-тиофенил-N'-метилгуанидина

В высушенную колбу на 25 мл под защитой посредством азота добавляли трихлорид алюминия (125 мг, 0,94 ммоль), а затем капельным методом добавляли N-(2-хлор-5-метилтио)-фенил-N'-3'-(бензилтио)-фенил-N'-метилгуанидин (100 мг, 0,23 ммоль) в толуоле (2 мл). Эту смесь перемешивали под азотом при комнатной температуре в течение ночи. Реакцию гасили с помощью уксусной кислоты (0,5 мл), а затем концентрировали реакционную смесь в вакууме с получением густого масла в качестве сырого продукта. В результате очистки посредством флэш-хроматографии (SiO₂, CH₂Cl₂/MeOH, 0-20%) получали указанный в заголовке продукт (70 мг, выход 96%) в виде стекловидного твердого вещества: TLC: CH₂Cl₂/MeOH (9:1), R_f=0,14; ¹H ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.) 6.8-7.3 (m, 7H, Ar-H), 3.35 (s, 3H, N-СН₃), 2.4 (s, 3H, S-СН₃).

Пример 8(7): Синтез N-(2-хлор-5-метилтио)-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидина

Метод HPLC

В опытных аналитических условиях HPLC было установлено, что наиболее эффективное хроматографическое разделение между предшественниками, N-(2-хлор-5-метилтио)-фенил-N'-3'-тиофенил-N'-метилгуанидином, N-(2-хлор-5-тио)фенил-N'-3'-(метилтио)-фенил-N'-метилгуанидином, и стандартом сравнения N-(2-хлор-5-метилтио)-фенил-N'-3'-(метилтио)-фенил-N'-метилгуанидином было следующим: колонка µ-Bondapak С-18 (300×7,8 мм), МР 60/40 ацетонитрил/0,05 M (NH₄)₂HPO₄, скорость потока 2 мл/мин, UV 254 нм. Время удерживания для 3'-дезметилтио- и 5-дезметилтио-предшественников составляло 6,65 минут и 6,01 минут соответственно, тогда как N-(2-хлор-5-метилтио)фенил-N'-(3-метилтио)фенил-N'-метилгуанидин имел время удерживания 11,81 минут.

Метилиодид (0,3-0,6 мг, 1-2 эквивалента к предшественнику) добавляли в раствор, содержащий N-(2-хлор-5-метилтио)-фенил-N'-3-тиофенил-N'-метилгуанидин (0,5-0,8 мг), бутоксид калия (0,5-1,0 мг, 2-4 эквивалента к предшественнику) либо в N,N-диметилформамиде, либо в безводном этаноле (250-350 мкл). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут и затем гасили добавлением 100 мкл HPLC подвижной фазы (0,05 М (NH₄)₂HPO₄). Аликвоту реакционной смеси отбирали и инъецировали в HPLC колонку для анализа. На основании результатов HPLC анализа было показано, что указанный в заголовке продукт получался с выходом более 75% как с N,N-диметилформамидом, так и с этанолом, используемыми в качестве растворителей во всех тест-экспериментах, химия работала высокостабильным образом, и разделение между указанным в заголовке продуктом и его дезметилтио-предшественником было достаточным для полупрепаративного разделения в «горячей» химии.

Пример 9: Синтез N-(2-хлор-5-метилтио)-фенил-N'-(3-[¹¹C]метилтио)-фенил-N'-метилгуанидина

[¹¹С]Метилиодид, который получали восстановлением [¹¹С]CO₂ с использованием алюмогидрида лития с последующим иодированием с помощью иодистоводородной кислоты и перегонки, собирали в сосуд, содержащий N-(2-хлор-5-метилтио)-фенил-N'-3-тиофенил-N'-метилгуанидин (0,5 мг), бутоксид калия (0,8 мг) в N,N-диметилформамиде (300 мкл). Химию введения радиоактивной метки осуществляли при комнатной температуре в течение 5 минут и реакционную смесь гасили добавлением 100 мкл HPLC подвижной фазы (0,05 M (NH₄)₂HPO₄). Аликвоту образца отбирали из реакционной смеси и инъецировали в радиоактивную HPLC систему. Анализ проводили в тех же хроматографических условиях, что и в Примере 8. Совместная элюция с холодным стандартом сравнения в одних и тех же аналитических условиях подтвердила, что радиоактивный пик, который элюировался со времением удерживания 11,81 минут, представлял собой указанный в заголовке продукт. Было установлено, что радиохимический выход, скорректированный на распад, для указанного в заголовке продукта на основе [¹¹C]метилиодида составлял более 90%. Общее время для радиосинтеза, начиная с [¹¹С]CO₂, находилось в пределах 20 минут после окончания циклотронной бомбардировки.

Биологические примеры

Данные по биораспределению для N-(2-хлор-5-(2-[¹⁸F]фтор-этилтио))-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидина

Материалы и методы

N-(2-Хлор-5-(2-[¹⁸F]фтор-этилтио))-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидин получали согласно Примеру 4 (синтетическая композиция - приблизительно 3% этанола в 0,9%-ном (мас./об.) физиологическом растворе) с радиохимической чистотой приблизительно 99% и удельной активностью в момент инъекции в диапазоне 4-16 ГБк/нмоль^-1. Данные по биораспределению и крови получали от 11 взрослых самцов крыс Sprague-Dawley (дипазон массы тела от 269 до 329 г; среднее ± С.О. (средняя квадратическая ошибка)=300±18 г). N-(2-Хлор-5-(2-[¹⁸F]фтор-этилтио))-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидин инъецировали непосредственно в хвостовую вену каждой крысы под анестезией изофлураном. Затем каждому животному давали возможность выйти из анестезии. В заданные моменты времени после инъекции крыс умерщвляли путем сворачивания шеи под анестезией и быстро отбирали образцы тканей тела и головного мозга.

Биораспределение

Данные получали, используя два синтеза. Крысам давали в среднем приблизительно 86 МБк (85,3 МБк для первого экспериментального дня и 87,3 МБк для второго экспериментального дня) в объеме 0,20 мл (синтетическая композиция - приблизительно 3% спирта) посредством прямой внутривенной инъекции в хвостовую вену. Масса коинъецированного N-(2-хлор-5-(2-[¹⁸F]фтор-этилтио))-фенил-N'-(3-метилтио)фенил-N'-метилгуанидина варьировала в диапазоне 0,7-2,9 нмоль·кг^-1. Методические детали совместно с обработкой и подсчетом образцов можно найти в Hume et al., Nucl. Med. Biol. (1991) 18: 339-351. Данные нормализировали по инъецированной радиоактивности и массе тела, получая:

'единицы захвата'=(cpm (число импульсов в минуту)·г^-1 массы влажной ткани)·(инъецированные cpm·r^-1 массы тела)^-1.

Результаты

Данные по концентрации радиоактивности дополнительно суммированы в Таблицах 1 (периферическая ткань) и 2 (головной мозг). Исследования метаболитов не проводили, доля общей радиоактивности, отражающая метку, ассоциированную с родительским N-(2-хлор-5(2-[¹⁸F]фтор-этилтио))-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидином, не известна. Внимание, образцы плазмы и крови собирали после умерщвления из желудочка сердца.

Распределение в организме

Данные суммированы в Таблице 1. Среди тканей, образцы которых были собраны, скелетная мышца, кожа и яичко показали низкое исходное содержание приблизительно порядка 0,4 единиц захвата, которое сохранялось на протяжении эксперимента. Кости показали высокий исходный захват порядка 1,4, который понижался до приблизительно 0,8 на протяжении 90 минут эксперимента, не указывая на вероятность дефторирования. Высокий исходный захват наблюдали в легком (приблизительно 30 единиц захвата), он быстро понижался до 2 единиц захвата через 90 минут. Аналогичные профили наблюдали в почках и сердце. Более низкую скорость потери радиоактивности наблюдали в печени, селезенке и кишечнике.

Таблица 1

Распределение радиоактивности в периферических органах и жидкостях тела крыс как функция времени после внутривенной инъекции N-(2-хлор-5-(2-[¹⁸F]фтор-этилтио))-фенил-N'-(3-метилтио)фенил-N'-метилгуанидина. Корректировку на объем крови не проводили. Данные представлены в 'единицах захвата'. Нумерация тканей следующая: 1 - кости, 2 - скелетная мышца, 3 - кожа, 4 - моча, 5 - жир, 6 - яичко, 7 - тонкий кишечник, 8 - содержимое тонкого кишечника, 9 - толстый кишечник, 10 - содержимое толстого кишечника, 11 - селезенка, 12 - печень, 13 - почка, 14 - желудок, 15 - легкое, 16 - сердце (желудочек). Также для сравнения показаны данные для плазмы (17) в эквивалентные моменты времени забора образцов.

Ткань	Время (минуты) (n = количество точек сбора данных)
	2(n=2)	5(n=1)	10(n=2)	30(n=3)	60(n=3)	90(n=1)
1	1,355	1,440	0,793	1,014±0,019	0,944±0,305	0,889
2	0,288	0,517	0,391	0,487±0,036	0,410±0,096	0,357
3	0,338	0,517	0,248	0,491±0,019	0,435±0,109	0,387
4	0,109	16,760	13,589	49,593±30,733	23,375±18,208	26,947
5	0,199	0,814	0,234	0,613±0,175	0,405±0,358	0,548
6	0,456	0,528	0,363	0,619±0,081	0,605±0,150	0,559
7	4,537	3,845	1,618	2,241±0,617	1,841±0,678	1,942
8	1,390	1,449	1,162	6,002±3,338	10,518±7,766	8,700
9	3,338	3,442	1,359	1,619±0,494	7,291±10,308	0,775
10	0,113	0,148	0,109	0,445±0,035	1,176±1,109	0,764
11	3,985	3,676	3,008	2,713±0,086	1,675±0,135	1,418
12	5,251	5,648	3,199	6,023±0,699	3,659±0,822	2,856
13	12,975	10,113	3,931	3,287±0,208	2,429+0,527	2,127
14	0,843	1,245	0,532	1,558±0,443	1,227±0,351	1,103
15	32,475	25,015	10,229	3,786±0,292	2,387±0,195	2,150
16	6,412	2,761	1,119	0,740±0,019	0,505±0,104	0,464
17	0,264	0,135	0,102	0,229±0,047	0,222±0,055	0,163

Распределение в головном мозге

Данные суммированы в Таблице 2. Все ткани имели относительно высокий исходный захват порядка приблизительно 4 единиц захвата в момент времени 2 минуты после в.в. (внутривенной) инъекции радиолиганда. Затем имело место постепенное снижение активности с достижением приблизительно 0,4 единиц захвата в момент времени 90 минут после инъекции радиолиганда. Небольшой относительно мозжечка сигнал был получен в гиппокампе и коре головного мозга, возраставший от приблизительно 0,8 до 1,3 на протяжении первых 40 минут и понижавшийся затем до 1 к моменту времени 90 минут.

Периферический клиренс N(2-хлор-5-(2-[¹⁸F]фтор-этилтио))-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидина происходил через почки в мочу и через кишечник. Головной мозг крыс показал высокий захват радиоактивности в самый ранний момент отбора образцов (2 минуты) после в.в. инъекции N-(2-хлоро-5-(2-[¹⁸F]-фтор-этилтио))фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидина. Дифференциальную гетерогенность было трудно обнаружить из-за физиологически 'закрытого' состояния или состояния отдыха рецепторов. Поскольку мозжечок показал самое низкое удержание после приблизительно 60 минут, при выражении данных относительно радиоактивности мозжечка в гиппокампе наблюдали небольшой сигнал (область известной высокой плотности рецепторов NMDA; Bowery et al., (1988) Br. J. Pharmacol. 93:944-954).

Таблица 2

Распределение радиоактивности в ткани головного мозга крыс как функция времени после внутривенной инъекции N-(2-хлоро-5-(2-[¹⁸F]-фтор-этилтио))фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидина. Данные представлены в 'единицах захвата'. Звездочки означают средние значения от 2 или 3 крыс на временную точку. Там, где n=3, показаны значения в виде среднее ±С.О. Все остальные значения получены от 1 крысы на временную точку. Нумерация тканей следующая: 1 - обонятельный бугорок, 2 - энторинальная кора, 3 - гипоталамус, 4 - таламус, 5 - предфронтальная кора, 6 - полосатое тело, 7 - соматосенсорная кора, 8 - гиппокамп, 9 - затылочная кора, 10 -нижний холмик, 11 - верхний холмик, 12 - мост и продолговатый мозг, 13 - мозжечок. Также показаны данные для плазмы (17) для сравнения с данными для крови (18).

Ткань	Время (минуты) (n = количество точек сбора данных)
	2 (n=1)	5 (n=1)	10 (n=2)	30 (n=3)	60 (n=3)	90 (n=1)
1	2,826	3,062	1,300	0,981±0,235	0,504±0,062	0,504
2	2,766	2,442	1,404	0,941±0,086	0,502±0,095	0,383
3	3,397	2,443	1,275	1,076±0,250	0,533±0,115	0,466
4	4,460	2,566	1,353	1,415±0,203	0,553±0,108	0,551
5	3,808	3,099	1,649	1,168±0,042	0,519±0,105	0,414
6	2,306	1,817	1,433	1,101±0,202	0,481±0,136	0,485
7	3,531	2,772	1,588	1,037±0,103	0,517±0,107	0,376
8	2,864	2,250	1,396	1,088±0,142	0,548±0,119	0,391
9	4,008	2,883	1,651	1,041±0,067	0,541±0,124	0,423
10	6,716	3,292	1,539	0,841±0,084	0,456±0,079	0.306
11	4,977	3,541	1,677	1,086±0,286	0,486±0,101	0,386
12	3,678	2,877	1,530	1,110±0,129	0,551±0,143	0,406
13	4,204	2,761	1,451	0,919±0,110	0,454±0,082	0,366
17	0,264	0,135	0,102	0,229±0,047	0,222±0,055	0,163
18	0,288	0,261	0,146	0,269+0,042	0,229±0,068	0,180

Пример радиофармацевтической композиции

Композиция, упомянутая в биологических примерах, приведенных в описании изобретения (для N-(2-хлор-5-(2-[¹⁸F]фторэтилтио))-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидина, т.е. соединения формулы Ia, где R¹ представляет собой Me, R² представляет собой ¹⁸F-Et, R³ представляет собой Me, и R⁴ представляет собой Me), имеет следующие характеристики:

внешний вид: прозрачная, бесцветная, без твердых частиц;

RCP (радиохимическая чистота): более 95%;

рН: 4-7;

лиганд: менее 16 мкг (в итоговом преп.);

идентификация: посредством совместной элюции с аутентичным образцом (HPLC);

неидентифицированные стабильные примеси: менее 5 мкг;

индивидуальные химические частицы: менее 1,5 мкг;

содержание EtOH: не более чем 3-10% мас./об.;

остаточный растворитель (ацетонитрил): менее 4 мг;

остаточный триэтиламин: не более чем 150 мкг;

радионуклидная чистота: не менее чем 99,9%;

апирогенность: менее 175 EU в итоговой дозе;

стерильность: соответствует Европейской Фармакопее.

Композицию приготавливают с использованием прибора для автоматизированного синтеза FASTLab (GE Healthcare) путем проведения следующих стадий:

Стадия 1 (перенос ¹⁸F к кассете)

Исходную радиоактивность дозируют во флакон и путем добавления воды увеличивают объем до 2 мл (для моделирования типичного объема мишени из циклотрона); затем с использованием вакуума радиоактивный компонент переносят из флакона во входное отверстие кассеты FASTlab, предназначенное для радиоактивного компонента.

Стадия 2 (захват ¹⁸F посредством QMA)

Радиоактивный компонент переносят из входного отверстия, предназначенного для радиоактивного компонента, в (предварительно обработанный) картридж QMA, где ¹⁸F захватывается, а вода проходит через флакон регенерации ¹⁸O воды, используя комбинацию N₂ для поддавливания и вакуума для вытягивания.

Стадия 3 (элюция ¹⁸F с QMA)

70 мкл "FDG-элюанта" (К222, К₂СО₃) извлекают из флакона для элюанта, используя шприц объемом 1 мл. Затем из водного резервуара отбирают 550 мкл воды и добавляют к элюанту в шприц объемом 1 мл. Затем с использованием раствора элюант/вода в шприце объемом 1 мл элюируют ¹⁸F, захваченный на картридже QMA, в реакционный сосуд, и к реакционному сосуду прикладывают вакуум для перемещения раствора через картридж QMA.

Стадия 4 (сушка ¹⁸F)

Раствор ¹⁸F и элюанта сушат в течение 20 минут путем нагревания (100°С) и комбинирования использования азота и вакуума для удаления выпариваемого растворителя и воды из реакционного сосуда в сосуд для сборки отходов.

Стадия 5 (радиосинтез ¹⁸F-этилтозилата)

1 мл раствора этилендитозилатного предшественника (2,5 мг на мл MeCN) извлекают из флакона, используя центральный (5 мл) шприц, и дозируют в реакционный сосуд, содержащий сухой ¹⁸F. Затем реакционный сосуд подвергают герметизации и путем нагревания в течение 15 минут при 86°С проводят реакцию.

Стадия 6 (удаление растворителя из ¹⁸F-этилтозилата)

Неочищенный ¹⁸F-этилтозилатный/этилендитозилатный раствор сушат в течение 10 минут путем нагревания (80°С) и комбинирования использования азота и вакуума для удаления выпариваемого растворителя из реакционного сосуда в сосуд для сборки отходов.

Стадия 7 (внесение 350 мкл элюанта во флакон для предшественника)

350 мкл "FDG-элюанта" (К222, К₂СО₃) извлекают из флакона для элюанта и добавляют во флакон для предшественника, используя шприц объемом 1 мл, и хранят в течение 1 минуты.

Стадия 8 (внесение предшественника в реакционный сосуд)

5 мг (13 мкмоль) тиольного предшественника в 1,5 мл этанола извлекают из флакона путем создания вакуума в реакционном сосуде.

Стадия 9 (алкилирование предшественника)

Затем реакционный сосуд подвергают герметизации и осуществляют алкилирование: сначала путем нагревания в течение 2 минут при 80°С, а потом в течение 13 минут при 100°С.

Стадия 10 (промывка петли водой)

Воду в суммарном количестве 10 мл извлекают из водного резервуара, используя центральный (5 мл) шприц, и направляют через HPLC-петлю в два шприцевых подвижных элемента.

Стадия 11 (гашение реакции и перенос из FASTlab в HPLC-петлю)

Используя центральный (5 мл) шприц, 2 мл воды добавляют из водного резервуара в реакционный сосуд. Используя центральный (5 мл) шприц, 1 мл 0,1М HCl добавляют из флакона в реакционный сосуд. Затем, используя тот же самый шприц, отбирают из реакционного сосуда смесь и переносят из кассеты в HPLC-петлю с последующей азотной продувкой линии и кассетного канала для текучей среды с целью выведения какого-либо остаточного раствора в HPLC-петлю.

Стадия 11 (очистка посредством HPLC)

Стадию HPLC контролируют с помощью программного обеспечения для HPLC до тех пор, пока не осуществляют фракционирование. HPLC-фракцию обратно переносят в FASTlab, используя правосторонний (right hand) (5 мл) шприц для перемещения фракции обратно в кассету, а затем добавления к водному резервуару для разбавления.

Стадия 12 (SPE композиция)

Разбавленную HPLC фракцию (более 100 мл) загружают в tC18⁺ SPE картридж, прикладывая вакуум в течение 11 минут для перемещения всего содержимого водного резервуара через картридж в сосуд для сборки отходов. Шприц 3 промывают 2 партиями воды по 5 мл, затем tC18⁺ SPE картридж промывают водой, удаляют воду с помощью вакуума в течение 30 секунд и последующей сушки под вакуумом. Используя правосторонний (5 мл) шприц и 1 мл этанола из флакона, картридж SPE подвергают элюции во флакон с 14 мл солевого раствора, содержащего 1,5 мг аскорбиновой кислоты.

Для приготовления N-(2-хлор-5-(2-[¹⁸F]фторэтилтио))-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидина (соединение формулы Ia, где R¹ представляет собой Me, R² представляет собой ¹⁸F-Et, R³ представляет собой Me и R⁴ представляет собой Me), используют следующий набор компонентов.

Номер флакона	Название флакона	Состав
1	Элюант	FASTlab элюант (1,5 мл) (К222=53 мг/мл; К2СО3 9,5 мг/мл) Растворитель: (вода 12,5%, EtOH 87,5%)
2	TsO(CH2)2OTs	Этилендитозилат (4,0 мг), MeCN (1,6 мл)
3	EtOH	EtOH (4,0 мл)
4	HCl	0,1М HCl (4,0 мл)
5	CNS	Тиольное соединение предшественник (15 мг) EtOH (1,8 мл)

1. Соединение формулы (I):

или его физиологически приемлемая соль, где
R¹ представляет собой водород или С_1-4алкил;
каждый из R² и R⁴ независимо выбран из С_1-4алкила, [¹¹С]-С_1-4алкила и [¹⁸F]-С_1-4фторалкила, при условии, что по меньшей мере один из R² и R⁴ представляет собой [¹¹С]-С_1-4алкил или [¹⁸F]-С_1-4фторалкил; и
R³ представляет собой галогено.

2. Соединение по п.1 формулы (Ia):

или его физиологически приемлемая соль, где R¹, R², R³ и R⁴ являются такими, как определено в п.1.

3. Соединение по п.1 или 2, выбранное из:
N-(2-хлор-5-[¹⁸F]фторметилтио)-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидина;
N-(2-хлор-5-(2-[¹⁸F]фторэтилтио))-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидина;
N-(2-хлор-5-метилтио)-фенил-N'-(3-[¹¹С]метилтио)-фенил-N'-метилгуанидина;
или физиологически приемлемая соль любого из них.

4. Соединение по п.1 или 2 для применения в способе in vivo диагностирования или визуализации, таком как PET (позитронная эмиссионная томография).

5. Применение соединения по любому из пп.1-3 в изготовлении радиофармацевтического средства для in vivo диагностирования или визуализации NMDA (N-метил-D-аспартат)-опосредованного заболевания.

6. Радиофармацевтическая композиция для визуализации NMDA рецепторов, содержащая соединение по п.1 в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый эксципиент.

7. Способ in vivo диагностирования или визуализации NMDA-опосредованного заболевания, включающий введение соединения по любому из пп.1-3.

8. Соединение формулы (II):

или его физиологически приемлемая соль, где один из R² или R⁴ представляет собой водород или защитную группу для тиола, такую как бензил, а другой представляет собой водород, С_1-4алкил или защитную группу для тиола, такую как бензил; R¹ представляет собой водород или С_1-4алкил, и R³ представляет собой галогено.

9. Соединение формулы (II) по п.8, выбранное из:
N-(5-бензилтио-2-хлор)-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидина;
N-(2-хлор-5-меркапто)-фенил-N'-(3-метилтио)-фенил-N'-метилгуанидина;
N-(2-хлор-5-метилтио)-фенил-N'-3'-(бензилтио)-фенил-N'метилгуанидина;
N-(2-хлор-5-метилтио)-фенил-N'-3'-тиофенил-N'-метилгуанидина
или их физиологически приемлемой соли.

10. Способ получения соединения формулы (I):

или его физиологически приемлемой соли, где
R¹ представляет собой водород или С_1-4алкил;
каждый из R² и R⁴ независимо выбран из С_1-4алкила, [¹¹С]-С_1-4алкила и [¹⁸F]-С_1-4фторалкила, при условии, что по меньшей мере один из R² и R⁴ представляет собой [¹¹С]-С_1-4алкил или [¹⁸F]-С_1-4фторалкил; и
R³ представляет собой галогено,
который включает взаимодействие соединения формулы (II):

где один из R² или R⁴ представляет собой водород или защитную группу для тиола, такую как бензил, а другой представляет собой водород, C_1-4алкил или защитную группу для тиола, такую как бензил; R¹ представляет собой водород или С_1-4алкил, и R³ представляет собой галогено;
путем (1) удаления защитных групп для тиола и (2) взаимодействия с соответствующим алкилгалогенидом [¹¹С]-С_1-4алкил-Х или [¹⁸F]-C_1-4фторалкил-Y, где Х и Y представляют собой независимо галогено, предпочтительно хлоро, иодо или бромо, или другую подходящую уходящую группу, такую как арил- или алкилсульфонат, например тозилат, трифлат или мезилат;
в подходящем растворителе и в присутствии основания.

11. Набор для изготовления радиофармацевтической композиции, содержащий соединение формулы (II), как оно определено в п.8 или 9; алкилгалогенид [¹¹С]-С_1-4алкил-Х или [¹⁸F]-С_1-4фторалкил- Y, где Х и Y представляют собой независимо галогено, предпочтительно хлоро, иодо или бромо, или другую подходящую уходящую группу, такую как арил- или алкилсульфонат, например тозилат, трифлат или мезилат;
и фармацевтически приемлемый эксципиент.