Производные 4-арилкумаринов и противоопухолевое лекарственное средство на их основе

Настоящее изобретение относится к производным 4-арилкумаринов и лекарственному средству на их основе, которые могут быть использованы для лечения опухолей, общей формулы

,

где А обозначает группу

где C_nH_m представляет собой остатки жирных кислот предельных и непредельных рядов, n представляет собой число 13, 15 или 17, m представляет собой число 27, 31 или 33, a R₁, R₂, R₃ представляют собой атомы водорода и/или метоксигруппу ОСН₃. Лекарственное средство содержит указанные производные 4-арилкумаринов, включенные в липосомы, содержащие фосфотидилхолин, фосфотидилинозит и липидную форму олигосахарида. Получены новые соединения с противоопухолевой активностью и новое лекарственное средство, обладающее уменьшенной системной токсичностью и увеличенной мембранотропностью. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 1 табл., 3 ил.

 

Настоящее изобретение относится к гетероциклическим соединениям, содержащим шестичленные кольца с одним атомом кислорода в качестве гетероатома, конденсированные с другими кольцами, а именно к новым производным 4-арилкумаринов, которые могут быть использованы в качестве активного вещества противоопухолевых лекарственных средств, а также к лекарственному средству, обладающему противоопухолевой активностью, которое может найти применение при лечении онкологических заболеваний.

В настоящее время онкологические заболевания являются одной из основных причин смерти во всем мире. В 2007 году произошло 7,9 миллиона случаев смерти от этой болезни. По прогнозам, число случаев смерти от онкологических заболеваний в мире будет продолжать расти и в 2030 году достигнет 12 миллионов случаев смерти. В связи с этим, синтез новых соединений и создание на их основе противоопухолевых препаратов, обладающих улучшенными фармакокинетическими свойствами, является актуальной задачей здравоохранения.

Известны химические соединения, противоопухолевое действие которых заключается в ингибировании митоза активно полиферирующих опухолевых клеток.

Цитотоксическая и противоопухолевая активность известных антимитотических соединений обусловлена нарушением обратимости процесса полимеризации и деполимеризации белковых молекул α- и β-тубулина, что приводит к нарушению формирования митотического веретена, образование которого предшествует делению клетки (Biochem. Pharmacol., 1976, 25, 138).

Известно достаточно большое количество химических соединений, обладающих цитотоксической активностью по отношению ко многим видам опухолевых клеток. К таким соединениям относятся алкалоиды ряда колхицина, комбретастатин, а также арилкумарины и их производные. Однако каждый из них имеет недостатки.

Недостатком колхицина (например, US 2010105780 А1, 2010.04.29) и его производных (например, WO 2008102397 А2, 2008.08.28) является возникновение побочных эффектов при их применении, в частности значительная нейротоксичность (Med. Res. Rev. 2008, 28, 155-183).

Недостатком комбретастатина (например, US 4996237 А, 1991.02.26) и его производных (например, US 2009186857 А1, 2009.07.23) является низкая селективность, что приводит к неспецифическому разрушению сосудов здоровых тканей (Expert Opin Investig Drugs. 2004, 13, 1171Y1182).

Кроме того, недостатком комбретастатина и его производных является низкая эффективность за счет нежелательных побочных эффектов при применении in vivo вследствие их самопроизвольного превращения из активной цис-формы в неактивную транс-форму (Curr. Opin. Pharmacol, 2001, 1, 370).

Настоящее изобретение относится к производным арилкумаринов, цитотоксическая активность которых в настоящее время доказана в отношении клеток карциномы молочной железы АТСС НТВ-22 и аденокарциномы молочной железы человека HBL100 (например, J. Med. Chem. 2003, 46, 5437, WO 2004069820 A1, 2004.08.19).

Недостатком известных производных арилкумаринов, как и других вышеприведенных соединений, является их значительная системная токсичность, обусловленная низкой селективностью, а также необходимость дополнительного использования фармакопейных детергентов для введения в живой организм.

Ближайшим аналогом являются 4-арилкумарины, известные по J. Med. Chem. 2003, 46, 5437, общей формулы

где R₁, R₂ и R₃ представляют собой атомы водорода или метоксигруппу ОСН₃.

Они обладают вышеприведенными недостатками.

Настоящее изобретение направлено на создание новой группы химических соединений на основе производных 4-арилкумаринов, которые структурно отличаются от известных соединений, благодаря чему обладают способностью встраиваться в липосому лекарственного средства и меньшей системной токсичностью.

Технический результат достигается путем синтеза производных 4-арилкумаринов общей формулы ,

где

А обозначает группу

,

в которой C_nH_m представляет собой остатки жирных кислот предельных и/или непредельных рядов, при этом n≥13, m≥27, a R₁, R₂, R₃ представляют собой атомы водорода и/или метоксигруппу ОСН₃.

В одном из возможных вариантов выполнения настоящего изобретения производные 4-арилкумаринов представляют собой 4-(4'-Метокси-3'-миристилоксифенил)кумарин.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения производные 4-арилкумаринов представляют собой 4-(4'-Метокси-3'-пальмитоилоксифенил)кумарин.

В третьем варианте выполнения настоящего изобретения производные 4-арилкумаринов представляют собой 4-(4'-Метокси-3'-олеоилоксифенил)кумарин.

В четвертом варианте выполнения настоящего изобретения производные 4-арилкумаринов представляют собой 5,7-Диметокси-4-(4'-метокси-3'-миристилоксифенил)кумарин.

В пятом варианте выполнения настоящего изобретения производные 4-арилкумаринов представляют собой 5,7-Диметокси-4-(4'-метокси-3'-пальмитоилоксифенил)кумарин.

В шестом варианте выполнения настоящего изобретения производные 4-арилкумаринов представляют собой 5,7-Диметокси-4-(4'-метокси-3'-олеоилоксифенил)кумарин.

В седьмом варианте выполнения настоящего изобретения производные 4-арилкумаринов представляют собой 5,6,7-Триметокси-4-(4'-метокси-3'-миристилоксифенил)кумарин.

В восьмом варианте выполнения настоящего изобретения производные 4-арилкумаринов представляют собой 5,6,7-Триметокси-4-(4'-метокси-3'-пальмитоилоксифенил)кумарин.

В девятом варианте выполнения настоящего изобретения производные 4-арилкумаринов представляют собой 5,6,7-Триметокси-4-(4'-метокси-3'-олеоилоксифенил)кумарин.

Другим аспектом настоящего изобретения является создание новых липосомальных противоопухолевых лекарственных средств, использующих в качестве активного вещества производные 4-арилкумаринов по первому аспекту изобретения.

Известные в настоящее время из уровня техники лекарственные средства, применяемые для лечения онкологических заболеваний на основе приведенных выше интактных химических соединений, включая интактный 4-арилкумарин, обладают рядом недостатков.

Основной их недостаток заключается в значительной системной токсичности, а также низкой мембранотропности (способность проникать через мембраны клеток).

Ближайшим аналогом является лекарственное средство, содержащее активное вещество в виде 4-арилкумаринов, известное по J. Med. Chem. 2003, 46, 5437, недостаток которого указан выше.

Техническим результатом для второго аспекта настоящего изобретения является создание нового лекарственного средства, обладающего высокой селективностью действия по отношению к опухолевым тканям, для реализации которого впервые предложено включать производные 4-арилкумаринов в липосому лекарственного средства.

Преимущество изобретения заключается в уменьшении системной токсичности и увеличении мембранотропности.

Технический результат достигается путем создания лекарственного средства, содержащего активное вещество в виде производных 4-арилкумаринов общей формулы

,

где

А обозначает

,

в котором C_nH_m представляет собой остатки жирных кислот предельных и непредельных рядов, где n≥13, m≥27, a R₁, R₂, R₃ представляют собой атомы водорода и/или метоксигруппу ОСН₃, при этом оно включено в липосому, содержащую фосфотидилхолин, фосфотидилинозит и липидную форму олигосахарида.

Целесообразно в качестве липидной формы олигосахарида использовать SiaLeX-PEG-DG.

Сущность изобретения по первому аспекту, позволяющая реализовать сформулированную выше задачу, заключается в присоединении к 4-арилкумаринам липофильного фрагмента жирных кислот, позволяющего 4-арилкумаринам закрепиться в липосоме, что обеспечивает селективную доставку 4-арилкумаринов к опухолевой ткани и снижает его системную токсичность.

Кроме того, наличие липофильного фрагмента облегчает проникновение 4-арилкумаринов через клеточные мембраны, т.е. повышает их мембранотропность.

Общая схема синтеза производных 4-арилкумаринов выгладит следующим образом:

При использовании заявляемого изобретения C_nH_m представляет собой остатки жирных кислот предельных и/или непредельных рядов, R₁, R₂, R₃ могут быть одинаковыми или различными атомами водорода и/или метоксигруппой ОСН₃. При использовании заявляемого изобретения C_nH_m представляет собой остатки жирных кислот предельных и/или непредельных рядов, R₁, R₂, R₃ могут быть одинаковыми или различными атомами водорода и/или метоксигруппой ОСН3.

Используемый метод синтеза позволяет получить любые производные 4-арилкумаринов с длинными углеродными цепями (C_n≥13H_m≥27), которые обладают свойством встраиваться в липосому лекарственного средства.

Нже приведены примеры производных 4-арилкумаринов с n=13, 15, 17 и m=27, 31, 35 соответственно и с различными R₁, R₂, и R₃: C_nH_m=C₁₃H₂₇ (остаток миристиновой кислоты), R₁=R₂=R₃=Н, т.е. производные 4-арилкумаринов представляют собой 4-(4'-Метокси-3'-миристилоксифенил)кумарин; C_nH_m=С₁₅Н₃₁ (остаток пальмитиновой кислоты), R₁=R₂=R₃=Н, т.е. производные 4-арилкумаринов представляют собой 4-(4'-Метокси-3'-пальмитоилоксифенил)кумарин; C_nH_m=С₁₇Н₃₃ (остаток олеиновой кислоты), R₁=R₂=R₃=Н, т.е. производные 4-арилкумаринов представляют собой 4-(4'-Метокси-3'-олеоилоксифенил)кумарин; C_nH_m=C₁₃H₂₇ (остаток миристиновой кислоты), R₁=R₃=ОСН₃, R₂=Н, т.е. производные 4-арилкумаринов представляют собой 5,7-Диметокси-4-(4'-метокси-3'-миристилоксифенил)кумарин; C_nH_m=С₁₅Н₃₁ (остаток пальмитиновой кислоты), R₁=R₃=ОСН₃, R₂=Н, т.е. производные 4-арилкумаринов представляют собой 5,7-Диметокси-4-(4'-метокси-3'-пальмитоилоксифенил)кумарин; C_nH_m=С₁₇Н₃₃ (остаток олеиновой кислоты), R₁=R₃=ОСН₃, R₂=Н, т.е. производные 4-арилкумаринов представляют собой 5,7-Диметокси-4-(4'-метокси-3'-олеоилоксифенил)кумарин; C_nH_m=С₁₃Н₂₇ (остаток миристиновой кислоты), R₁=R₂=R₃=ОСН₃, т.е. производные 4-арилкумаринов представляют собой 5,6,7-Триметокси-4-(4'-метокси-3'-миристилоксифенил)кумарин; C_nH_m=С₁₅Н₃₁ (остаток пальмитиновой кислоты), R₁=R₂=R₃=ОСН₃, т.е. производные 4-арилкумаринов представляют собой 5,6,7-Триметокси-4-(4'-метокси-3'-пальмитоилоксифенил)кумарин; C_nH_m=С₁₇Н₃₃ (остаток олеиновой кислоты), R₁=R₂=R₃=ОСН₃, т.е. производные 4-арилкумаринов представляют собой 5,6,7-Триметокси-4-(4'-метокси-3'-олеоилоксифенил)кумарин.

Общая методика получения заявляемого соединения и его вариантов включает следующие операции.

0.22 ммоль жирной кислоты растворяют в 1 мл безводного тетрагидрофурана в атмосфере аргона, добавляют 0.28 ммоль оксолилихлорида, перемешивают в течение 1 часа при 65°С и удаляют растворитель. Оставшийся после удаления осадок сушат при пониженном давлении (10 Па) в течение 2 часов при 40°С. Далее осадок вновь растворяют в 2 мл тетрагидрофурана и добавляют к феноляту, который получают из 0.19 ммоль соответствующего 4-арилкумарина, растворенного в 1 мл безводного тетрагидрофурана и 0.33 ммоль гидрида натрия. Полученную смесь перемешивают 2 часа при 65°С в атмосфере аргона. Затем удаляют растворитель, остаток растворяют в этилацетате и трижды экстрагируют 5%-ным раствором NaOH. Органический слой сушат над безводным Na₂SO₄. Конечный продукт выделяют колоночной хроматографией на силикагеле.

Получение того или иного соединения определяется использованием конкретных жирной кислоты и 4-арилкумарина.

Пример 1.

4-(4'-Метокси-3'-миристилоксифенил)кумарин (C_nH_m=С₁₃Н₂₇, R₁=R₂=R₃=Н), бесцветное масло.

Найдено (%): С, 75.91; Н, 8.03. С₃₀Н₃₈О₅. Вычислено (%): С, 75.28; Н, 8.00. Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 0.87 (т, 3Н, СН₃, J=6.4); 1.25 (м, 20Н, СН₂); 1.77 (м, 2Н, С(O)СН₂СН ₂); 2.60 (т, 2Н, C(O)CH₂, J=7.4); 3.91 (с, 3Н, ОСН₃); 6.36 (с, 1Н, Н(3)); 7.12 (м, 2Н, Н(5'), H(6')); 7.33 (м, 3Н, Н(2'), Н(6), Н(8)); 7.54 (м, 2Н, Н(5), Н(7)).

Пример 2.

4-(4'-Метокси-3'-пальмитоилоксифенил)кумарин (C_nH_m=С₁₅Н₃₁, R₁=R₂=R₃=H), бесцветное масло.

Найдено (%): С, 76.11; Н, 8.35. С₃₂Н₄₂О₅. Вычислено (%): С, 75.86; Н, 8.36. Спектр ЯМР ^lH (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 0.86 (т, 3Н, СН₃, J=7,2); 1.26 (м, 24Н, СН₂); 1.73 (м, 2Н, С(O)СН₂СН ₂); 2.58 (т, 2Н, C(O)CH₂, J=7.2); 3.90 (с, 3Н, ОСН₃); 6.36 (с, 1H, Н(3)); 7.14 (м, 2Н, Н(5'), H(6')); 7.30 (м, 3Н, Н(2'), Н(6), Н(8)); 7.54 (м, 2Н, Н(5), Н(7)).

Пример 3.

4-(4'-Метокси-3'-олеоилоксифенил)кумарин (C_nH_m=С₁₇Н₃₃, R₁=R₂=R₃=Н), желтое масло.

Найдено (%): С, 76.42; Н, 8.28. С₃₄Н₄₄О₅. Вычислено (%): С, 76.66; Н, 8.33. Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 0.85 (м, 3Н, СН₃); 1.30 (м, 20Н, СН₂); 1.78 (м, 2Н, С(O)СН₂СН ₂); 2.02 (м, 4Н, СН ₂СН=); 2.61 (т, 2Н, C(O)CH₂, J=7.4); 3.91 (с, 3Н, ОСН₃); 5.34 (м, 2Н, СН=СН); 6.36 (с, 1H, Н(3)); 7.12 (м, 2Н, Н(5'), Н(6')); 7.34 (м, 3Н, Н(2'), Н(6), Н(8)); 7.55 (м, 2Н, Н(5), Н(7)).

Пример 4.

5,7-Диметокси-4-(4'-метокси-3'-миристилоксифенил)кумарин (C_nH_m=C₁₃H₂₇, R₁=R₃=ОСН₃, R₂=H), бесцветное масло.

Найдено (%): С, 71.07; Н, 7.88. С₃₂Н₄₂О₇. Вычислено (%): С, 71.35; Н, 7.86. Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 0.87 (т, 3Н, СН₃, J=6.4); 1.26 (м, 20Н, СН₂); 1.77 (м, 2Н, С(O)СН₂СН ₂); 2.60 (т, 2Н, C(O)CH₂, J=7.4); 3.51, 3.86, 3.89 (все с, по 3Н, ОСН₃); 6.01 (с, 1Н, Н(3)); 6.23, 6.51 (оба д, по 1Н, Н(6), Н(8), J=2.4); 6.94 (м, 2Н, Н(5'), Н(2')); 7.14 (д.д., 1Н, Н(6'), J=2.2, J=6.2).

Пример 5.

5, 7-Диметокси-4-(4'-метокси-3'-пальмитоилоксифенил)кумарин (C_nH_m=С₁₅Н₃₁, R₁=R₃=ОСН₃, R₂=Н), белый твердый продукт с температурой плавления 78-79°С.

Найдено (%): С, 72.17; Н, 8.13. С₃₄Н₄₆О₇. Вычислено (%): С, 72.06; Н, 8.12. Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 0.86 (т, 3Н, СН₃, J=7.2); 1.26 (м, 24Н, СН₂); 1.73 (м, 2Н, С(O)СН₂СН ₂); 2.57 (т, 2Н, C(O)CH₂, J=7.2); 3.51, 3.86, 3.88 (все с, по 3Н, ОСН₃); 6.01 (с, 1Н, Н(3)); 6.23, 6.51 (оба д, по 1Н, Н(6), Н(8), J=2.4); 6.95 (м, 2Н, Н(5'), Н(2')); 7.13 (д.д., 1H, Н(6'), J=2.2, J=6.2).

Пример 6.

5, 7-Диметокси-4-(4'-метокси-3'-олеоилоксифенил)кумарин (C_nH_m=O₇H₃₃, R₁=R₃=ОСН₃, R₂=Н), желтое масло.

Найдено (%): С, 72.37; Н, 8.14. С₃₆Н₄₈О₇. Вычислено (%): С, 72.94; Н, 8.16. Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 0.88 (м, 3Н, СН₃); 1.28 (м, 20Н, СН₂); 1.67 (м, 2Н, С(O)СН₂СН ₂); 2.02 (м, 4Н, СН ₂СН=); 2.57 (т, 2Н, C(O)CH₂, J=7.2); 3.51, 3.86, 3.88 (все с, по 3Н, ОСН₃); 5.34 (м, 2Н, СН=СН); 6.01 (с, 1H, Н(3)); 6.23, 6.51 (оба д, по 1Н, Н(6), Н(8), J=2.4); 6.94 (м, 2Н, Н(5'), Н(2')); 7.14 (д.д., 1Н, Н(6'), J=2.2, J=6.2).

Пример 7.

5,6,7-Триметокси-4-(4'-метокси-3'-миристилоксифенил)кумарин (C_nH_m=С₁₃Н₂₇, R₁=R₂=R₃=ОСН₃), бесцветное вязкое масло.

Найдено (%): С, 70.18; Н, 7.82. С₃₃Н₄₄О₈. Вычислено (%): С, 69.69; Н, 7.80. Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 0.87 (т, 3Н, СН₃, J=6.4); 1.25 (м, 20Н, СН₂); 1.77 (м, 2Н, С(O)СН₂СН ₂); 2.62 (т, 2Н, C(O)CH₂, J=7.4); 3.27, 3.77, 3.87, 3.94 (все с, по 3Н, ОСН₃); 6.03 (с, 1Н, Н(3)); 6.75 (с, 1Н, Н(8)); 6.88 (д, 1Н, J=7.4, Н(5')); 7.06 (д, 1Н, J=2.4, Н(2')); 7.12 (д.д., 1H, J=2.4, J=7.4, Н(6')).

Пример 8.

5,6,7-Триметокси-4-(4'-метокси-3'-пальмитоилоксифенил)кумарин (C_nH_m=С₁₅Н₃₁, R₁=R₂=R₃=ОСН₃), бесцветное вязкое масло.

Найдено (%): С, 70.19; Н, 8.10. С₃₅Н₄₈О₈. Вычислено (%): С, 70.44; Н, 8.11. Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 0.86 (т, 3Н, СН₃, J=7.3); 1.27 (м, 24Н, СН₂); 1.73 (м, 2Н, С(O)СН₂СН ₂); 2.56 (т, 2Н, C(O)CH₂, J=7.3); 3.27, 3.76, 3.80, 3.94 (все с, по 3Н, ОСН₃); 6.03 (с, 1Н, Н(3)); 6.73 (с, 1Н, Н(8)); 6.84 (д, 1H, J=7.4, Н(5')); 7.05 (д, 1Н, J=2.4, Н(2')); 7.10 (д.д., 1H, J=2.4, J=7.4, Н(6')).

Пример 9.

5,6,7-Триметокси-4-(4'-метокси-3'-олеоилоксифенил)кумарин (C_nH_m=С₁₇Н₃₃, R₁=R₂=R₃=ОСН₃), желтое масло.

Найдено (%): С, 71.66; Н, 8.07. С₃₇Н₅₀О₈. Вычислено (%): С, 71.36; Н, 8.09. Спектр ЯМР ^lH (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 0.85 (м, 3Н, СН₃); 1.30 (м, 20Н, СН₂); 1.79 (м, 2Н, С(O)СН₂СН ₂); 2.03 (м, 4Н, СН ₂СН=); 2.61 (т, 2Н, C(O)CH₂, J=7.4); 3.28, 3.75, 3.84, 3.93 (все с, по 3Н, ОСН₃); 5.35 (м, 2Н, СН=СН); 6.02 (с, 1H, Н(3)); 6.70 (с, 1Н, Н(8)); 6.91 (д, 1Н, J=7.4, Н(5')); 7.11 (д, 1Н, J=2.4, Н(2')); 7.19 (д.д., 1Н, J=2.4, J=7.4, Н(6')).

Биологические испытания.

Заявляемые производные 4-арилкумаринов были испытаны с целью определения их цитотоксичности по отношению к опухолевым клеткам аденокарциномы молочной железы человека HBL100.

Клетки аденокарциномы молочной железы человека линии HBL100 культивировали при 37°С в атмосфере 4% CO₂ в среде RPMI-1640 (ICN Biomedicals Inc., США) с добавлением 0.2% NaHCO₃, 2 мМ L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина G, 100 мкг/мл стрептомицина и 10% телячьей эмбриональной сыворотки (инактивированной нагреванием), рН 7.4, и пересевали 2 раза в неделю.

Для экспериментов использовали клетки, находящиеся в логарифмической фазе роста. Клетки инкубировали 48 ч в культуральной среде в 24-луночных планшетах с различными образцами кумаринов в концентрациях 0.01-80 мкМ, добавленными в виде растворов в диметилсульфоксиде с физраствором; конечная концентрация диметилсульфоксида в среде с клетками не превышала 1 об. %. Контрольные клетки инкубировали с аликвотой физраствора с 1% диметилсульфоксида.

Количество живых клеток определяли стандартным тестом с трипановым синим. Процент живых клеток вычисляли как (количество живых клеток в эксперименте/количество живых клеток в контроле) × 100. Эксперименты проводили в двух повторах каждый. Цитотоксическую активность (IC₅₀) рассчитывали с помощью программы Origin 6.0 (MicroCal Software Inc., США).

Результаты биологических испытаний представлены в Таблице 1, отражающей цитотоксическую активность заявляемых производных 4-арилкумаринов по отношению к клеткам рака молочной железы человека HBL 100, где

- 1а - 4-(4'-Метокси-3'-миристилоксифенил)кумарин;

- 1b - 4-(4'-Метокси-3'-пальмитоилоксифенил)кумарин;

- 1с - 4-(4'-Метокси-3'-олеоилоксифенил)кумарин;

- 1d - 5,7-Диметокси-4-(4'-метокси-3'-миристилоксифенил)кумарин;

- 1е - 5,7-Диметокси-4-(4'-метокси-3'-пальмитоилоксифенил)кумарин;

- 1f - 5,7-Диметокси-4-(4'-метокси-3'-олеоилоксифенил)кумарин;

- 1g - 5,6,7-Триметокси-4-(4'-метокси-3'-миристилоксифенил)кумарин;

- 1h - 5,6,7-Триметокси-4-(4'-метокси-3'-пальмитоилоксифенил)кумарин;

- 1i - 5,6,7-Триметокси-4-(4'-метокси-3'-олеоилоксифенил)кумарин).

Таблица 1
Соединение	1а	1b	1с	1d	1е	1f	1g	1h	1i
IC50, мкМ	0.11	0.15	0.09	1.21	1.11	0.76	10.1	8.7	3.2

Приведенная таблица иллюстрирует понижение токсичности производных 4-арилкумаринов 1a-i по сравнению с 4-алкумаринами (например, J. Med. Chem. 2003, 46, 5437).

Сущность настоящего изобретения по второму аспекту заключается в предложении использовать производные 4-арилкумаринов вышеприведенной общей формулы в качестве компонента липидного бислоя липосомы, доставляющей активное вещество непосредственно к опухолевой ткани, что уменьшает общее токсическое действие заявляемого лекарственного средства на здоровые клетки.

Фосфотидилхолин и фосфотидилинозид участвуют в формировании молекулярной структуры липосомы лекарственного средства как такового. Помимо этого фосфотидилинозид выполняет также функцию, заключающуюся в предотвращении вывода лекарственного средства из кровотока иммунными клетками ретикулоэндетолиальной системы организма.

В заявляемом лекарственном средстве олигосахарид выполняет функцию молекулярного адреса, обеспечивающего селективную доставку противоопухолевого препарата непосредственно к опухолевой ткани.

Олигосахарид в совокупности с другими компонентами липосомы обеспечивает получение того технического результата, который заявлен для второго аспекта настоящего изобретения.

Выбор в качестве липидной формы олигосахарида SiaLeX-PEG-DG обусловлен сродством олигосахарида SiaLeX-PEG-DG (Sialyl Lewis X, Neu5Acα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ) со специфическими углеводсвязывающими белками эндотелиальных клеток опухолевых тканей - селектинами ((Adv Drug Deliv Rev 2004, 56, 527-549)). Короткая PEG-вставка (степень полимеризации 10) в молекуле SiaLe^X -конъюгата позволяет получать хороший контакт с рецептором-лектином на поверхности клетки.

Олигосахарид SiaLeX-PEG-DG схематически представлен на фиг.1.

Производные 4-арилкумаринов обладают улучшенной фармакокинетикой за счет мембранотропных свойств (легкости проникновения через клеточную мембрану), что значительно облегчает проникновение активного вещества лекарственного средства в опухолевые клетки.

Достоинством производных 4-арилкумаринов в лекарственном средстве также является уменьшенная цитотоксичность по сравнению с применением их в свободной, интактной, форме. Уменьшение цитотоксичности наблюдалось при испытаниях в культурах клеток in vitro, что означает меньшую неспецифическую общую токсичность в организме. В начальных экспериментах на животных производные 4-арилкумаринов показывают высокую потенциальную противоопухолевую активность.

Заявляемое липосомальное противоопухолевое средство может быть легко получено с помощью стандартных химических и биотехнологических методов, отличается стабильностью и технологичностью получения.

Для получения лекарственных средств в соответствии с настоящим изобретением используют фосфатидилхолин (PC) из яичного желтка и фосфатидилинозит (PI) из S. cerevisiae производства «Реахим» (Россия), 3-аминопропилгликозид SiaLe^X для получения SiaLe^X-PEG-DG (Glycobiology, 2009, 19, 1078-1081).

Буферные растворы с 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты готовят следующим образом:

- PBS - физиологический раствор на основе фосфатного буфера с рН 7.06 (KH₂PO₄, 0.2 г/л; NaH₂PO₄·2H₂O, 0.15 г/л; Na₂HPO₄, 1.0 г/л; KCl, 0.2 г/л; NaCl, 8.0 г/л);

- HBS - физиологический раствор на основе N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты (HEPES) с рН 7.2 (25 мМ HEPES-Na, 140 мМ NaCl).

Смеси PC/PI/производные 4-арилкумаринов/(SiaLe^X-PEG-DG) соупаривают в круглодонных пробирках из растворов в хлороформе на роторном испарителе при температуре не выше 40°С.

Для определения включения производных 4-арилкумаринов в липосомы липидные пленки высушивают 30 мин при 5 Па, затем гидратируют в течение 2 ч при комнатной температуре в 2 мл буфера PBS или HBS до получения суспензии.

Суспензию встряхивают, подвергают процедуре замораживания-оттаивания (жидкий азот -+40°С) и многократно продавливают через поликарбонатные мембранные фильтры (Nucleopore, США) с размером пор 100 нм с помощью установки Mini-extruder от Avanti Polar Lipids (США).

По данным динамического лазерного светорассеяния средний диаметр липосом 105±25 нм.

Концентрации активных веществ в суспензиях определяют после разрушения липосом многократным разбавлением в этаноле: регистрируют УФ-спектры и измеряют оптическую плотность в максимумах поглощения (производные 4-арилкумаринов:λ_макс.=307 нм, ε~10200).

Потери активных веществ на фильтрах контролируют, определяя их количество в растворах, полученных вымачиванием фильтров в этаноле, с последующей регистрацией УФ-спектров. Потери составляют не более 3-5%.

Состав липосом определяют с помощью гель-хроматографии на колонке с Сефарозой CL-4B, анализируя фракции на фосфолипидный фосфор колориметрическим методом и на активные вещества - спектрофотометрически, как описано ранее для других препаратов (Рос. нанотехнологии 2008, 3, 162-172; J. Drug. Deliv. Sci. Techn. 2009, 19, 51-59).

Производные 4-арилкумаринов практически полностью включаются в липосомы. Дисперсии липосом хранят при +4°С не более 2-х суток. Максимальная концентрация производных 4-арилкумаринов в липосомах составляет 6-8%.

Для определения цитотоксической активности заявляемого лекарственного средства клетки аденокарциномы молочной железы человека HBL100 культивировали при 37°С в атмосфере 4% CO₂ в среде RPMI-1640 (ICN Biomedicals Inc., США) с добавлением 0.2% NaHCO₃, 2 мМ L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина G, 100 мкг/мл стрептомицина и 10% телячьей эмбриональной сыворотки (инактивированной нагреванием) (Gibco BRL, Великобритания), рН 7.4, и пересевали 2 раза в неделю.

Для экспериментов были использованы клетки, находящиеся в логарифмической фазе роста. Клетки инкубировали 48 ч в культуральной среде в 24-луночных планшетах с различными образцами липосом, содержащими липидные 4-арилкумарины в концентрациях 0.5-80 мкМ. Контрольные клетки инкубировали с аликвотой PBS с 1% диметилсульфоксида.

Количество живых клеток определяли стандартным тестом с трипановым синим; процент живых клеток вычисляли как (количество живых клеток в эксперименте/ количество живых клеток в контроле) × 100.

Эксперименты проводили в двух повторах каждый. Цитотоксическую активность (IC₅₀) рассчитывали с помощью программы Origin 6.0 (MicroCal Software Inc., США).

Показано, что заявляемое лекарственное средство обладает значительной цитотоксичностью по отношению к клеткам аденокарциномы молочной железы человека HBL100. В частности, для липосом, содержащих производные 4-арилкумаринов с R₁=R₂=R₃=Н, C_nH_m=С₁₃Н₂₇; R₁=R₂=R₃=H, C_nH_m=C₁₅H₃₁ и R₁=R₂=R₃=H, C_nH_m=С₁₇Н₃₃ рассчитанные значения IC₅₀ соответствуют значениям 1.1±0.26, 2.2±0.21 и 0.79±0.17 мкМ соответственно.

Испытания противоопухолевой активности in vivo были проведены на так называемой стартовой перевиваемой модели, то есть препараты вводились на начальном этапе роста опухолей с размерами 1-2 мм (наличие опухоли выявлялось пальпированием).

Опухолевые клетки молочной железы мышей оригинальной линии Wnt-1 (Национальный институт рака (NCI), Bethesda) перевивали 40 самкам мышей сингенной линии C57BL/6 в дозе 10 клеток на мышь в жировую подушечку левой задней лапы.

Экспериментальные животные были разделены на 4 группы:

- контрольная группа мышей, которая получала буфер PBS;

- группа 1, которая получала интактный 4-арилкумарин в виде раствора PBS-5% Tween 80;

- группа 2, которая получала липосомы с производным 4-арилкумаринов без липидной формы олигосахарида;

- группа 3, которая получала лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением.

После появления пальпируемых опухолей мышам вводились вышеуказанные препараты 4-кратно с интервалом в одну неделю (в первый день, на седьмой день, на четырнадцатый день и на двадцать первый день). Контрольной группе мышей вводили по 0.2 мл буфера PBS, первой группе вводили интактный 4-арилкумарин в дозе 37 мг/кг (7 мМ) в виде раствора PBS-5% Tween 80, второй и третьей группе по 0.2 мл 2.3 мМ раствора дисперсий липосом без липидной формы олигосахарида и содержанием липидной формы олигосахарида соответственно.

Противоопухолевый эффект оценивали по торможению роста опухолей (средний диаметр опухоли) и улучшению выживания животных.

Типичные результаты, иллюстрирующие эффективность заявляемого лекарственного средства, приведены на фиг.2 и 3, соответствующих использованию производных 4-арилкумаринов формулы 4-(4'-Метокси-3'-олеоилоксифенил)кумарин. На фиг.2 представлена динамика роста опухоли по группам мышей; на фиг.3 представлены средняя продолжительность жизни (СПЖ) и процент выживших мышей к 96 дню эксперимента по группам мышей.

Наилучший результат, как в случае торможения роста опухолей (фиг.2) так и в эксперименте по выживанию мышей (фиг.3) получен в группе 3 при применении заявляемого лекарственного средства в виде активного вещества с общей формулой по п.1 формулы изобретения, включенного в липосому на основе фосфотидилхолина и фосфотидилинозита, содержащую липидную форму олигосахарида. Следует отметить, что доза активного вещества в липосомах была 3 раза меньше, чем при использовании лекарственного средства на основе интактного 4-арилкумарина, что свидетельствует о более высокой противоопухолевой активности заявляемого лекарственного средства. При более продолжительном использовании заявляемого лекарственного средства можно ожидать более высокого лечебного эффекта.

Таким образом, применение заявляемого лекарственного средства приводит к понижению системной токсичности и увеличению противоопухолевой активности заявляемого лекарственного средства.

Заявляемое лекарственное средство может быть использовано для лечения онкологических заболеваний, связанных с неоваскуляризацией новообразований. Это относится, в частности, к солидным (твердым) опухолям типа карцином и аденокарцинол молочной железы, раку легких и т.д.

Кроме того, он может применяться в терапии в сочетании с другим химиотерапевтическими препаратами, а также после хирургических операций и при облучении.

1. Производные 4-арилкумаринов общей формулы
,
где А обозначает группу

в которой C_nH_m представляет собой остатки жирных кислот предельных и непредельных рядов, при этом n представляет собой число 13, 15 или 17, m представляет собой число 27, 31 или 33, a R₁, R₂, R₃ представляют собой атомы водорода и/или метоксигруппу ОСН₃.

2. Производные 4-арилкумаринов по п.1, представляющие собой 4-(4'-метокси-3'-миристилоксифенил)кумарин.

3. Производные 4-арилкумаринов по п.1, представляющие собой 4-(4'-метокси-3'-пальмитоилоксифенил)кумарин.

4. Производные 4-арилкумаринов по п.1, представляющие собой 4-(4'-метокси-3'-олеоилоксифенил)кумарин.

5. Производные 4-арилкумаринов по п.1, представляющие собой 5,7-диметокси-4-(4'-метокси-3'-миристилоксифенил)кумарин.

6. Производные 4-арилкумаринов по п.1, представляющие собой 5,7-диметокси-4-(4'-метокси-3'-пальмитоилоксифенил)кумарин.

7. Производные 4-арилкумаринов по п.1, представляющие собой 5,7-диметокси-4-(4'-метокси-3'-олеоилоксифенил)кумарин.

8. Производные 4-арилкумаринов по п.1, представляющие собой 5,6,7-триметокси-4-(4'-метокси-3'-миристилоксифенил)кумарин.

9. Производные 4-арилкумаринов по п.1, представляющие собой 5,6,7-триметокси-4-(4'-метокси-3'-пальмитоилоксифенил)кумарин.

10. Производные 4-арилкумаринов по п.1, представляющие собой 5,6,7-триметокси-4-(4'-метокси-3'-олеоилоксифенил)кумарин.

11. Противоопухолевое лекарственное средство, содержащее активное вещество в виде производных 4-арилкумаринов, отличающееся тем, что активное вещество соответствует соединению по п.1, при этом оно включено в липосому, содержащую фосфотидилхолин, фосфотидилинозит и липидную форму олигосахарида.

12. Противоопухолевое лекарственное средство по п.11, отличающееся тем, что в качестве липидной формы олигосахарида используется SiaLe^x-PEG-DG.